Introduction
このプロトコルで提示されたハイブリドーマ技術は、最初のいくつかの技術的な改良を除いて、主な手順は最後の40年2の間に劇的に変化していない、1975年にケーラーとミルスタイン1によって説明しました。このプロトコルの目的は、より適切な免疫戦略、モノクローナル抗体の生成のための標準的な方法、および検証法（ELISA）のための一例を説明することです。
抗体は、信じられないほどのツールであり、そのようなフローサイトメトリー、磁気細胞選別、または免疫蛍光などの技術的アプローチ、の広い範囲、ならびに疾患のモニタリングおよび処置の3のための診断と治療法の選択肢に貢献しています。希望するターゲットのためのモノクローナル抗体の商業的利用可能性は、抗体または抗体関連製品4のほぼ無数の量と24以上の異なるウェブデータベースの存在によって証明されます。 2015年には、ntibody分子は、市販の抗体の適切な検証および特性評価に深刻な問題に起因する国際的な議論5-7の一部でした。
標的抗原に特異的な抗体を見つけることは困難かつ高価であり、多くの場合、それらは、親和性または特異性が必要ありません。抗体を生成することはまだ時間がかかり、かもしれない、より良いものを購入するよりも、個別の抗体を産生する、開発し、抗体を検証するために熟練した人材を必要としますが。
抗体産生は、時間がかかると経験を必要とするという事実のために、結合分子の産生のための代替的な方法は、これらの問題を克服するために開発されました。最も一般的に使用される別の方法は、ファージディスプレイを介して、単鎖抗体の組換え産生です。可変結合領域の遺伝子は、細胞から抽出されたファージの被覆タンパク質と組み合わされます。のイングル鎖は、次いで、バクテリオファージの表面に発現され、いくつかのパニングの工程8にスクリーニングされます。単鎖抗体の産生が少し高速であるが、それはまた、熟練した実験者を必要とします。いくつかの組換え単鎖抗体の欠点は、低い安定性およびインビトロ診断のための適合性の欠如です。ほとんどの診断テストでは、検出のためのFc受容体は、その後、組換え一本鎖抗体に付加する必要がある、必要です。再び、これは時間がかかり、ハイブリドーマ技術よりもさらに複雑です。 インビトロ診断では、完全長モノクローナルマウスおよびウサギ抗体が最良の選択であることが実証されています。
免疫複合体の設計を：研究室での作業を開始する前に、モノクローナル抗体を生成する際の主要なステップの一つが行われなければなりません。対処する必要のある質問は以下のとおりです。ターゲットの物理的組成物は、最終的なアプリケーションシートで何ですかイオン、及びその行列が存在していますか？どの濃度目標は、アプリケーションを持っているのだろうか？最終的なアプリケーションは何か、そして抗体が満たさなければならない要件は何ですか？
常に線形ペプチド断片が使用される場合、それはまた、選択の対象で最終エピトープに線形でなければならないことを考慮に入れます。そうしないと、抗体が結合しないであろう。もちろん、スクリーニング方法とは無関係に、抗体は、異なる用途における異なる抗原フォーマットを認識するように選択することができるが、これは非常に正確に検証されなければなりません。これらは、抗体開発と検証は、このような野心的なプロセスである理由です。
免疫のための抗原フォーマットの選択は、抗体開発のための基本であり、このプロセスの成功または失敗を決定します。マウスは、関連する抗体力価を発現した後、脾臓細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合させます。以下のための最も一般的な骨髄腫細胞株マウスモノクローナル抗体の開発は、X63-Agの8.653 9およびBALB / cマウス株由来のSp2 / 0-Agの14 10です。細胞は、悪性B細胞リンパ腫から降りると、彼らは自分の重鎖または軽鎖のいずれかを分泌しないため、選択されました。 1（骨髄腫細胞対脾臓細胞）：細胞を1:10と10との間の比に適合させることができます。 Stoichevaとホイ11によれば、1及びポリエチレングリコール（PEG）及び電気融合により融合した。このプロトコールでは、細胞を3の比に適合させました。
