Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Introduction

De hybridoma techniek die in dit protocol werd eerst beschreven door Köhler en Milstein in 1975 ¹ en, met uitzondering van enkele technische verbeteringen, de hoofdprocedure niet drastisch veranderd gedurende de laatste 40 jaar ^2. Het doel van dit protocol is geschikter is immuniseringstrategie een standaardmethode voor het genereren van monoklonale antilichamen, en een voorbeeld van een validatie methode (ELISA) verklaren.

Antilichamen zijn ongelooflijk instrumenten en bijdragen aan een groot aantal technologische benaderingen zoals doorstroomcytometrie, magnetische celsortering, of immunofluorescentie, maar ook voor diagnostische en therapeutische toepassingen voor de ziekte volgen en behandelen ^3. De commerciële beschikbaarheid van monoklonale antilichamen voor gewenste doelen wordt aangetoond door de aanwezigheid van meer dan 24 verschillende webdatabases bijna ontelbare hoeveelheden antilichamen of antilichaam gerelateerde producten ^4. In 2015, eenntibody moleculen maakten deel uit van een internationale discussie ^5-7 als gevolg van ernstige problemen in de juiste validatie en karakterisering van commercieel verkrijgbare antilichamen.

Het kan moeilijk en kostbaar zijn specifieke antilichamen voor een antigeen gerichte vinden vaak, hebben zij niet de affiniteit of specificiteit nodig. Hoewel het genereren van een antilichaam is nog steeds tijdrovend en vereist geschoold personeel te ontwikkelen en valideren van het antilichaam, het produceren van een antilichaam individueel misschien beter dan het kopen van een.

Vanwege het feit dat antilichaamproductie is tijdrovend en vereist ervaring, alternatieve werkwijzen voor de productie van bindende moleculen zijn ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. De meest gebruikte alternatieve werkwijze is de recombinante productie van enkelketenige antilichamen via faagdisplay. De genen voor het variabele bindingsgebied worden uit cellen en gecombineerd met de coating proteïne van een faag. de single keten wordt vervolgens op het oppervlak van een bacteriofaag en gescreend in verschillende pannen ⁸ stappen. De productie van enkelketenige antilichamen iets sneller, maar het vereist ook een ervaren experimentator. De nadelen van bepaalde recombinante enkelketenige antilichamen slechte stabiliteit en een gebrek aan geschiktheid voor IVD. In de meeste diagnostische testen, een Fc-receptor voor detectie nodig, die moet later een recombinant antilichaam met enkele keten worden toegevoegd. Nogmaals, dit is tijdrovend en zelfs complexer dan de hybridoma techniek. In in vitro diagnostica zijn full-length muis en konijn monoklonale antilichamen is aangetoond dat de beste keuze.

Een van de belangrijkste stappen bij het genereren van monoklonale antilichamen moet gebeuren voor het werk in het lab begint: het ontwerp van het immunoconjugaat. Vragen die moeten worden aangepakt zijn: Wat is de fysische samenstelling van het doel in de finale Application, en welke matrices aanwezig? Welke concentratie zal de doelgroep bij de toepassing? Wat is de uiteindelijke toepassing, en wat zijn de eisen die het antilichaam moet voldoen?

Altijd rekening houden dat als een lineair peptide fragment wordt gebruikt, moet ook worden lineair in de laatste epitoop in het doel van keuze; anders zal het antilichaam binden. Natuurlijk, onafhankelijk van de screeningswerkwijze antilichamen kunnen worden geselecteerd om verschillende antigene formaten herkennen verschillende toepassingen, maar dit moet zeer nauwkeurig worden gevalideerd. Dit zijn de redenen waarom antilichaam ontwikkeling en validatie zijn dergelijke ambitieuze processen.

