Summary
La glande interrénal chez le poisson zèbre est la contrepartie téléostéen de la glande surrénale chez les mammifères. Ce protocole présente comment effectuer la déshydrogénase 3-β-hydroxystéroïde (Δ 5-4 isomérase; 3β-HSD) dosage de l' activité enzymatique, qui détecte les cellules stéroïdogènes différenciées chez le poisson zèbre en développement.
Introduction
La glande surrénale, un élément crucial de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien, sécrète stéroïdes et coordonne l'homéostasie des stéroïdes et la réponse du corps au stress. La glande surrénale comprend le cortex externe, qui sécrète des stéroïdes d'une manière spécifique de la zone, et la médulla interne, qui synthétise catécholamines. La glande interrénal en téléostéens est la contrepartie de la glande surrénale chez les mammifères et est composé de cellules interrénales et chromaffines stéroïdogenèse, qui sont des équivalents fonctionnels du cortex surrénalien et de la moelle, respectivement 1-3. Des études réalisées en utilisant le modèle de poisson zèbre ont rapporté que les deux lignées de cellules chromaffines stéroïdogenèse et sont formées par des mécanismes moléculaires et cellulaires très semblables à ceux des mammifères 1,2. Par conséquent, le poisson zèbre est un modèle potentiellement puissant pour l'étude des troubles génétiques, le contrôle neuroendocrine, et la biologie des systèmes de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (interrénal).
4,5. 3β-HSD est essentiel pour la biosynthèse toutes les classes de stéroïdes hormonaux, à savoir la progestérone, les glucocorticoïdes, les minéralocorticoïdes, les androgènes et oestrogènes. Les deux 3β-HSD humaine isoenzymes HSD3B1 et HSD3B2 sont exprimés de manière différentielle 6. HSD3B1 est exprimée dans le placenta et les tissus périphériques, tandis que HSD3B2 est exprimée dans le cortex surrénal et les gonades. HSD3B1 humaine et HSD3B2 sont co-orthologues de HSD3B1 zebrafish, qui est exprimé au niveau du tissu interrénal et les gonades adultes; hsd3b2 zebrafish est un gène maternellement exprimé dont les transcriptions disparaître avant organogenèse 7. Le protocole de l'ensemble de montage 3β-HSD dosage d'activité enzymatique pour le poisson zèbre est développé en modifiant la méthode de Levy,s décrite par Milano et al. , Sur des coupes congelées de huit espèces de téléostéens 8. En raison de la perméabilité du tissu et de la transparence optique du poisson zèbre développement, l'ensemble du montage 3β-HSD histochimie peut être utilisé avec succès pour l'embryon de poisson zèbre fixe et les larves, et plus particulièrement à délimiter les tissus différenciés interrénales.
Ce dosage rapide et sensible a été appliquée à divers mutants et morphants montrent différents types de dysmorphogenèse interrénal. L'activité 3β-HSD interrénal est absent dans l'embryon , où la spécification du tissu interrénal est perturbé par un effet de choc spécifique du facteur de transcription Ff1b et diminue à mesure que la différenciation interrénal est affectée par un effet de choc de la co - régulateur Ff1b Prox1 9,10. Notamment, l'activité 3β-HSD peuvent être détectés chez des mutants présentant des défauts graves à un stade précoce, comme borgnes tête d' épingle et strabisme, où le 3β-Hsd histochimie définit la façon dont la migration cellulaire interrénal est affectée 11. La différenciation du tissu interrénal ne soit pas compromise, même en l'absence complète de sang et le système vasculaire. Par conséquent, comment les signaux de endothéliale façonnent l'organe interrénal développement peut être déterminé 12,13. Dans l'ensemble, cette analyse histochimique a été utilisé avec succès pour l'étude de la spécification, la différenciation et la migration des cellules stéroïdogènes dans le modèle de poisson zèbre. Par conséquent, il devrait être un moyen efficace et un outil fiable pour tous les écrans génétiques ou chimiques ciblant les troubles des organes surrénales et interrénales.
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Protocol
Déclaration éthique: Toutes les procédures expérimentales sur le poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Tunghai (Approbation CISR NO 101-12.) Et réalisée en conformité avec les lignes directrices approuvées.
1. Stock Solutions pour 3β-HSD activité enzymatique Coloration
- Préparer le trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)].
- Préparer l'hydrate β-nicotinamide adénine dinucléotide (1,2 mg / ml dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2).
- Préparer nicotinamide (vitamine B3, 50 mg / ml dans H 2 O).