B細胞とミエローマ細胞との融合は、ランダムなプロセスです。したがって、2つのBリンパ球または2骨髄腫細胞のハイブリッドを生成することができるが、これらの雑種は、培養中の長時間生存することができないだろう。細胞は、融合されたハイブリドーマ細胞を伴うピリミジン合成のデノボ経路を使用する可能性を生き残ることが可能なヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）選択を受けます。月の世代のためにoclonal抗体は、一つの母細胞に由来する細胞株を得ることが必要です。モノクローナル性希釈技術および細胞成長の顕微鏡分析を制限することによって保証されます。ハイブリドーマ培養上清は、主にELISAによって、特異的抗体産生についてスクリーニングまたはフローサイトメトリー、および最高の結合剤が選択されています。大量培養および精製の後、抗体分子は、最終的に特徴付けることができ、所望の用途のための検証します。
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Protocol
ポツダム大学（ポツダム、ドイツ）での我々の繁殖コロニーからのBalb / CまたはNMRIマウス（ ハツカネズミ）は、モノクローナル抗体の産生のために使用しました。動物の作業は関連する国内および国際的なガイドラインに従って行いました。研究はブランデンブルク環境省、健康、および消費者保護（参照番号V3-2347-A16-4-2012）によって承認されました。
免疫複合体の調製
- 担体に抗原を結合するための、アミノ末端を介して、標準的なカップリングプロトコルを使用して、カルボキシ、またはグルタルアルデヒドなどによるスルホ基、N - （3-ジメチルアミノプロピル） - Nエチルカルボジイミド（EDC）、またはN - [Y-マレイミド]スクシンイミドエステル（スルホ-GMBS）。
- 1の比率：カップリング（ 例えば、グルタルアルデヒド）13については、1で標的タンパク質またはペプチドと担体（オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン）を使用します。広報目標を希釈oteinまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び50mMのNaHCO 3緩衝液中の担体タンパク質中のペプチド。ボリュームと予防接種のために必要な量の濃度に適応させます。
- 両方の溶液を混合し、1.25％グルタルアルデヒドを追加します。室温（RT）で4時間サンプルを混合し、インキュベートします。ハイブリドーマ細胞を選択するために、同一の免疫複合体を作るが、他のキャリアと、非特異的キャリアバインダーの選択を回避するために。
- 商業粗樹脂（ 例えば 、セファデックスG25）で高速透析を行うことによって、結合サンプルを透析。
- 中空針で1.5 mLの反応バイアルの底を穿孔し、15 mLチューブに入れてください。封止用の底にガラスウールを入れて、（0.5ミリリットルのキャリブレーションマークに）粗樹脂の300ミリグラムでそれをカバーしています。
- 慎重に、1.5 mLの反応管に1mLのPBSの滴下を入れて、ガラスウールがまだ穿孔を密閉していることを確認します。粗樹脂のをしてみましょうウェルおよび2分間、500×gでカラムを遠心します。そのようなカラムは、結合サンプル200μLを透析するために使用することができます。高いボリュームの場合、複数の列を作ります。
- チューブを変更し、膨潤し、粗樹脂上にカップリング溶液をドロップします。 2分間、500×gで再び遠心分離。チューブから溶離液を取り出して、免疫のためにそれを使用しています。
動物の2.予防接種
- 免疫のための2つまたは3 6〜12週齢のBalb / cマウスを選択してください。
- 1動物のために、150準備 - PBSの200μLで免疫複合体の200μgのを、完全Freund'sアジュバント（CFA）の100μLと混ぜます。 1-mLシリンジに短くて細い針（直径0.6mm）を用いて、溶液を3回混ぜます。マウスの腹腔内にソリューションを注入します。
- 6週間後に免疫複合体の同量のブースター注射を与えるが、CFAなし。 （後眼窩洞のうち）7日後に血液を取り、prepa室温（RT）で4時間 - 3のための血液をインキュベートすることにより、血清再。
- 5分間、3000×gで混合物を遠心分離します。血清上清を取り、新しいチューブにそれを転送します。 -20℃で保管してください。ペレットを捨てます。
- ELISA により血清を分析し、融合のためのステップ3で説明したように、最も高い血清力価を有するマウスを選択します。