De keuze van de antigene format voor immunisatie is fundamenteel voor de ontwikkeling van antilichamen en bepaalt het succes of falen van dit proces. Zodra de muizen brengen een relevant antilichaam titer, worden de miltcellen geïsoleerd en gefuseerd met myelomacellen. De meest voorkomende myeloma cellijnen voormurine monoklonaal antilichaam ontwikkeling X63-Ag 8,653 ⁹ en Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ van een Balb / c muizenstam. De cellen afstammen van een kwaadaardige B-cel lymfomen en werden geselecteerd omdat zij geen eigen zware of lichte ketens uitscheiden. De cellen kunnen worden aangepast om een ​​verhouding tussen 1:10 en 10: 1 (splenocyten versus myelomacellen). In dit protocol werden de cellen aangepast om een verhouding van 3: 1 en gefuseerd door polyethyleenglycol (PEG) en elektrolas volgens Stoicheva en Hui ^11.

De fusie van B-cellen en myeloma cellen een willekeurig proces. Daarom kan hybriden van twee B-lymfocyten of twee myeloomcellen worden geproduceerd, maar die hybriden zouden niet kunnen overleven lang in kweek. De cellen ondergaan een hypoxanthine, aminopterine en thymidine (HAT) selectie, waarbij alleen gesmolten hybridoomcellen overleven vanwege de mogelijkheid om de de novo route van pyrimidine synthese. Voor het genereren van Monoclonal antilichamen, is het nodig om een ​​cellijn afkomstig uit een moedercel verkrijgen. De monoklonaliteit wordt gewaarborgd door beperkende verdunning technieken en de microscopische analyse van celgroei. De hybridoma kweeksupernatanten te screenen op specifieke antilichaamproductie, meestal door ELISA en doorstroomcytometrie en de beste bindmiddelen geselecteerd. Na massacultuur en zuivering, kan het antilichaammolecuul uiteindelijk gekarakteriseerd en gevalideerd voor de gewenste toepassing.

Protocol

Balb / c of NMRI muizen (Mus musculus) Aanbevolen fokkolonie aan de Universiteit van Potsdam (Potsdam, Duitsland) werden gebruikt voor de productie van monoklonale antilichamen. Het dier werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de relevante nationale en internationale richtlijnen. De studie werd goedgekeurd door de Brandenburgse ministerie van Milieu, Gezondheid en consumentenbescherming (referentienummer V3-2347-A16-4-2012).

1. Bereiding van immunoconjugaten

1. Voor het koppelen van het antigeen aan een drager, gebruik van standaard koppelingsprotocollen via amino-, carboxy- of sulfo-groepen, zoals door glutaaraldehyde, N - (3-dimethylaminopropyl) - N-ethylcarbodiimide (EDC) of N - [y-maleimidobutyryloxy ] succinimide ester (sulfo-GMBS).
2. Voor koppeling (bijvoorbeeld met glutaaraldehyde) ^13, gebruikt het doeleiwit of peptide en de drager (ovalbumine, runderserumalbumine of keyhole limpet hemocyanine) in een 1: 1 ratio. Verdun de doelgroep protein of peptide in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het dragereiwit in 50 mM buffer _NaHCO3. Pas het volume en de concentratie van het bedrag dat nodig is voor de vaccinaties.
   1. Meng beide oplossingen en voeg 1,25% glutaaraldehyde. Meng en incubeer het monster gedurende 4 uur bij kamertemperatuur (RT). De hybridomacellen selecteren, hetzelfde immunoconjugaat, maar met een andere provider, om de selectie van onspecifieke carrier bindmiddelen voorkomen.
3. Dialyseren de koppeling monster door het uitvoeren van een snelle dialyse met commerciële grove hars (bijvoorbeeld Sephadex G25).
   1. Perforeer de bodem van een 1,5-mL reactie flacon met een holle naald en plaats deze in een 15-mL buis. Zet glaswol op de bodem voor het afdichten en bedek het met 300 mg van grof hars (tot de maatstreep van 0,5 ml).
   2. Voorzichtig zet 1 ml PBS druppelsgewijs in een 1,5-mL reactie buis en zorg ervoor dat de glaswol is nog steeds het afdichten van de perforatie. Laat de grove hars sgoed en centrifugeer de kolom bij 500 xg gedurende 2 minuten. Een dergelijke kolom kan worden gebruikt om 200 pl van het monster koppeling dialyseren. Voor grotere volumes, maken meer kolommen.
   3. Verander de buis en laat de koppeling oplossing op de zwol grove hars. Centrifugeer opnieuw bij 500 xg gedurende 2 minuten. Verwijder het eluent uit de tube en gebruiken voor immunisatie.