- Préparer tétrazolium 4-nitro (50 mg / ml dans 70% de diméthylformamide).
- Aliquotes tous ces composants dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -20 ° C.
NOTE: Dans notre expérience, la congélation et la décongélation des aliquotes de toutes les solutions mentionnées ci-dessus répétées n'affectent l'intensité de l'activité 3β-HSD coloration.
2. Wtrou de montage 3β-HSD Activité Coloration
REMARQUE: L'activité enzymatique 3β-HSD est détectable dans les embryons de poisson zèbre aussi tôt que 28 heures après la fécondation (HPF) lorsqu'elles sont cultivées à 28,5 ° C, ce qui est cohérent avec l'apparition de l' expression d'ARNm de 2,7 HSD3B1. Le tout montage 3β-HSD protocole activité de coloration dans cette étude est basée sur une méthode décrite précédemment 8 et était déterminé à réussir dans le zebrafish développer jusqu'à 7 jours après la fécondation 9. Pour analyser la micro - vasculaire du tissu stéroïdogénique interrénal, l' ensemble du montage 3β-HSD coloration d' activité doit être appliquée à des lignées transgéniques exprimant une fluorescence spécifique de l' endothélium, telles que Tg (kdrl: EGFP) S843 14 et Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Pour analyser le tissu stéroïdogénique interrénal considérant le développement du rein zebrafish, l'activité 3β-HSD coloration peut être applied à la Tg (wt1b: GFP) li1 poissons 16, où la formation du glomérule et pronephrique tubules est délimitée.
- Traiter le poisson zèbre développement en les incubant à 0,03% phénylthiourée dans l'eau d'oeuf (sel de 0,06 mg / L ris dans de l'eau déminéralisée), à partir d'une étape entre 12 et 24 HPF, pour inhiber la formation de pigment.
- Fixer des embryons ou des larves dechorionated en (A) 4% de paraformaldehyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) supplémenté avec 0,1% de Tween 20 (PFAT) pendant 1 h à température ambiante (TA) ou (B) 2% PFAT pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 2 h à 4 ° C, puis 4 heures à température ambiante.
Attention: PFA est toxique par inhalation et par contact avec la peau. Il est destructeur pour la peau, les muqueuses, les yeux et les voies respiratoires supérieures. - Laver l'embryon 4x pendant 10 min avec du PBS additionné de 0,1% de Tween 20 (PBST) à température ambiante.
NOTE: Il est essentiel de ne pas sécher les échantillons tout en changeant les solutions de lavage. - Fraîchement préparer la staining solution avant que les réactions (tableau 1). Préparer, vortex, et des pièces de centrifugeuse A et B dans des tubes séparés.
REMARQUE: l'ajout de tous les composants directement dans un seul tube provoquerait une forte précipitation. - Ajouter la solution complète de la partie A à la solution complète de la partie B, bien mélanger pour préparer la solution de coloration, et distribuer immédiatement 1 ml dans chaque tube microfuge contenant des embryons fixes et lavés.
- Enveloppez microtubes de papier d'aluminium pour les protéger de la lumière et le lieu soit sur un rotateur ou une plate-forme à bascule pour agitation douce à température ambiante.
- Déterminer empiriquement le temps de réaction en surveillant les signaux chromogéniques par microscopie. De légères précipitations vont se développer au fil du temps; cependant, ils ne vont pas interférer avec le processus réactionnel.
NOTE: Pour les embryons fixés à 28 HPF, coloration à 25 ° C pendant 4 heures génère un signal clair au niveau du tissu interrénal. - Arrêter la réaction par lavage 4x pendant 10 minutes dans du PBST. jef aucune autre immunohistochimique (IHC) analyse est nécessaire, après la fixation des embryons colorés avec 4% PFAT pendant 60 min à température ambiante. Sinon, stocker les embryons lavés à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
- Pour la microscopie toute monture, effacer les tachés, post-fixes, et lavé les embryons avec 50% de glycérol dans du PBS, les orienter avec la face dorsale vers le haut sur une lame, et d'observer à l'aide d'un microscope droit sous un éclairage de champ lumineux.
NOTE: Pour faire une image à haute résolution de la morphologie des tissus interrénal, l'analyse de l'embryon 3β-HSD activité tachés et deyolked plat de montage est recommandé. Comme le tissu stéroïdogénique interrénal est positionné juste au- dessus de la vésicule ombilicale, une analyse ventrale plate-montage du tissu interrénal permet une observation directe et claire de la morphologie interrénal 17.