- わずか4日間融合する前に、アジュバントなしのPBS 300μLで免疫複合体の200μgの - 細胞融合の準備のために、150でマウスを高めます。
3. ELISA
- PBS中5μg/ mLの濃度で抗原溶液を調製し、96ウェルプレートの各ウェルELISAに50μLを移します。
- 湿潤チャンバーにおいて37℃で、または一晩、4℃で2時間、プレートをインキュベート。
- 水道水でプレートを3回洗浄。湿ったCHに室温で1時間ウェル当たりPBS / 5％新生仔ウシ血清（NCS）の80μLでウェルをブロックアンバー。午前1時50分で始まる5シリーズ：1での血清希釈液を調製します。細胞培養の分析のために、希釈されていない培養上清を使用します。
- 水道水でプレートを3回洗浄。ウェル当たりのサンプルのピペット50μL及び湿潤チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG抗体の5,000希釈：1で二次抗体溶液を調製します。
- 水道水でプレートを3回洗浄し、ウェル当たり二次抗体溶液50μLを追加します。湿潤チャンバーにおいて室温で45分間インキュベートします。
- 新鮮な基質溶液を準備します。 0.1 MのNaH 2 PO 4、0.1％過酸化水素のストック溶液を作ります。 5部のNaH 2 PO 4、4部の過酸化水素と、新鮮な基質溶液1部のテトラメチルベンジジンを取ります。
- 水道水でプレートを10回洗浄します。ピペットで50ウェルに新鮮な基質溶液のμLと5インキュベート - で10分ダーク。
- 50μL1 MH 2 SO 4ウェルあたりで反応を停止させます。プレートリーダーを用いて、630 nmの参照波長を用いて450nmで光学密度を測定します。
骨髄腫細胞培養の4準備
- 今から、無菌条件下ですべての作業を行います。
- 細胞培養のための新鮮な培養培地を準備します。 10％ウシ胎児血清（50 mL）を、2mMのL-グルタミン（5 mL）を加え、50μMメルカプトエタノール（5 mL）でRPMI1640 500mLのを補います。 7日ごとにグルタミンを代入します。
- 温水中でネズミSP2 / 0細胞のバイアルを解凍します。 200×gで10分間、新鮮な培養培地と遠心分離機を10mLに細胞溶液を移します。上清を捨て、新鮮な培養培地1mLにペレットを再懸濁。
- インキュベーターで25 cm 2のフラスコ中に細胞を移し、37℃でそれらをインキュベートし、5％CO 2。 2 75-メートル2フラスコBEFに細胞を拡大鉱石融合。ステップ7で説明したように、長期保存のためにアリコートを節約します。
フィーダー細胞の5準備
- （国や機関のガイドラインによると、 例えば、CO 2吸入によって）12週齢のNMRIマウスを生け贄に捧げます。毛皮を削除し、70％エタノールで腹部をきれいに。
- 、腹部に氷冷RPMI培地の5ミリリットルを注入しピンセットで腹部をマッサージし、フィーダー細胞懸濁液を吸引。空の50 mLチューブに細胞を配置します。もう一度この手順を実行します。フィーダー細胞懸濁液の7〜10 mLを取り出さなければなりません。
- 完全な細胞培養液の90ミリリットル（RPMI 1640,10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、および50μMメルカプトエタノール）を添加することによって100mLのフィーダー細胞懸濁液を調製します。それを混合し、10×96ウェル細胞培養プレートに100μL/ウェルを転送します。一晩インキュベーター内で37℃、5％CO 2で培養します。
6.細胞融合
- 頸椎脱臼またはCO 2吸入によって免疫したマウスを犠牲にし、脾臓14を切り出します。 ELISAで陽性対照として、ステップ2.3で説明したように、心臓から追加の血を取り、血清を準備します。
- セルストレーナーを通して脾臓を押すことにより脾臓細胞懸濁液を準備します。完全な細胞培養培地で20 mLに埋めます。遠心分離（200×gで、10分間、4℃）で50-mLチューブ中の細胞を収穫。上清を捨てます。
- 細胞培養フラスコをリンスし、遠心分離により骨髄腫細胞を採取する（200×gで、10分間、4℃）、上清を捨てます。
- 20平衡塩緩衝液のML（BSS）に細胞ペレットを再懸濁し（125ミリモルのNaCl、5mMのKClを、4ミリモルのCaCl 2、2.5のMgCl 2、および5mMのTris-HCl、pH7.4）で遠心分離を再び。洗浄を3回ステップを繰り返します。
