Summary
A glândula interrenal no peixe-zebra é a contrapartida teleósteos da glândula supra-renal de mamífero. Este protocolo apresenta a forma de realizar a desidrogenase de 3-hidroxiesteróides β (Δ 5-4 isomerase; 3β-HSD) ensaio da actividade enzimática, que detecta as células diferenciadas esteroidogênicas no peixe-zebra desenvolvimento.
Introduction
A glândula adrenal, um componente crucial do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, segrega esteróides e coordena a homeostase esteróides e na resposta do organismo ao estresse. A glândula adrenal compreende o córtex exterior, que segrega esteróides de um modo específico da zona, e medula interna, que sintetiza catecolaminas. A glândula interrenal em teleósteos é o homólogo da glândula supra-renal em mamíferos e é composto de células cromafins e interrenais esteroidogênicas, que são equivalentes funcionais do córtex adrenal e medula, respectivamente 1-3. Estudos realizados utilizando o modelo de peixe-zebra têm relatado que ambas as linhagens celulares esteroidogênicas e cromafins são formados por mecanismos moleculares e celulares altamente semelhantes aos mamíferos em 1,2. Por isso, o peixe-zebra é um modelo potencialmente poderosa para o estudo de doenças genéticas, controlo neuroendócrino, e sistemas de biologia do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (interrenal).
4,5. 3β-HSD é essencial para biosynthesizing todas as classes de esteróides hormonais, nomeadamente progesterona, glucocorticóides, mineralocorticóides, androgénios, estrogénios e. Os dois humana 3β-HSD isozimas HSD3B1 e HSD3B2 são diferencialmente expressos 6. HSD3B1 é expressa na placenta e nos tecidos periféricos, enquanto que HSD3B2 é expresso no córtex adrenal e das gónadas. HSD3B1 humano e HSD3B2 são co-ortólogos de hsd3b1 peixe-zebra, que é expressa no tecido interrenal e gónadas adultos; HSD3B2 peixe-zebra é um gene maternalmente expressa cuja transcrições desaparecer antes organogênese 7. O protocolo do ensaio de actividade de toda a montagem 3β-HSD enzimática para peixe-zebra foi desenvolvido através da modificação do método Levy,s descritas por Milano et al. , Em cortes congelados de oito espécies de teleósteos 8. Devido à permeabilidade dos tecidos e a transparência óptica do peixe-zebra desenvolvimento, todo-montagem 3β-HSD histoquímica pode ser usada com sucesso para o embrião do peixe-zebra fixa e larvas e especificamente delinear os tecidos interrenais diferenciadas.
Este ensaio sensível e rápida foi aplicado a vários mutantes e morphants demonstrando diferentes tipos de dysmorphogenesis interrenal. A actividade 3β-HSD interrenal está ausente no embrião quando as especificações do tecido interrenal é interrompida através de um knockdown específica do factor de transcrição Ff1b e diminui à medida que a diferenciação interrenal é afectada por um knockdown da coregulator Ff1b Prox1 9,10. Notavelmente, a actividade 3β-HSD pode ser detectada em mutantes com defeitos graves da fase inicial, tais como uma cabeça de alfinete e de olhos estrabismo, onde o 3β-HSD histoquímica delineia como a migração celular é afectada interrenal 11. A diferenciação do tecido interrenal não é comprometida, mesmo na ausência total de sangue e vasculatura. Portanto, como os sinais derivados do endotélio moldar o órgão interrenal em desenvolvimento pode ser determinado 12,13. Em geral, este ensaio histoquímico foi usado com êxito para estudar especificação, diferenciação e migração de células esteroidogénicas no modelo de peixe-zebra. Portanto, ele deve ser um eficiente e uma ferramenta confiável para as telas genéticos ou químicos visando as disfunções dos órgãos supra-renais e interrenais.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os procedimentos experimentais no peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade Tunghai (Aprovação IRB NO 101-12.) E realizado em conformidade com as orientações aprovadas.
1. As soluções de reserva para 3β-HSD Actividade Enzimática A coloração
- Prepare trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO)].
- Prepare β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (1,2 mg / ml em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2).
- Prepare a nicotinamida (vitamina B3, 50 mg / ml em H2O).
- Prepare de tetrazólio azul nitro-4 (50 mg / ml em 70% de dimetilformamida).
