Introduction
Kalp yetmezliği periferik dokularda bir yorgunluk, nefes darlığı dahil olduğu belirtileri, egzersiz intoleransı karmaşık klinik sendrom, ve sıvı tutulması olduğunu. Bu gelişmiş ülkelerde 1 önde gelen ölüm nedenidir. Kenara sarkomer protein ya da iyon kanalları 2 mutasyonlardan kaynaklanır miras kardiyomiyopati, miyokard disfonksiyonu hipertansiyon, kalp kapak hastalıkları, obezite ve diyabet 3 dahil olmak üzere tıbbi koşulları, çeşitli neden olabilir. Yetersiz kardiyak pompalama kapasitesine miyokard yapısı, elektrik iletim ve enerji metabolizması kurşun değişiklikler sonuçta kalp yetmezliği 3,4 sonuçlanır dolaşım taleplerini karşılamak için. kalp yetmezliği altında yatan mekanizmaları araştıran, bu nedenle, kardiyovasküler araştırma alanında kritik öneme sahiptir. kalp yetmezliği ilerlemesi için önde gelen moleküler mekanizmaları belirleme sonunda yeni tedavi hedefleri ya da yararlı biyomarkerların keşfi yardımcı olabilir
Kardiyak hipertrofi ve yeniden şekillenme kalp yetmezliği gelişiminde kritik bir rol oynamaktadır. Hipertansif kalp hastalığı, kalp hipertrofisi ve insan hastalarda 1 görülen uyumsuz biçimlenme anahtar bir faktör olduğunu. Bu insan koşullarını taklit etmek için, hayvan modelleri genellikle cerrahi prosedürler aracılığıyla kurulur. Özellikle, enine ya da abdominal aorta sonuçta kalbinde bir basınç yükü neden sol ventrikül karşı direncini artırmak için daraltıldığı edilebilir. Bu olgu, genellikle kardiyak hipertrofiye kardiyomiyositlerinin fizyolojik tazminat kardiyovasküler sistemin fonksiyonel talebi karşılamak için olur. Bununla birlikte, fonksiyonel talep kardiyak fibroz ve CONTRAC yol normal fizyolojik telafi edici mekanizmalar geçersizkaro bozukluğu. Enine aort daralma (TAC) cerrahi genellikle aortik arktan torakotomi, mekanik ventilasyon ve timus ayrılması ve yağ dokusu dahil karmaşık prosedürleri kapsar. Buna karşılık, abdominal aort daralma basit deneysel teknikler 6-8 gerektirir. abdominal aorta, sol ve sağ renal arter arasında, ameliyat sırasında dar olduğunu. Kardiyak hipertrofi ve yeniden şekillenme abdominal aort daralma cerrahisi 6-8 birkaç hafta sonra görülebilir; Onlar enine aort daralma cerrahisi 9,10 tarafından üretilen benzer sağlam hipertansif kalp hastalığı üretirler. Burada, etkin, yüksek tekrarlanabilir ve minimal invaziv bir yöntem kullanılarak sıçanlarda abdominal aort daralma yapmak için bir protokol açıklar. renal arterlerin bitişik abdominal aorta 4-0 ipek iplikle oluşan bir 0.72 mm döngü tarafından dar edilir. On hafta cerrahi, kalp hipertrofisi ve remodelin sonrag gözlenebilir. Abdominal aort daralma kaynaklı kalp hipertrofisi sıçan modelinde hastalık mekanizmalarını ve patofizyolojisi yanı sıra potansiyel tedavilerin gelişimini incelemek için bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için Kılavuzu (NIH yayın no. 85-23, 1996 revize) uyarınca yapılmıştır. Bu protokol ile ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak kabul edildi.
1. Hayvan Cerrahisi
- Bir honlama taş üzerinde iğne ucu köreltme ile 22 G iğne şırınga hazırlayın. pense kullanarak, bir dik açı iğne plicate.
- Ameliyattan önce, gerekli cerrahi aletler ve malzemeler, yanı sıra kurtarma kafesini hazırlamak. Kullanmadan önce tüm enstrümanları ve cerrahi malzemeleri otoklavlayın.
- 200 g etrafında fareler korumak ve yiyecek ve suya serbest erişimi olan kontrollü bir sıcaklıkta (21 ± 2 ° C) 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında tutmak. Her bir grupta en az 6 fareleri içerir. pentobarbital anestezisi fareleriveya başka bir uygun anestezik bir madde (0.5 mi, IP olarak 75 mg / kg). kuyruk refleks testi ile anestezi derinliği onaylayın.
Not: yükleme refleksinin yokluğu Yeterli anestezi bir göstergesidir. - vücut ısısını korumak için, bir ısıtma yastığı ile bir ameliyat platformunda yatar pozisyonda bir sıçan yerleştirin. Cerrahi kirlilikleri önlemek için bir hayvan saç kesme makinesi ve saç çıkarıcı losyon ile sıçan karın bölgesini tıraş. betadin veya ameliyattan önce başka temizlik reaktif ile temiz tıraşlı karın fırçalayın.