- 脾細胞調整する：骨髄腫細胞の割合を、モミによって第2の洗浄工程の後に細胞を計数BSSバッファー1mLにペレットを再懸濁セント。 1:10希釈を行い、細胞計数室に10μLを移します。細胞をカウントし、1 mLの細胞濃度を決定します。
- 1 mLの最終容量で三部品脾細胞と一部品骨髄腫細胞をBSS緩衝液中の細胞数を調整します。細胞懸濁液200μLを取り、PEG8000の200μL（BSS緩衝液4mL中1グラム）と混ぜます。 2ミリメートルの直径を有するエレクトロポレーションキュベットに400μLを移し、パルス設定（600から650 Vと25ミリ秒）。
- パルス後、キュベット中で3分間室温で細胞を培養します。細胞を除去し、それらをHAT培地100ml（RPMI 1640、10％FCS、2mMグルタミン、50μMのメルカプトエタノール、100μMのヒポキサンチン、5.8μMアザセリン、および16μMチミジン）との三角フラスコに滴下して入れました。
- 1-mLのバッチが費やされるまで融合を4回繰り返します。 37℃、5％CO 2で3時間、三角フラスコをインキュベートインキュベーターインチ
- フィーダー層上に細胞をプレーティングする前に、ヒポキサンチン、アザセリン、およびチミジンを再び細胞懸濁液を補います。 （インキュベーター内で）フィーダー層プレートにウェル当たり100μLの細胞懸濁液を加え、37℃でプレートをインキュベートし、5％のCO 2。ウェル内の最終濃度は、100μMヒポキサンチン、5.8μMアザセリン、および16μMチミジンをすべきです。
- ウェルは、モノ - またはポリクローナルであるかどうかを判断するために、7日後のプレートの各ウェル中のクローン増殖のために：顕微鏡分析（10X対物レンズ、10X接眼倍率）を実行します。モノクローナル細胞は、1つの単一細胞に由来する細胞の1クラスタです。ポリクローナル細胞は、1つのウェル中の細胞の複数のクラスタです。 7日後に完全なメディアを変更し、HAT培地中で7日間再びインキュベートします。
- HAT培地を変更して、完全な細胞培養培地中で細胞を培養。 Eを実行するために上清を使用して、LISAは、ステップに記載されるように3陽性ハイブリドーマ細胞は、特異的抗体の産生のための試験によれば、24ウェルプレートに拡張しなければなりません。細胞がポリクローナルである場合は、限界希釈（ステップ8を参照）を実行しなければなりません。
ハイブリドーマの7.凍結保存
- 長期保存のための正のモノおよびポリクローナルハイブリドーマをCryoconserve。遠心分離により> 60％のコンフルエンスで24ウェルプレートから細胞を採取（200×gで、10分間、4℃）。
- 完全な細胞培養培地の500μLにペレットを再懸濁し、クライオチューブにそれを転送します。 、凍結培地の500μL（RPMI 1640、20％FCS、および15％のジメチルスルホキシド）を追加し、それを混合し、発泡スチロールの箱や特殊な冷凍ボックスの中に入れます。 3日間-80℃で保管してください。 3日後、クライオチューブは、長期保存のために液体窒素に移すことができます。
8.ポリクローナルハイブリドーマの限界希釈法
- マックステップ7.1で説明したように、ステップ5ハーベスト陽性のポリクローナル細胞に記載されているように、EAフィーダー層培養物。ステップ6.5で説明したように、細胞を計数し、96ウェルプレートのために10 mLの最終容量で、10 6細胞/ mLに細胞数を調整します。フィーダー層上に100μL/ウェルを追加します。
- 37℃で7日間インキュベートし、顕微鏡（倍率：10倍対物レンズ、10Xアイピース）のクローン性増殖を分析。ステップ3で説明したように、培養上清のELISAを行い、大量培養のための適切なモノクローナルハイブリドーマを同定。
9.大衆文化およびモノクローナル抗体の精製
- 25cm 2のまたは75cm 2のフラスコに、適切なELISAシグナルを有するモノクローナルハイブリドーマを移し、培養上清の500 mLに、最大収集します。特異的抗体産生のための培養毎週をテストし、3節約 - ステップ7で説明したように、長期保存のためのハイブリドーマあたり5アリコートを。
- （：のdH 2 Oで3結合緩衝液1を希釈）洗浄バッファーでそれを洗浄することにより、タンパク質をカラムを準備します。カラム上でステップ9.2から上清をパスし、フロースルーを収集します。 0.1 Mクエン酸、pHが3.5と結合した抗体を溶出し、トリス塩酸の500μL、pHは9.0ですぐにpH値を中和します。