- Alíquotas todos esses componentes em tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
NOTA: Em nossa experiência, ciclos repetidos de congelamento e descongelamento das alíquotas de todas as soluções acima mencionadas não afectam a intensidade da coloração de atividade 3β-HSD.
2. Whole-montagem 3β-HSD Atividade Coloração
NOTA: A actividade enzimática 3β-HSD é detectável nos embriões de peixe-zebra tão cedo quanto 28 horas após a fertilização (HPF) quando cultivadas a 28,5 ° C, o que é consistente com o aparecimento da expressão de ARNm de hsd3b1 2,7. O protocolo de toda a montagem de coloração de actividade 3β-HSD neste estudo baseia-se num método anteriormente descrito 8 e determinou-se ser bem sucedido no peixe-zebra desenvolver até 7 dias após a fertilização 9. Para analisar o microambiente vascular do tecido esteroidogênica interrenal, conjunto de montagem 3β-HSD de coloração de actividade deve ser aplicado às linhas transgénicas expressando fluorescência específica do endotélio, tal como TG (kdrl: EGFP) s843 14 e Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Para analisar o tecido esteroidogênica interrenal considerando o desenvolvimento do rim zebrafish, atividade 3β-HSD coloração pode ser apliEd à Tg (wt1b: GFP) LI1 peixe 16, onde a formação do glomérulo e pronephric túbulos é delineado.
- Tratar o peixe-zebra desenvolvimento, incubando-as em 0,03% em água feniltioureia ovo (sal de 0,06 mg / L de recife em água desionizada), a partir de uma fase de entre 12 e 24 hpf, para inibir a formação de pigmentos.
- Fix embriões dechorionated ou larvas em (a) 4% de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com 0,1% de Tween 20 (PFAT) durante 1 h à temperatura ambiente (TA) ou (B) 2% PFAT durante a noite a 4 ° C ou durante 2 horas a 4 ° C, seguido por 4 horas à temperatura ambiente.
Cuidado: PFA é tóxico por inalação e em contacto com a pele. É destrutivo para a pele, membranas mucosas, olhos, e tracto respiratório superior. - Lava-se a embriões 4x durante 10 min com PBS suplementado com 0,1% de Tween 20 (PBST) a TA.
NOTA: É crítico para não secar as amostras ao alterar as soluções de lavagem. - Recém preparar o staining solução antes das reacções (Tabela 1). Prepare, vortex, centrifugação e partes A e B, em tubos separados.
NOTA: A adição de todos os componentes em linha reta em um único tubo iria causar precipitação grave. - Adicionar toda a solução da Parte A para toda a solução da Parte B, misturar bem para preparar a solução de coloração, e distribuir imediatamente 1 ml em cada tubo de microcentrífuga contendo embriões fixados e lavadas.
- Enrole tubos de microcentrífuga com folha de alumínio para proteger da luz e o local de cada um rotor ou de uma plataforma de agitação para agitação suave à temperatura ambiente.
- Empiricamente determinar o tempo de reação, monitorando sinais cromogénicos por meio de microscopia. precipitações leves irão desenvolver ao longo do tempo; No entanto, eles não irão interferir com o processo de reacção.
NOTA: Para os embriões fixada em 28 hpf, a coloração, a 25 ° C durante 4 h gera um sinal claro no tecido interrenal. - Parar a reacção através de lavagem 4 x durante 10 minutos em PBST. EuF mais nenhuma análise imuno-histoquimica (IHC) é necessário, pós-corrigir os embriões corados com 4% PFAT durante 60 min à TA. Caso contrário, armazenar os embriões foram lavados a 4 ° C até uso posterior.
- Para a microscopia todo-mount, limpar os embriões corados, pós-fixados, e lavado com 50% de glicerol em PBS, orientá-los com o lado dorsal para cima em um slide, e observar com um microscópio vertical sob iluminação de campo claro.
NOTA: Para fazer uma imagem de alta resolução da morfologia do tecido interrenal, a análise do embrião 3β-HSD atividade-coradas e deyolked plana de montagem é recomendada. Como o tecido esteroidogênica interrenal está posicionado logo acima do saco vitelino, uma análise ventral plano de montagem do tecido interrenal permite uma observação direta e clara da morfologia interrenal 17.