2. Immunisatie van dieren

1. Kies twee of drie 6 tot 12 weken oude Balb / c muizen voor immunisatie.
2. Voor een dier, bereiden 150-200 ug van het immunoconjugaat in 200 pi PBS en meng dit met 100 pl compleet Freund's adjuvant (CFA). Meng de oplossing 3 maal met een korte en dunne naald (0,6 mm diameter) op een 1 ml spuit. Spuit de oplossing intraperitoneaal in de muis.
3. Geef een booster injectie 6 weken later met dezelfde hoeveelheid van het immunoconjugaat, maar zonder CFA. Neem bloed 7 dagen later (uit de retro-orbitale sinus) en preparopnieuw het serum door het incuberen van het bloed voor 3-4 uur bij kamertemperatuur (RT).
   1. Centrifugeer het mengsel bij 3000 xg gedurende 5 minuten. Neem het serum supernatant en overbrengen naar een nieuwe buis. Bewaar bij -20 ° C. Gooi de pellet.
4. Analyseer de sera via ELISA, zoals beschreven in stap 3. fusion, kiest de muis met de hoogste titer serum.
5. Ter voorbereiding van celfusie, vergroting van de muis met 150-200 ug van het immunoconjugaat in 300 pl PBS zonder adjuvans slechts 4 dagen voor de fusie.

3. ELISA

1. Bereid een antigeen met een concentratie van 5 ug / ml in PBS en breng 50 pl in elk putje van een ELISA 96-wells plaat.
2. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C in een vochtige kamer.
3. Was de plaat 3 keer met kraanwater. Blokkeer de putjes met 80 pl PBS / 5% pasgeboren kalfserum (NCS) per putje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige lamber. Bereid de serumverdunningen in een 1: 5 reeks ab 01:50. Voor de analyse van de celkweek, gebruik maken van de onverdunde kweeksupernatant.
4. Was de plaat 3 keer met kraanwater. Pipetteer 50 ul van het monster per putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Bereid de secundaire antilichaamoplossing in een 1: 5000 verdunning van geit anti-muis IgG antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP).
5. Was de plaat 3 keer met leidingwater en voeg 50 ul van het secundaire antilichaam oplossing per well. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
6. Bereid een verse substraatoplossing. Maak voorraadoplossingen van 0,1 M NaH _{2PO 4} en 0,1% waterstofperoxide. Neem 5 delen NaH ₂ PO _4, 4 delen waterstofperoxide, en 1 deel tetramethylbenzidine voor de verse substraatoplossing.
   1. Was de plaat 10 maal met leidingwater. Pipetteer 50 ul van verse substraatoplossing aan de putjes en incubeer gedurende 5-10 min in dedonker.
7. Stop de reactie met 50 ul 1 MH ₂ SO ₄ per putje. Met behulp van een plaat lezer, meet de optische dichtheid bij 450 nm met een referentie-golflengte bij 630 nm.