- SDS-PAGE、ウエスタンブロット、およびELISAによって溶出した抗体を特徴付け、そして最終的なアプリケーションのためにそれを検証します。
- 4×SDSサンプルローディングバッファー（8％SDS、20％2-メルカプトエタノール、40％のグリセリン、および0.015の5μLを追加し、レーンあたり精製された抗体溶液（20μLのサンプル）の5μgの - SDS-PAGEのために、3を取ります％ブロモフェノール、還元）、および95℃で5分間、プローブを加熱します。対照として、精製されたAと同じサンプルを使用同じアイソタイプが、無関係な特異性のntibody。
- 、12.5％SDSゲル上でサンプルをロードし、追加のレーンに未染色タンパク質ラダーの5μLを配置し、電気泳動によりそれらを分離。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、結果を文書化します。基本的なSDSプロトコルは、1970年15でレムリによって設立されました。
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Representative Results
図1は、実験室で実行される1つの免疫化のための抗原特異的血清力価の例を示す図です。未処置マウスの血清と比較して5,000,000：この図では、免疫血清のA及びB 1:50から1に滴定しました。抗原は、固相上に被覆し、そして特異的な抗体をPODコンジュゲートヤギ抗マウスIg抗体を用いて検出しました。免疫したマウスの両方の血清はナイーブマウスと比較して、有意に高い抗原特異的な力価を示しました。 1の希釈で信号：5000は、次のステップ、細胞融合に移動するのに十分です。
図2に示すように、ハイブリドーマの成長は、細胞クローンの開発により、HAT選択の7〜10日後に見られました。画像は、10日目、融合後、96ウェルプレートから採取しました。細胞クローンと井戸のaminopterinemono-または多クローン性（：10X対物レンズ、10倍接眼倍率）は、個々の顕微鏡分析によりモニターしました。モノクローナルウェルをプレートの上に点で標識しました。プレートをELISAで試験したときに、モノクローナルハイブリドーマからの抗原特異的なシグナルを容易に識別することができました。陽性ハイブリドーマ培養物は、再クローン化拡大し、文化が安定したモノクローナル抗体、および抗原特異的になるまでcryoconservedました。培養上清をプロテインA媒介アフィニティークロマトグラフィーによって産生されるモノクローナル抗体を精製するために、培養の時間の間に収集しました。 図3は、IgG1アイソタイプを有するモノクローナル抗体の標準的な溶出プロフィールを示します。
図4に示すように、精製されたモノクローナル抗体をさらに、SDS PAGEによって特徴付けしました。 50および25kDaので、重鎖および軽鎖は、抗体分子の精製を示す、はっきりと見えました。レーン2秒同じアイソタイプで対照抗体をhowed。
図1： 予防接種後の血清滴定。 2匹のマウスからの血清は、1：50 1までの希釈で滴定した：5,000,000およびELISAによる抗原特異性を試験しました。非免疫マウスの対照血清として1:50希釈で使用しました。抗原特異的なシグナルは、両方の免疫したマウスについて陽性であり、マウスAの脾細胞は、ハイブリドーマ生成のために使用しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： モノおよびポリクローナルハイブリドーマの写真。モノおよびポリクローナルHYbridomasを顕微鏡10日細胞融合の後に分析しました。画像は、モノクローナル（A）およびポリクローナル（B）の特性を有する安定なハイブリドーマ細胞株のための従来の結果を示します。スケールバー：10μmで、 Bスケールバー：10μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：IgG1 のアイソタイプを有するモノクローナル抗体のための標準的な溶出プロファイル。生成されたモノクローナル抗体は、プロテインA媒介アフィニティークロマトグラフィー、およびIgG1抗体の溶出プロファイルは、図に示されています。