3. IHC Análise de 3β-HSD Embriões manchado de Atividade
NOTA: Para analisar o microambiente vascular do steroitecido dogenic, os embriões manchado de atividade 3β-HSD com um repórter fluorescente específica do endotélio transgênicos são submetidos a deslocamentos vibratome seccionamento e subsequente análise IHC 12,18.
- Pós-fixação
- Pós-corrigir os embriões 3β-HSD actividade coradas e lavou-se com 2% de PFA suplementado com 1% de Triton X-100 durante 1 hora a 4 ° C e lavar 4x durante 10 min em PBS contendo 1% de Triton X-100 (PBSTx) à TA.
- Incorporação
- Prepare a 4% de agarose de baixo ponto de fusão dissolvendo o de agarose em PBS a 95 ° C, em tubos de microcentrífuga alíquota, e armazenar a 4-8 ° C.
- Derreter-se uma alíquota de 4% de agarose de baixo ponto de fusão a 70 ° C durante 10 min, e em seguida manter a aliquota a 47 ° C. Incorporar cada embrião no fundido de 4% de agarose de baixo ponto de fusão em um tampão individual de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, que serve como um molde, e deixa-se arrefecer até solidificar.
- vibratome Seccionamento
- Cole um pedaço de fita de papel para a p secolatform de vibratome.
- Remover o bloco de agarose endurecida do molde por uma lâmina de barbear. Aplicar supercola para a fita de papel na plataforma, e fixar o bloco de agarose na fita de papel, com o lado anterior da amostra virada para cima. Aparar o bloco de agarose a uma forma de prisma trapezoidal, com aproximadamente 4 mm e de 8 mm em cada lado das facetas superiores e inferiores, respectivamente.
- Lavar o bloco de agarose contendo amostra com PBS frio suplementado com 0,5% de Triton X-100 (0,5% PBSTx), utilizando um conta-gotas.
- Corte o bloco de agarose em 100 mm seções de acordo com o manual de instruções do vibratome. Constantemente lavar o bloco de agarose para evitar a secagem. À medida que cada fatia é cortada, removê-lo a partir da vibratome usando uma agulha G 26 da seringa, e transferir para uma placa de ponto frio contendo 0,5% PBSTx (500 ul / poço).
- Recolher as secções de tecido de atividade positivos 3p-HSD, verificando sob um microscópio de dissecação, e transferir as seções por um piponta pette com a sua extremidade de corte (cerca de 1 mm de diâmetro interior na abertura) numa placa de 96 poços contendo 0,5% frio PBSTx (150 ul / poço). As amostras de tecido geralmente dissociar-se do bloco de agarose após este passo.
- Permeabilização e Lavagem
- Lavam-se as fatias 6x durante 15 min em 0,5% PBSTx à TA, 10 min em PBS, e 4x durante 10 minutos em PBS suplementado com 1% de albumina de soro de bovino / 1% de DMSO / 0,1% de Triton X-100 (PBDTx).
- Bloqueio
- Incubam-se as fatias para o soro 1 h em 2% de vitelo fetal (FCS) em PBDTx à TA.
- Anticorpo primário
- Incubam-se as fatias durante 1,5 dias em PBDTx contendo um anticorpo primário (por exemplo, policlonal de coelho anti-fibronectina humana e de ratinho anti-humano quinase de adesão focal), a 4 ° C.
- Lavando
- Lavam-se as fatias 6x durante 10 min em PBDTx à TA.
- Bloqueio
- Incubam-se as fatias durante 1 h em 2% de FCS em PBDTx à TA.
- Anticorpo secundário
- Incubam-se as fatias para 1,5 dias em PBDTx contendo um anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho conjugada com fluoróforo ou anti-IgG de ratinho) a 4 ° C.
- Lavando
- Lavam-se as fatias 6x durante 10 min em PBDTx à TA e 4x durante 10 min em PBST à TA.
NOTA: Para a análise microscópica confocal, limpar as amostras com 50% de glicerol em PBS.
- Lavam-se as fatias 6x durante 10 min em PBDTx à TA e 4x durante 10 min em PBST à TA.
4. Análise confocal
- Observe todo o embrião montagem ea seção por um microscópio confocal equipado com 10X / 0.5 e 20X / 0,75 lente objetiva.
