Introduction
אי ספיקת לב היא תסמונת קלינית מורכבת, הסימפטומים מהם כוללים עייפות, קוצר נשימה, לממש סובלנות, והצטברות נוזלים ברקמות פריפריה. זה הוא הגורם המוביל למוות במדינות מפותחות 1. מלבד קרדיומיופתיה בירושה נגרמת על ידי מוטציות בחלבונים sarcomere או יון ערוצי 2, תפקוד שריר הלב יכולה להיגרם על ידי מגוון רחב של מצבים רפואיים, כולל יתר לחץ דם, מחלות לב מסתמית, השמנת יתר וסוכרת 3. שינויים במבנה שריר הלב, הולכה חשמלית, ועופרת מטבוליזם האנרגיה עד אפס מקום השאיבה של הלב לא מספיק לענות על דרישות הדם, אשר בסופו של דבר התוצאות אי ספיקת לב 3,4. חוקר את המנגנונים אי ספיקת לב, אם כן, הוא קריטי בתחום מחקר לב וכלי דם. זיהוי מנגנונים מולקולריים מה שמובילים להתפתחות אי ספיקת לב בסופו של דבר יכול לסייע לגילוי מטרות טיפוליות חדשניות או סמנים ביולוגיים שימושיים
היפרטרופיה שיפוץ לב מלא תפקיד קריטי בהתפתחות של אי ספיקת לב. מחלות לב יתר לחץ דם הוא גורם התורם המרכזי של היפרטרופיה לבבית ואת השיפוץ הסתגלותי לראות בחולים אנושיים 1. כדי לחקות את התנאים האנושיים הללו, במודלים של בעלי חיים מבוססים לעתים קרובות באמצעות ניתוחים. בפרט, אב העורקים הרוחביים או בטן יכול להיות מכווץ כדי להגביר את ההתנגדות נגד החדר השמאלי, אשר מוביל בסופו של דבר עומס לחץ בלב. תופעה זו בדרך כלל תוצאה היא היפרטרופיה לבבית, פיצוי פיסיולוגי של cardiomyocytes כדי לענות על הביקוש התפקודי של מערכת הלב וכלי הדם. עם זאת, הביקוש הפונקציונלי עוקף את מנגנוני פיצוי הפיסיולוגיים, שמוביל סיסטיק לב contracליקוי אריח. התכווצות העורקים רוחבי (TAC) ניתוח כרוך לעתים קרובות הליכים מסובכים, כולל פתיחת בית החזה, הנשמה מלאכותית, והפרדה של התימוס ורקמות שומן מן קשת אבי העורקים. לעומת זאת, היצרות אבי העורקים בבטן דורש ניסיוני בטכניקות פשוטות 6-8. אב העורקים בבטן, בין השמאל עורק כליות תקינות, הוא מכווץ במהלך הניתוח. היפרטרופיה שיפוץ הלב ניתן לצפות כמה שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית 6-8; הם מייצרים מחלות לב יתר לחץ דם חזק דומות לזה שנוצר על ידי הניתוח הרוחבי אב העורקים היצרות 9,10. כאן אנו מתארים פרוטוקול לנהל התכווצות אאורטלית בטנית בחולדות באמצעות שיטה יעילה, פערים לשחזור, מינימאלי פולשנית. אבי העורקים בבטן סמוך לעורקי הכליה הוא מוגבל בגלל לולאה 0.72 מ"מ נוצר על ידי חוט משי 4-0. עשרה שבועות לאחר הניתוח, היפרטרופיה לב remodelinניתן לצפות גרם. מודל החולדה של היפרטרופיה לבבית הנגרמת התכווצות אאורטלית בטנית מספק פלטפורמה ללימוד מנגנוני מחלה והפתופיזיולוגיה, כמו גם פיתוח תרופות פוטנציאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, שפורסם על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (NIH פרסום לא. 85-23, מתוקנת 1996). פרוטוקול זה אושר על ידי ובהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי ב- National טייוואן האוניברסיטה.
1. ניתוח בעלי חיים
- הכן מחט מזרק 22 G על ידי להקהות את קצה המחט על אבן השחזה. באמצעות צבת, plicate המחט לזווית ישרה.
- לפני הניתוח, להכין את מכשירי ניתוח הנדרשים וחומרים, וכן בכלוב התאוששות. חיטוי כל המכשירים ואספקה כירורגית לפני השימוש.
- לשמור על החולדות סביב 200 גרמו ולשמור אותם תחת 12 שעות אור / מחזורים כהים בטמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 ° C) עם גישה חופשית למזון ומים. לכלול לפחות 6 חולדות בכל קבוצה. להרדים את החולדות עם pentobarbital(75 מ"ג / ק"ג ב 0.5 מ"ל, IP) או סוכן אחר הרדמה המתאים. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הזנב.
הערה: היעדר רפלקס הזנב מהווה אינדיקטור הרדמה נאותה. - מניח חולדה במצב שכיבה על פלטפורמת ניתוח עם כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. לגלח את אזור הבטן של חולדה עם גוזז שיער בעלי חיים ותחליב מסיר שיער כדי למנוע זיהומים כירורגית. שפשפו את הבטן-מגולח למשעי בבטאדין או אחר מגיב טיהור לפני הניתוח.