3. IHC Analyse des 3β-HSD Embryons Activité tachés
NOTE: Pour l'analyse du microenvironnement vasculaire du steroitissus dogenic, les embryons d'activité tachés 3β-HSD avec un rapporteur fluorescent spécifique de l' endothélium transgénique sont soumis transversaux vibratome tronçonnage et après analyse IHC 12,18.
- Post-fixation
- Post fixer les embryons 3β-HSD activité colorées et lavées avec 2% de PFA supplémenté avec 1% de Triton X-100 pendant 1 heure à 4 ° C et laver 4 x 10 min dans du PBS contenant 1% de Triton X-100 (PBSTx) à la température ambiante.
- Incorporation
- Préparer 4% à faible point de fusion d'agarose par dissolution de l'agarose dans du PBS à 95 ° C, aliquote dans des tubes de microcentrifugation, et stocker à 4-8 ° C.
- Faire fondre une partie aliquote de 4% à faible point de fusion d'agarose à 70 ° C pendant 10 min, puis maintenir la partie aliquote à 47 ° C. Incluez chaque embryon en fusion 4% à faible point de fusion d'agarose dans un bouchon détaché d'un tube de 1,5 ml qui sert de moule et laisser refroidir jusqu'à ce que solide.
- vibratome sectionnement
- Collez un morceau de ruban de papier à la p seclatform du vibratome.
- Retirer le bloc d'agarose durci du moule par une lame de rasoir. Appliquer superglue sur la bande de papier sur la plate-forme, et fixer le bloc d'agarose sur la bande de papier, avec la face antérieure de l'échantillon vers le haut. Couper le bloc d'agarose à une forme trapézoïdale prisme, à environ 4 mm et 8 mm de chaque côté des facettes supérieures et inférieures, respectivement.
- Rincer le bloc d'agarose contenant l'échantillon avec du PBS froid complémenté avec 0,5% de Triton X-100 (0,5% PBSTx) à l'aide d'un compte-gouttes.
- Trancher le bloc d'agarose dans 100 um sections selon le manuel d'instructions du vibratome. rincez constamment le bloc d'agarose pour éviter le dessèchement. Comme chaque tranche est coupée, retirez-le du vibratome en utilisant une aiguille G 26 de la seringue, et transférer sur une plaque de tache contenant froid 0,5% PBSTx (500 pl / puits).
- Recueillir des coupes de tissus d'activité positive les 3ß-HSD en vérifiant sous un microscope de dissection, et transférer les sections par un pipointe pette avec son extrémité de coupure (environ 1 mm de diamètre intérieur à l'ouverture) dans une plaque de 96 puits contenant froid 0,5% PBSTx (150 pl / puits). Les échantillons de tissu se dissocient généralement à partir du bloc d'agarose après cette étape.
- Perméabilisation et laver
- Laver les tranches 6x pendant 15 min dans 0,5% PBSTx à la température ambiante, 10 minutes dans du PBS, et 4x pendant 10 min dans du PBS additionné de 1% de sérum albumine bovine / 1% de DMSO / 0,1% de Triton X-100 (PBDTx).
- Blocage
- Incuber les tranches pendant 1 heure à 2% de sérum de foetus de veau (FCS) dans PBDTx à température ambiante.
- Réaction d'anticorps primaire
- Incuber les tranches pendant 1,5 jours dans PBDTx contenant un anticorps primaire (par exemple polyclonal de lapin anti- fibronectine humaine et de souris anti-humain kinase d' adhésion focale) à 4 ° C.
- La lessive
- Laver les tranches 6x pendant 10 min dans PBDTx à la température ambiante.
- Blocage
- Incuber les tranches pendant 1 heure dans 2% de FCS dans PBDTx à la température ambiante.
- Réaction d'anticorps secondaire
- Incuber les tranches pendant 1,5 jours dans PBDTx contenant un anticorps secondaire (fluorophore conjugué de chèvre anti-lapin ou anti-IgG de souris) à 4 ° C.
- La lessive
- Laver les tranches 6x pendant 10 min à température ambiante dans PBDTx et 4x pendant 10 minutes dans du PBST à température ambiante.
NOTE: Pour une analyse microscopique confocale, effacer les échantillons avec 50% de glycérol dans du PBS.
- Laver les tranches 6x pendant 10 min à température ambiante dans PBDTx et 4x pendant 10 minutes dans du PBST à température ambiante.
4. confocale Analyse
- Observer l'ensemble embryon de montage et la section par un microscope confocal équipé de 10X / 20X et 0,5 / 0,75 objectif.