- Para a detecção simultânea da fluorescência e da coloração 3β-HSD, definir o modo de multicanal como se segue: 488 nm do laser de árgon e 505-530 nm, filtro de banda para a detecção de GFP; 543 nm do laser de Hélio-Néon e 560-615 nm, filtro de banda para a detecção de mCherry; e transmitida canal de luz para a detecção de coloração 3β-HSD.O tamanho pinhole é uma unidade Airey, ea resolução é de 1024 x 1024 pixel.
- Montar as pilhas Z (com 6 intervalo mm) como uma projeção em 3D, e fundir a projeção e o campo brilhante, usando o built-in software confocal.
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Representative Results
Para determinar como as esteroidogênicas codevelops tecido interrenais com o glomérulo renal pronephric e sua vasculatura nascente, o ensaio de actividade enzimática 3β-HSD foi realizada na dupla transgénico Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embrião em 34 HPF (Figura 1). Nesta fase, o tecido esteroidogênica actividade positiva 3β-HSD está localizado à direita da linha média e caudal imediatamente para o glomérulo renal pronephric, enquanto algumas células esteroidogénicas iniciar a migração através da linha média e formar um bordo saliente a partir da vista dorsal. O tecido esteroidogênica está intimamente associada com a aorta dorsal (DA) e veia cardinal posterior (PCV).
O ensaio de actividade enzimática 3β-HSD na Tg (kdrl: GFP) s843 embriões permitiu uma definição clara dos vasos peri-interrenais, incluindo a DA, PCVE um recipiente interrenal (IRV; Figura 2). Vibratome secções dos embriões corados de actividade 3β-HSD foram submetidos a análise de IHC para detectar a proteína da matriz extracelular fibronectina e sua efector a jusante fosforilada quinase de adesão focal. A deposição peri-DA de fibronectina é essencial para apoiar o crescimento IRV 18.
Figura 1: Todo-mount coloração de atividade 3β-HSD realizada em peixes-zebra expressar repórteres fluorescentes. Dorsal (da esquerda painéis) e dorsolateral (painéis da direita) vistas de um manchada de atividade Tg 3β-HSD (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) embrião CI5 aos 34 hpf, que permite visualizar a distribuição espacial relativa do interrenal tecido (IV), glomérulo pronephric (PG), túbulos pronephric (PT), aorta dorsal (DA), a lateral dorsalveia aorta (LDA), e posterior cardinal (PCV). Devido à localização do tecido interrenal nesta fase, os pontos de vista são dorsolateral do lado direito do embrião. D, dorsal; V, ventral; Um, anterior; P, posterior; R, direita; G, para a esquerda. Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Vibratome seccionamento e análise IHC da Tg 3β-HSD atividade-manchado (kdrl: GFP) s843 embriões. O embrião-34 HPF foi submetido a um ensaio de actividade enzimática 3β-HSD e, em seguida, vibratome seccionamento. A seção de 3β-HSD atividade positiva foi corado com um duplo IHC com coelho fibronectina anti-humana (FN; 1/200) e rato anti-humana fosforilada quinase de adesão focal (pFak; pY397, 1/100). A seção transversal mostra a distribuição relativa do tecido interrenal (IR) e de seus vasos vizinhos, incluindo a aorta dorsal (DA), posterior veia cardinal (IRV), e veia posterior cardinal (PCV). NT, tubo neural; NC, notocorda; S, somite. Barra de escala = 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| da concentração | Em 1000 ul | A concentração final | |
| Parte A. | |||
| DMSO | 40 ul | ||
| DHEA | 10 mg / ml | 10 ul | 0,1 mg / mL |
| NAD | 1,2 mg / mL | 10 ul | 12 ug / ml |
| Parte B. | |||
| PBST | 936 ul | ||
| vitamina B3 | 50 mg / ml | 2 ul | 0,1 mg / mL |
| NBT | 50 mg / ml | 2 ul | 0,1 mg / mL |
Tabela 1: Componentes da reacção de coloração 3β-HSD.