הערה: חשוב לשמור על שדה סטרילי לאורך כל ההליך. - ביצוע חתך 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן עם אזמל. באמצעות מלח רגיל, לשמור על איברי הבטן לחות במהלך הניתוח. לעקור את אברי העיכול בזהירות לצד באמצעות כדורי צמר גפן כדי לחשוף את הווריד הנבוב הנח שנמצא באזור הצפק האחורי. זהה את אבי העורקים בבטן, השוכנת בצמוד ובדרך כלל עלהשמאלי של הווריד הנבוב הנח.
הערה: אבי העורקים בבטן הוא כלי כי פועם בזמן עם קצב הלב. - פירס הצפק עם זוג מלקחיים כדי לחשוף את הכלי מתחת. בעדינות לבודד את אבי העורקים בבטן סמוך לעורקי הכליה ומעבירה 8 ס"מ באורך 4-0 תפר משי מתחת אבי העורקים בבטן בין מקורותיה של הזכות ועורקים כליות עזב.
- הפוך קשר כפול רופף עם התפר; לעזוב לולאה בקוטר 3 מ"מ, ומניח את מחט 22 G הקהה והתכופפה בתוך הלולאה. הדקו את הקשר סביב האאורטה המחט, ולאחר מכן להוציא את המחט מיד כדי להשיג כיווץ בקוטר 0.7 מ"מ.
- סגור את חלל הבטן עם 6-0 חומר תפר נספג. לתפור את החתכים השרירים או עור עם תפרי קטע פשוט. כדי למנוע הידבקות, לשפשף את האתר כירורגית עם תמיסת יוד.
- שים החיה בזהירות עד שהוא חוזר להכרה מספקת, כפי שצוין על ידי תנועה חופשיתואת צריכת מזון. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. כדי למנוע את הכאב שלאחר הניתוח, לטפל החולדה עם פרצטמול (300 מ"ג / ק"ג ב 0.5 מ"ל, ip).
הערה חשובה: משתמשים צריכים לנהל משככי כאבים כפי שאושרו על ידי מדיניות מוסדית.
2. אוסף דוגמאות רקמות ודם
- בשעה 10 שבועות לאחר הניתוח, לשקול את העכברוש להרדים אותו עם pentobarbital (75 מ"ג / ק"ג ב 0.5 מ"ל, ip). לפני הניתוח, לאשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס זנב. מניחים את החולדה על מגש מתכת.
- ביצוע חתך 2 ס"מ לאורך קו האמצע של הצוואר באמצעות אזמל. לעקור את השרירים בזהירות עם מלקחיים כדי לחשוף את קנה הנשימה. שימו לב בזהירות לזהות את העורק הראשי, אשר במקביל קנה הנשימה לפעום בזמן עם קצב הלב.
- אסוף את הדם בעורק התרדמה לתוך צינור איסוף דם מצופה EDTA. צנטריפוגות מידהדם במשך 15 דקות XG ב 2000 ולאסוף הפלזמה. אחסן את הפלזמה בדם ב -80 ° C עד הצורך.
- ביצוע חתך 5 ס"מ באזור החזה, סביב קו האמצע של תהליך xyphoid. פירס את הסרעפת עם מלקחיים חדים. בעזרת זוג מספריים, לחתוך ולהסיר כלוב הצלעות לאורך קווי אמצע clavicular משני הצדדים כדי לחשוף את הלב. ובלו הלב בזהירות לאורך גבולות לב וכלי דם. הסר את הלב בעדינות מבלי תופס את הרקמה.
- הר לב על מנגנון זלוף Langendorff שונה על ידי קשירת המטען אבי העורקים אל המחט זלוף. Perfuse הלב עם חיץ קרבס (המכיל 110 mM NaCl, KCl 2.6 מ"מ, 1.2 מ"מ KH 2 4 PO, 1.2 4 מ"מ MgSO, 25 מ"מ NaHCO 3, ו -11 גלוקוז מ"מ [pH 7.4]) כדי לשטוף את הדם. לשקול את הלב ואת לחשב את יחס לב-משקל ל-משקל גוף. תקן את הלב עם paraformaldehyde 4% על הקרח. זכור ללבוש מסכה, מאז אדי paraformaldehyde הוא toxic.
3. רקמות פיברוזיס כימות
- הנח את רקמת הלב קבוע paraformaldehyde במכשיר חתך רקמות לחתוך 2 מ"מ חלקים עבים. מניח את סעיפי רקמות קלטת הטבעה. מייבש את רקמת דרך סדרה של אמבטיות אלכוהול מדורגים (50%, 75%, 95%, ו -100% עבור שעה 1 כל אחד).
- לחדור את הרקמה עם קסילן במשך שעה 1 ולבסוף בשעווה במשך שעה 1. הנח את הרקמה הסתננה קלטת הטבעה ולהטביע עם שעוות פרפין. אחסן את הרקמות המוטבעות בבלוקי פרפין בטמפרטורת חדר עד microtoming.