最初のピークは、pH 5.0で溶出したモノクローナル抗体分子を示します。次のピークは、pH 3.5およびpH 2.0を示しています。 pHの低下が必要です完全にすべての物質の列をきれいにすると、次の精製のための列の行列を再生成します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：IgG1 のアイソタイプを有するモノクローナル抗体のための標準のSDS PAGE。抗体溶出液の純度は、クーマシー染色SDS-PAGEにより決定しました。抗体溶液5μgのはL2に適用され、還元条件下L3における標準的なIgG1抗体の5μgのと比較しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体の生成は、抗体が標的を認識しなければならないときに、特に最終的なアプリケーションに関しては、強烈かつ詳細なエピトープ分析を必要とします。これは、多くの場合、ユーザーが過小評価と弱いパフォーマンスには抗体につながります。融合プロセスは、特定のハイブリドーマの結果は、この時点で細胞比および活力に大きく依存することを意味し、常にランダムです。限界希釈後、細胞は非常に不安定であり、細胞増殖および抗体産生の厳格な監視を必要とします。メソッドのトラブルシューティングを行うときに、それらのパラメータを慎重に分析する必要があります。
技術のさらなる制限は、細胞株の生成および所望の抗体産生細胞を選択するために必要な時間を含みます。融合後の染色体の四倍体セットのために、細胞が非常に不安定であり、その後再び半数体には、setを減らします。これができました細胞はもはや抗体を産生しないことを引き起こし、抗体関連遺伝子の損失につながります。別の制限は、所望の抗体産生細胞の選択は、培養上清ではなく、精製された抗体溶液に基づいていることです。したがって、抗体の最終的な特徴付けは、選択されたハイブリドーマクローンの大量培養した後、ほとんどの場合、唯一の可能性です。したがって、抗体は、最終的なアプリケーションで動作することができないという危険性が非常に高いです。
このようなレーザ対応の分析および処理技術（LEAP）16、親和性捕捉表面ディスプレイ（ACSD）17、またはゲルの微小液滴技術18、のようないくつかの技術的な修飾は、適切な抗体の選択時の欠点を回避するために記載されました。すべてのこれらの方法は、ハイブリドーマの生成および選択の異なる側面を改善することができるが、それらのほとんどは、各単セルのLiのために高価な装置や最適化を必要としますね16。
メッサーシュミットら 19に記載されているように私たちの研究室で開発された別の改善や変更は、キメラウイルス様粒子（VLP）を有する新規な免疫戦略です。粒子は、ウイルスコート構造体に埋め込まれ、所望のエピトープ配列によって修飾し、それらの粒子の表面上に提示することができます。これは、対応する動物では4週間後に非常に迅速で特異的な免疫をリードしています。生成されたモノクローナル抗体は、IgG2のかはIgG1アイソタイプを持っているとネイティブ抗原に対して高度に特異的なエピトープ選択に依存しています。我々はまた、人工的な細胞表面マーカーを使用して、ハイブリドーマ細胞に特異的な選択工程を開発しました。使用するトランスジェニック骨髄腫細胞が安定的に挿入された表面マーカーを表示します。この表面マーカーは、希釈を制限することなく、過度ELISAスクリーニングなしに、抗原するために使用されるか、またはアイソタイプ特異的に直接融合後のハイブリドーマ細胞を選別することができます従来のハイブリドーマ技術20に実際に必要です。
上記のように、将来的には、取り扱いを改善し、現在のハイブリドーマ技術の欠点を減らすことができ、モノクローナル抗体の生成に利用可能ないくつかの有望な選択肢があります。生成されたモノクローナル抗体が正常に動作するようにそれにもかかわらず、手続きは常に厳格かつ慎重に計画されたアプリケーションと組み合わせて所望のエピトープの詳細な識別が必要になります。ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体の生成が原因科学、診断、および治療において莫大な需要に将来的に重要かつ必要なステップとなります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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