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Discussion
A intensidade do sinal da actividade 3β-HSD aumentado ao longo do curso de reacção. Sinais claros de actividade 3β-HSD foram detectados após 4 horas de reacção para as fases de 28 HPF em diante. No entanto, a duração da reacção requer a determinação empírica, dependendo do objetivo do ensaio. Nos casos em que a coloração requer processamento durante a noite, um fundo ligeiramente azulado tende a desenvolver sobre as amostras. Este problema pode ser ultrapassado pelo aumento da duração de fixação (por exemplo, 4 horas em 4% PFAT à TA) antes da coloração de actividade 3β-HSD. Por contraste, com excessiva, tais como a fixação durante a noite com 4% PFAT à TA, conduz a um fundo extremamente clara. No entanto, mais tempo será necessário para obter uma intensidade de sinal desejável. Percebemos que fixa as amostras durante a noite com 2% em vez de 4% PFAT antes da coloração atividade 3β-HSD normalmente produz resultados mais desejáveis em uma observação repórter fluorescente subsequente ou Ianálise de HC. No entanto, que fixa os embriões com 4% PFAT permite que um ensaio rápido da atividade de 3β-HSD (concluído no prazo de 1 dia) e, assim, beneficiar telas genéticos ou químicos visando os tecidos esteroidogênicas interrenais.
Pós-fixação os embriões após coloração de actividade 3β-HSD é essencial porque as quantidades vestigiais de componentes químicos tendem a persistir nas amostras coradas mesmo depois de uma lavagem exaustiva e resultaria em elevado ruído de fundo após um tempo de armazenamento longo. No entanto, se os embriões corados de actividade 3β-HSD estão a ser submetidas a análise IHC, armazenando a actividade-coradas e lavou-se embriões a 4 ° C durante a noite 3β-HSD não resulta num aumento notável do fundo.
Na análise de hibridização in situ (ISH) de 3β-HSD embriões manchado de atividade é possível. Por exemplo, a expressão de transcritos de Prox1 está co-localizada com a actividade 3β-HSD no steroidogenic tecido 10. Para executar 3β-HSD de coloração de actividade, além de ISH, os embriões devem ser fixadas em 4% PFAT durante 4 horas antes e após o ensaio de actividade de 3β-HSD para que os transcritos de ARN celular pode ser conservada com qualidade desejável para a análise ISH.
Análise ISH usando riboprobes de ff1b, cyp11a1, hsdb1, e estrela foram aplicadas nos estudos de desenvolvimento do tecido 1,2,11 esteroidogênica interrenal. O riboprobe de ff1b detecta células interrenais primordiais em 22 hpf, enquanto as de cyp11a1 e estrela detectar diferenciação de células interrenais por 24 hpf. Em comparação com 3β-HSD coloração histoquímica que só detecta interrenais tecidos diferenciados a partir de 28 HPF em diante, ISH análise pode ser utilizado para analisar um espectro de genes específicos de células em ambos os interrenais interrenais primordiais e diferenciadas. No entanto, 3β-HSD histoquímica ha coloraçãoé a vantagem de ser simples, rápido e confiável para a análise do fenótipo do tecido interrenal esteroidogênica diferenciada e, portanto, é uma poderosa ferramenta para estudos de desenvolvimento detalhados, bem como telas genéticos ou químicos em larga escala. De acordo com nossa revisão da literatura relevante, não existe nenhum anticorpo específico, que pode detectar com segurança a expressão da proteína no tecido interrenal esteroidogênica por imunohistoquímica. Portanto, o método de coloração histoquímica 3β-HSD é particularmente úteis para delinear o tecido e morfologia celular do tecido interrenal esteroidogênica.
Embora 3β-HSD coloração histoquímica é útil para a visualização do tecido interrenal esteroidogênica diferenciado, que não comunica directamente capacidade de sintese de esteróides, ou a funcionalidade das células interrenais. As mutações que afectam a enzimas ou produtos químicos a montante ou a jusante de 3β-HSD na cascata de síntese esteroidogênica não podenecessariamente ser detectada com este método descrito, uma vez que podem ou não podem perturbar o tamanho ou a morfologia do tecido interrenal. Portanto, os usuários deste protocolo deve ter em mente que certas deficiências enzimáticas afetando a função mas não morfologia do tecido interrenal não pode ser facilmente detectado por este método.
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Acknowledgments
Agradecemos Prof. Christoph Englert e Prof. Didier Stainier para presentear a Tg (wt1b: GFP) LI1 e Tg (kdrl: EGFP) s843 estirpes, respectivamente, e do Mecanismo de Taiwan Zebrafish núcleo para fornecer Tg (kdrl: mCherry) CI5. Este estudo foi apoiado por subsídios do Ministério da Ciência e Tecnologia (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 de Taiwan, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Glycerol | USB | US16374 | |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C | |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab | |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 | |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 | |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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