4. Voorbereiding van Myeloma Cell Cultures

1. Van nu af aan, het uitvoeren van alle werkzaamheden onder steriele omstandigheden.
2. Bereid een vers kweekmedium voor celkweek. Supplement 500 ml RPMI1640 met 10% foetaal kalfsserum (50 ml), 2 mM L-glutamine (5 ml) en 50 uM mercaptoethanol (5 ml). Vervanging van de glutamine elke 7 dagen.
3. Dooi een flacon murine SP2 / 0 cellen in warm water. Breng de cel oplossing in 10 ml vers kweekmedium en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 200 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml vers kweekmedium.
4. Overdracht van de cellen in een 25 ^cm2 kolf en incubeer ze op 37 ° C en 5% _CO2 in een incubator. Vouw de cellen om twee 75-m ² kolven beferts fusie. Conserve porties voor langdurige opslag, zoals beschreven in stap 7.

5. Bereiding van voedingscellen

1. Offer een 12 weken oude NMRI muis (op basis van nationale en institutionele richtlijnen, bijvoorbeeld door CO ₂ inhalatie). Verwijder de vacht en het reinigen van de buik met 70% ethanol.
2. Injecteer 5 ml ijskoude RPMI medium in de buik, massage van de buik met een pincet, en zuig de feeder celsuspensie. Plaats de cellen in een lege 50 ml buis. Voer deze stap opnieuw. 7 tot 10 ml van de celsuspensie feeder worden opgehaald.
3. Bereid een 100-mL celsuspensie voeder door toevoeging van 90 ml volledig kweekmedium (RPMI 1640, 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 50 uM mercaptoethanol). Mengen en breng 100 ul / well in 10 x 96-well celkweekplaten. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% _CO2 in een incubator.

6. celfusie

1. Offer het geïmmuniseerde muis door cervicale dislocatie of CO ₂ inademing en accijnzen de milt ^14. Neem extra bloed uit het hart en het serum te bereiden, zoals beschreven in stap 2,3, als een positieve controle in de ELISA.
2. Bereid een miltcelsuspensie door het indrukken van de milt door middel van een cel zeef. Vul tot 20 ml vol celkweekmedium. Oogst de cellen in 50 ml buizen door centrifugatie (200 x g, 10 min en 4 ° C). Verwijder het supernatant.
3. Spoel de celkweek kolf en de oogst van de myeloma cellen door centrifugeren (200 x g, 10 min, 4 ° C) en gooi het supernatant.
4. Resuspendeer de celpellets in 20 ml balanced salt buffer (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM _CaCl2, 2,5 mM _MgCl2 en 5 mM Tris-HCl, pH 7,4) en gecentrifugeerd weer. Herhaal de wasstappen driemaal.
5. Voor het aanpassen van de splenocyten: myeloma cel ratio, de telling van de cellen na de tweede wasstap door first resuspenderen van de pellet in 1 ml buffer BSS. Maak een 1:10 verdunning en overdracht 10 pi naar een cel telkamer. Tel de cellen en bepalen de celconcentratie van 1 ml.
6. Stel de celaantallen in de BSS buffer tot drie delen splenocyten en eendelig myeloomcellen in een 1 ml eindvolume. Neem 200 pi van de celsuspensie en mengen met 200 uL PEG8000 (1 g in 4 ml buffer BSS). Breng de 400 pi in een elektroporatie cuvet met een diameter van 2 mm en stel de puls (600-650 V en 25 ms).
   1. Na de puls, incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 3 min in de cuvette. Verwijder de cellen en ze druppelsgewijs in een erlenmeyer met 100 ml HAT-medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutamine, 50 uM mercaptoethanol, 100 pM hypoxanthine, 5,8 pM azaserine, en 16 pM thymidine).
   2. Herhaal het fusie 4 keer tot de 1 ml batch wordt besteed. Incubeer de Erlenmeyer kolf gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO ₂in een incubator.
7. Supplement de celsuspensie opnieuw met hypoxanthine, azaserine, en thymidine voor het uitplaten van de cellen op de voedingslaag. Voeg 100 ul van de celsuspensie per putje tot de feeder-laag platen en incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO ₂ (in een incubator). De uiteindelijke concentratie in de put moet 100 uM hypoxanthine, 5,8 uM azaserine, en 16 uM thymidine zijn.
8. Voer een microscopische analyse (vergroting: 10x objectief, 10x oculair) voor klonale groei in elk putje van de plaat na 7 dagen om te bepalen of de putjes mono- of polyklonaal. Monoklonale cellen een cluster van cellen die afkomstig zijn van een enkele cel. Polyklonale cellen meerdere clusters van cellen in een putje. Verander de volledige media na 7 dagen en opnieuw incuberen gedurende 7 dagen in HAT-medium.
9. Verander de HAT-medium en cultiveren van de cellen in volle celkweekmedium. Gebruik de bovenstaande om een ​​E uit te voerenLISA, zoals beschreven in stap 3 Positieve hybridomacellen worden geëxpandeerd in 24-well platen volgens de tests voor de productie van specifieke antilichamen. Als de cellen polyklonaal beperkte verdunning moet worden uitgevoerd (beschreven in stap 8).