NOT: işlem boyunca steril bir alan sağlamak için önemlidir. - Bir neşter ile karın orta hat boyunca 2 cm kesi olun. serum fizyolojik kullanılması, ameliyat sırasında nemli karın organı tutmak. Posterior periton bölgede yatıyor inferior vena kava maruz pamuk topları kullanarak tarafına dikkatlice sindirim organları yerinden. genellikle bitişik ve yalan abdominal aorta, tespitinferior vena kava sol.
NOT: abdominal aort kalp hızı ile zaman içinde yanıp söner gemi. - altındaki damarları ortaya çıkarmak için forseps bir çift ile periton delin. Yavaşça renal arterlerin bitişik abdominal aorta izole ve sağ kökeni ve sol renal arterlerin arasında abdominal aorta altında 8 cm uzunluğunda 4-0 ipek sütür geçmektedir.
- sütür ile gevşek bir çift düğüm yapmak; 3 mm çaplı döngü bırakın ve döngü içinde körleşmiş ve bükülmüş 22 G iğne yerleştirin. aort ve iğne etrafında düğüm sıkın ve ardından 0,7 mm çaplı daralma elde etmek için derhal iğne çıkarılır.
- 6-0 emilebilir sütür materyali ile karın boşluğuna kapatın. Basit sütürler ile kas ya da derideki kesiler dikilmelidir. enfeksiyonu önlemek için, bir iyot tentürü ile cerrahi siteyi fırçalayın.
- yeterli bilinç kavuşur kadar serbest dolaşımı ile belirtildiği gibi, dikkatli bir şekilde hayvan gözlemlemekve gıda alımı. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için, asetaminofen (0.5 ml, 300 mg / kg, ip) ile sıçan tedavi.
NOT: kurumsal politikalar tarafından onaylanan kullanıcılar analjezikler yönetmek gerekir.
2. Doku ve Kan Örnek Toplama
- 10 hafta sonrası ameliyat at, sıçan tartmak ve (0.5 ml, ip 75 mg / kg), pentobarbital ile uyutmak. Ameliyattan önce, kuyruk refleks testi ile anestezi derinliği onaylayın. metal tepsi üzerinde sıçan yerleştirin.
- Bir neşter kullanılarak boyun orta hat boyunca 2 cm kesi olun. trakea maruz forseps ile dikkatlice kasları yerinden. trakea paralel ve kalp hızı ile zaman içinde zonklamak karotis arterler, tanımlamak için dikkatle gözlemleyin.
- EDTA ile kaplanmış bir kan toplama tüpüne karotid arterden kan toplamak. hemen santrifüj2,000 x g'de 15 dakika boyunca, kan ve plazma toplama. kadar gerekli -80 ° C kan plazması saklayın.
- xiphoid sürecin orta hat çevresinde, göğüs bölgesinde 5 cm kesi olun. Keskin forseps ile diyaframı delin. makas kullanılarak, kesme ve kalp maruz her iki tarafta orta klaviküler çizgisinde göğüs kafesini çıkarın. kalp ve damar sınırları boyunca dikkatle kalbi tüketim. doku kapma olmadan yavaşça kalp çıkarın.
- perfüzyon iğne aort gövdesini bağlayarak modifiye Langendorff perfüzyon aparatı üzerinde kalbi monte edin. Krebs tamponu ile kalbi serpmek (110 mM NaCl, 2.6 mM KCI içeren 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3 ve 11 mM glikoz [pH 7.4]) kan yıkamak için. kalbi tartılır ve kalp-ağırlık-vücut-ağırlık oranı hesaplanır. buz üzerinde% 4 paraformaldehid ile kalbi düzeltmek. paraformaldehit buhar Zehir olduğundan, bir maske takmak unutmayınic.
3. Doku Fibrozis Niceleme
- Bir doku kesit cihazda paraformaldehid sabit kalp dokusu yerleştirin ve 2 mm kalınlığında kesitler kesti. Bir gömme kasetine doku bölümleri yerleştirin. dereceli alkol banyoları (% 50,% 75,% 95, ve 1 saat için her% 100), bir dizi doku kurutmak.
- 1 saat boyunca mum içinde son olarak 1 st için ksilen doku infiltrasyonu ile. Bir gömme kasetine sızmış doku yerleştirin ve parafin mumu ile gömmek. microtoming kadar oda sıcaklığında parafine gömüldü dokuların saklayın.
- 4 mikron kalınlığında kesitler içine gömülü doku dilimleyin. 45 ºC su banyosunda bölümleri yerleştirin. bir açıyla su banyosu içine bir cam slayt batırın ve yavaş yavaş slayt kısmi eki izin parafin kesit kenarlarını yaklaşım.
- kaydırmak ve banyo dışına doku bölümünde olası hava boşluklarını kaldırmak ve daha iyi bağlanmasını kolaylaştırmak için. kuru to 1 saat 37 ºC de slaytlar ve histolojik boyama için oda sıcaklığında saklayın.