- Pour la détection simultanée de la fluorescence et la coloration 3β-HSD, régler le mode multipiste comme suit: 488 nm laser à l'argon et 505-530 nm filtre passe-bande pour la détection de la GFP; 543 nm laser hélium-néon et 560-615 nm filtre passe-bande pour la détection de mCherry; et transmis canal de lumière pour la détection de la 3β-HSD coloration.La taille sténopé est 1 unité Airey, et la résolution est de 1024 x 1024 pixels.
- Assembler les z piles (avec 6 intervalle de um) comme une projection 3D, et de fusionner la projection et le champ lumineux, en utilisant le logiciel intégré confocal.
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Representative Results
Pour déterminer comment les codevelops de tissus interrénales stéroïdogènes avec le glomérule du rein pronephrique et son vascularisation naissante, le dosage de l' activité enzymatique 3β-HSD a été réalisée sur la double transgénique Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryon à 34 HPF (figure 1). A ce stade, le tissu stéroïdogénique activité positive 3β-HSD est situé juste à la ligne médiane et caudale immédiatement au rein glomérule pronephrique, alors que certaines cellules stéroïdogènes commencent la migration à travers la ligne médiane et forment un bord saillant de la vue dorsale. Le tissu stéroïdogénique est étroitement associée à l'aorte dorsale (DA) et la veine cardinale postérieure (RGC).
Le enzymatique dosage de l' activité 3β-HSD sur Tg (kdrl: GFP) S843 embryons a permis une délimitation claire des vaisseaux péri-interrénales, y compris la DA, l' hématocrite, Et le navire interrénal (IRV; Figure 2). Vibratome sections des embryons d'activité teinté 3β-HSD ont été soumis à une analyse IHC pour détecter la protéine de la matrice extracellulaire, la fibronectine et son effecteur en aval phosphorylée Focal Adhesion Kinase. Le dépôt péri-DA de fibronectine est essentielle pour soutenir la croissance IRV 18.
Figure 1: Toute monture activité 3β-HSD coloration effectuée sur le poisson zèbre exprimant reporters fluorescents. Dorsale (panneaux de gauche) et dorsolatéral (panneaux de droite) vues d'un 3β-HSD activité tachés Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryon à 34 HPF, qui permet de visualiser la distribution spatiale relative du interrénal tissus (IR), glomérule pronephrique (PG), tubules pronephrique (PT), aorte dorsale (DA), latéral dorsalaorte (LDA), et postérieure veine cardinale (PCV). En raison de l'emplacement du tissu interrénal à ce stade, les vues sont dorsolatérales depuis le côté droit de l'embryon. D, dorsale; V, ventral; A, antérieure; P, postérieure; R, à droite; L, à gauche. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Vibratome sectionner et de l' analyse IHC de Tg 3β-HSD activité tachés (kdrl: GFP) S843 embryons. L'embryon de 34 HPF a été soumis à un essai d'activité enzymatique 3β-HSD et vibratome sectionnement. La section 3β-HSD activité positive a été colorée en double IHC avec le lapin anti-fibronectine humaine (Fn; 1/200) et de la souris anti-humaine phosphorylée kinase d'adhésion focale (pFak; pY397, 1/100). La section transversale montre la répartition relative du tissu interrénal (IR) et de ses vaisseaux voisins, y compris l'aorte dorsale (DA), postérieure veine cardinale (IRV), et le cardinal postérieur veine (PCV). NT, tube neural; NC, notocorde; S, somites. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| concentration en Stock | En 1000 pi | La concentration finale | |
| Partie A. | |||
| DMSO | 40 ul | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 ul | 0,1 mg / ml |
| NAD | 1,2 mg / ml | 10 ul | 12 pg / ml |
| Partie B. | |||
| PBST | 936 pi | ||
| la vitamine B3 | 50 mg / ml | 2 ul | 0,1 mg / ml |
| NBT | 50 mg / ml | 2 ul | 0,1 mg / ml |
Tableau 1: Composants de la réaction de coloration 3β-HSD.