- פורס את הרקמה מוטבעת לתוך 4 חלקים עבים מיקרומטר. מניחים את הסעיפים באמבט מים 45 ºC. טובלים שקופיות זכוכית לאמבטיה מים בזווית ובהדרגה להתקרב קצוות בסעיף פרפין כדי לאפשר התקשרות חלקית לשקופית.
- להעביר את השקף פנימה וחוצה של האמבטיה כדי להסיר כיסי אוויר פוטנציאל תחת סעיף הרקמות כדי להקל מצורף טוב יותר. t יבשהוא מחליק על 37 ºC עבור שעה 1 ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר למשך מכתים היסטולוגית.
- שים את השקופית לתוך טנק. Deparaffinize השקופית עם קסילן במשך 30 דקות ולאחר רעננותם זה באלכוהול מדולל ברצף (95%, 75%, ו -50% עבור 3 דקות כל אחד) ולבסוף במים מזוקקים. השתמש פתרון picrosirius אדום מספיק לכיסוי סעיפי רקמות לחלוטין עבור שעה 1. יש לשטוף את שקופיות פתרון חומצה אצטית 0.5% עבור שני שינויים, ולאחר מכן לבצע שתי שטיפות באלכוהול מוחלט.
- האוויר יבש שקופיות ואת הר שקופית שרף סינטטי עם coverslip. צלם את השקופית בשדה האור הנראה.
הערה: האזור האדום בתצלום מראה אזור חיובי אדום picrosirius במיקרוסקופ בהגדלת 200X. חישוב האחוזים באזור החיובי האדום picrosirius מעל השטח הכולל, אשר מצביע על מידת סיסטיק 11.
4. דם Troponin כימות
- לכמת רמות טרופונין פלזמהבאמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA). Assay כל דגימה בשני עותקים. טען 50 μl של פלזמת דם 50 μl של קוקטייל נוגדנים לתוך הבארות המתאימות. חותם את הצלחת דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת ב 400 סל"ד.
הערה: טרופונין לב בפלסמה מהווה סמן בגין נזקי לב. - לשאוב את הנוזל ולשטוף היטב עם כל 250 μl של חיץ לשטוף שלוש פעמים. לאחר לשטוף האחרון, להפוך את הצלחת ואת הכתם זה נגד מגבות נייר נקיות כדי להסיר את הנוזל מוגזם.
- הוספת 100 μl של המצע tetramethylbenzidine היטב כל דגירה במשך 10 דקות בחושך על שייקר צלחת ב 400 סל"ד. הוספת 100 μl של פתרון להפסיק היטב כל אחד. לנער את הצלחת על שייקר צלחת דקות 1 לערבב. רשום את הצפיפות האופטית (OD) ב -450 nm.
הערה: ריכוז טרופונין הוא מידתי לערך OD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית, הפתולוגיה לב וכתוצאה מכך נותחה. היסטולוגיה הלב נמדדה על ידי חישוב היחס בין משקל לב למשקל הגוף על ידי גילוי כמות הקולגן בלב. פציעת לב אושרה על ידי מדידת ריכוז טרופונין לבבי פלזמה.
כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', את גודל הלב הורחב לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית, כפי שהוכח על ידי גבוה לב-משקל אל הגוף יחס משקל (איור 1B), אינדיקטור של היפרטרופיה לבבית. באמצעות מכתים אדום picrosirius, שריר לב fibrotic מוכתם תוכן קולגן מוגבר (אדום) ניתן להבחין בין אזורים רגילים (צהוב, איור 2). סיסטיק לב הוגדל לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית (תרשים 2B) לעומת ג ontrols (איור 2 א). התוצאות לתאם עם ריכוזי טרופונין פלזמה (איור 3). ריכוז טרופונין מוגבר עולה כי שיפוץ לבבי פגיעה במהלך עומס לחץ אירע. יחדיו, תוצאות היצרות אאורטלית בטנית לפציעת לב ניכרת, מסומן היפרטרופיה לבבית, שיפוץ רקמות.
איור 1:. היפרטרופיה לב במהלך עומס לחץ (א) נציג לב (B) לב-משקל ל-משקל גוף יחסים מוצגים 10 שבועות לאחר ניתוח היצרות אאורטלית בטנית. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים שבוצעו. הבדלים בין הקבוצות הוערכו על ידי מבחן t. * P <0.05 לעומת שליטה. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פיברוזיס לב במהלך עומס לחץ.
מכתים אדום Picrosirius גילה ביטוי קולגן מוגבר. (א) נציג picrosirius מכתים אדום (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר) ו- (ב) אחוז שטח fibrotic 10 שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים שבוצעו. הבדלים בין הקבוצות הוערכו על ידי מבחן t. * p <0.05 לעומת שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s / ftp_upload / 54,818 / 54818fig3.jpg "/>
איור 3: פגיעת לב במהלך עומס לחץ.
ריכוזי דם טרופונין פלזמה נמדדו 10 שבועות לאחר הניתוח היצרות אאורטלית בטנית. הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים שבוצעו. הבדלים בין הקבוצות הוערכו על ידי מבחן t. * p <0.05 לעומת שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