- Bir tanka slayt koyun. 30 dakika boyunca ksilen slayt Deparaffinize ve son olarak da damıtılmış su içinde ve (3 dakika her biri için% 95,% 75 ve% 50) ardışık olarak seyreltilmiş alkol içinde rehidre. Tamamen 1 saat doku bölümleri kapsayacak şekilde yeterli picrosirius kırmızı çözümü kullanın. İki değişiklikler için,% 0.5 asetik asit solüsyonu içinde slaytlar durulayın, sonra mutlak alkol eden iki durulama yapmak.
- slayt Hava kurutun ve bir lamel ile sentetik reçine slayt monte edin. Görünür ışık alanında slayt fotoğraf.
NOT: fotoğraftaki kırmızı alan 200X büyütmede mikroskop altında bir picrosirius Kırmızı pozitif bölgeyi gösterir. Fibrozis 11 kapsamını gösteren toplam alan üzerinde picrosirius Kırmızı pozitif bölgeye yüzdesini hesaplayın.
4. Kan Troponin Niceleme
- plazma troponin düzeyleri ölçmekbir enzim-bağlantılı ümmünozorbent deneme (ELISA) kullanılmıştır. iki kopya halinde her bir numune deneyi. Yük, kan plazması, 50 ul uygun kuyulara bir antikor kokteyli 50 ul. plakası kapatılır ve 400 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
NOT: plazmada Kardiyak troponin kalp yaralanması için bir göstergedir. - sıvı aspire ve yıkama tamponu 250 ul üç kez de her yıkayın. Son yıkamadan sonra, plaka ters ve aşırı sıvı kaldırmak için temiz bir kağıt havlu karşı kurulayın.
- Her kuyucuğa tetrametilbenzidin alt-tabaka 100 ul ilave edin ve 400 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde karanlıkta 10 dakika süreyle inkübe edilir. Her bir oyuğa durdurma çözeltisi 100 ul ekle. 1 dakika karıştırmak için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plakayı sallayın. 450 nm'de optik yoğunluk (OD) kaydedin.
NOT: troponin konsantrasyonu OD değeri ile orantılıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 hafta abdominal aort daralma cerrahisi sonrası ortaya çıkan kardiyak patoloji analiz edildi. Kalp histoloji vücut ağırlığına, kalp ağırlığına oranının hesaplanması ile ve kalbin kollajen miktarı tespit edilerek ölçülür. Kalp yaralanma plazma troponin konsantrasyonunun ölçülmesiyle doğrulandı.
Şekil 1A'da gösterildiği gibi, daha yüksek bir kalp ağırlık-vücut ağırlık oranı (Şekil 1B), kardiyak hipertrofi bir göstergesi ile gösterildiği gibi, kalp boyutu, karın aort daralma ameliyat sonrası genişletilmiştir. Picrosirius kırmızı boyama kullanılarak, artmış kollajen içeriği (kırmızı) ile boyanmış fibrotik Miyokard normal alanlar (sarı, Şekil 2) ayırt edilebilir. C karşılaştırıldığında kardiyak fibroz abdominal aort daralma cerrahi (Şekil 2B) sonra artmıştır Kumanda elemanları (Şekil 2A). Sonuçlar plazma troponin konsantrasyonu (Şekil 3) ile ilişkilidir. Artmış troponin konsantrasyonu basınç yükü sırasında kalp biçimlenme ve yaralanma meydana geldiğini gösterir. Birlikte ele alındığında, belirgin kardiyak yaralanma abdominal aort daralma sonuçları, kardiyak hipertrofi ve dokuların yeniden işaretlenmiş.
Şekil 1:. Basınç Aşırı sırasında kardiyak hipertrofi (A) Temsilcisi kalp ve (B) kalp-ağırlık-vücut-ağırlık oranları 10 hafta abdominal aort daralma cerrahisi sonrası gösterilmiştir. Veriler üç, altı bağımsız deneyin ortalama ± SEM temsil eder. Gruplar arasındaki farklar Student t-testi ile değerlendirildi. * P <0.05 kontrol karşısında. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Basınç Aşırı sırasında kardiyak Fibrozis.
Picrosirius kırmızı boyama artmış kollajen ekspresyonu saptandı. (A) Temsilcisi picrosirius kırmızı boyama (Ölçek çubuğu = 200 mikron) ve 10 hafta abdominal aort daralma cerrahisi sonrası fibrotik alanın (B) yüzdesi. Veriler üç, altı bağımsız deneyin ortalama ± SEM temsil eder. Gruplar arasındaki farklar Student t-testi ile değerlendirildi. * p <0.05, kontrole karşılık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
s / ftp_upload / 54.818 / 54818fig3.jpg "/>
Şekil 3: Basınç Aşırı sırasında kardiyak yaralanma.
Kan plazma troponin konsantrasyonları 10 hafta abdominal aort daralma ameliyat sonrası ölçüldü. Veriler üç, altı bağımsız deneyin ortalama ± SEM temsil eder. Gruplar arasındaki farklar Student t-testi ile değerlendirildi. * p <0.05, kontrole karşılık. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
- Towbin, J. A.
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
- van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
- Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
- Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
- Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950 (2014).
- Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634 (2014).
- Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80 (2015).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983 (2014).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259 (2016).
- Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545 (2016).
- Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
- Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
- Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).