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Discussion
L'intensité du signal de l'activité 3β-HSD a augmenté au cours de la réaction. Des signaux clairs de l'activité 3β-HSD ont été détectées après 4 heures de réaction pour les étapes à partir de 28 HPF en avant. Toutefois, la durée de la réaction nécessite la détermination empirique, en fonction du but de l'essai. Dans le cas où la coloration nécessite un traitement pendant une nuit, un fond légèrement bleutée tend à se développer sur les échantillons. Ce problème peut être surmonté en augmentant la durée de fixation (par exemple 4 h à 4% PFAT à TA) avant la coloration d' activité 3β-HSD. En revanche, overfixation, comme la fixation pour la nuit avec 4% PFAT à la température ambiante, conduit à un arrière-plan très clair. Cependant, plus de temps serait nécessaire pour obtenir une intensité souhaitable du signal. Nous avons remarqué que la fixation des échantillons pendant une nuit avec 2% au lieu de 4% PFAT avant l'activité 3β-HSD coloration donne généralement des résultats plus souhaitables dans une observation ultérieure reporter fluorescent ou Ianalyse des HC. Cependant, fixant les embryons avec 4% PFAT permet une analyse rapide de l'activité 3β-HSD (complété en 1 jour) et bénéficierait donc des écrans génétiques ou chimiques ciblant les tissus stéroïdogènes interrénales.
Post-fixant les embryons après une activité 3β-HSD coloration est essentielle parce que des quantités infimes de composants chimiques ont tendance à persister dans les échantillons colorés, même après un lavage extensif et se traduirait par un bruit de fond après une durée de stockage à long. Toutefois, si les embryons d'activité tachés 3β-HSD sont à être soumis à poursuivre l'analyse IHC, le stockage de l'activité tachés 3β-HSD et lavé les embryons à 4 ° C pendant la nuit ne se traduit pas par une amélioration notable de l'arrière-plan.
L'hybridation in situ (ISH) analyse des 3β-HSD embryons d'activité tachée est possible. Par exemple, l'expression des transcrits d'PROX1 est colocalisé avec l'activité 3β-HSD au steroidogenic tissu 10. Pour effectuer 3β-HSD coloration d'activité en plus ISH, les embryons doivent être fixés dans 4% PFAT pendant 4 heures à la fois avant et après l'essai d'activité 3β-HSD de telle sorte que des transcrits d'ARN cellulaires peuvent être conservés avec une qualité désirable pour l'analyse ISH.
Analyse ISH en utilisant des ribosondes de ff1b, CYP11A1, hsdb1 et étoiles ont été appliquées dans les études sur le développement du 1,2,11 tissulaire stéroïdogénique interrénal. La ribosonde de ff1b détecte les cellules interrénales primordiales par 22 HPF, tandis que celles de CYP11A1 et étoiles détecter la différenciation des cellules interrénales par 24 HPF. Par rapport à 3β-HSD coloration histochimique qui ne détecte que des tissus différenciés à partir interrénales 28 partir HPF, l'analyse ISH peut être utilisé pour analyser un spectre de gènes interrénales spécifique dans les cellules primordiales interrénales et différenciées. Néanmoins, 3β-HSD coloration histochimique has l'avantage d'être simple, rapide et fiable pour l'analyse du phénotype du tissu interrénal stéroïdogénique différenciée, et est donc un outil puissant pour les études de développement détaillées ainsi que des écrans génétiques ou chimiques à grande échelle. Selon notre examen de la documentation pertinente, il existe pas d'anticorps spécifique qui peut détecter de manière fiable l'expression de la protéine au niveau du tissu interrénal stéroïdogénique par immunohistochimie. Par conséquent, le procédé de coloration histochimique 3β-HSD est particulièrement utile pour délimiter le tissu et la morphologie cellulaire du tissu interrénal stéroïdogénique.
Bien que la 3β-HSD coloration histochimique est utile pour la visualisation du tissu différencié interrénal stéroïdogénique, il ne relève pas directement la capacité de synthèse des stéroïdes ou la fonctionnalité des cellules interrénales. Les mutations affectant les enzymes ou des produits chimiques en amont ou en aval de la 3β-HSD dans la synthèse en cascade stéroïdogénique ne peutnécessairement être détectée par ce procédé est décrit, étant donné qu'ils peuvent ou peuvent ne pas perturber ni la taille ou de la morphologie du tissu interrénal. Par conséquent, les utilisateurs de ce protocole devraient garder à l'esprit que certaines déficiences enzymatiques affectant la fonction mais pas la morphologie du tissu interrénal ne peuvent pas être facilement détectée par cette méthode.
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Acknowledgments
Nous remercions Prof. Christoph Englert et le Professeur Didier Stainier pour les dons de la Tg (wt1b: GFP) li1 et Tg (kdrl: EGFP) S843 souches, respectivement, et la facilité de Taiwan Zebrafish de base pour fournir Tg (kdrl: mCherry) CI5. Cette étude a été soutenue par des subventions du ministère de Taiwan de la science et de la technologie (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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