7. cryopreservatie van Hybridoma

1. Cryoconserve positieve mono- en polyklonale hybridoma's voor de lange termijn opslag. Oogst de cellen van een 24-wells plaat met een confluentie van> 60% door centrifugeren (200 x g, 10 min en 4 ° C).
2. Resuspendeer de pellet in 500 ui van volledige celkweekmedia en overzetten in een cryotube. Voeg 500 ul van bevriezing medium (RPMI 1640, 20% FCS en 15% dimethylsulfoxide), meng het en zet het in een piepschuim doos of een speciale vriesbox. Bewaar bij -80 ° C gedurende 3 dagen. Na 3 dagen, kan de cryotube worden overgedragen aan vloeibare stikstof gedurende opslag op lange termijn.

8. beperkende verdunning van polyklonale hybridomen

1. Makea voedsterlaag kweek, zoals beschreven in stap 5 Oogst positieve polyklonale cellen, zoals beschreven in stap 7.1. Tel de cellen, zoals beschreven in stap 6.5 en pas het aantal cellen tot 10 cellen / ml, met een eindvolume van 10 ml van een 96-wells plaat. Voeg 100 ul / put op de feeder-laag.
2. Incubeer gedurende 7 dagen bij 37 ° C en analyseren de klonale groei microscoop (vergroting: 10x objectief, 10x oculair). Maak een ELISA van de kweeksupernatant, zoals beschreven in stap 3, en bepaal de bijbehorende monoklonale hybridoma massacultuur.

9. massacultuur en zuivering van monoklonale antilichamen

1. Breng de monoklonale hybridoma met de juiste ELISA signalen 25 cm ² of 75 ^cm2 flessen en laat tot 500 ml van de kweek supernatant. Test de cultuur wekelijkse voor specifieke productie van antilichamen en de instandhouding van 3-5 porties per hybridoma voor langdurige opslag, zoals beschreven in stap 7.
2. Bereid een proteïne A kolom te wassen met wasbuffer (bindingsbuffer verdun het 1: 3 in dH ₂ O). Leid de supernatant van stap 9,2 over de kolom en verzamel het doorstroomkanaal. Elueer de gebonden antilichaam met 0,1 M citraat, pH 3,5 en neutraliseren van de pH onmiddellijk met 500 pl Tris-HCl, pH 9,0.
3. Karakteriseren geëlueerde antilichaam door SDS-PAGE, Western blot en ELISA, en valideren van de uiteindelijke toepassing.
   1. Voor de SDS PAGE, neem 3-5 ug gezuiverd antilichaam oplossing per laan (een 20-ul monster), voeg 5 ul van 4x SDS monster laadbuffer (8% SDS, 20% 2-mercaptoethanol, 40% glycerine en 0,015 % broomfenol, gereduceerd) en verwarm de probes bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Als controle gebruiken hetzelfde monster met een gezuiverdentibody van hetzelfde isotype, maar irrelevante specificiteit.
   2. Plaats de monsters op een 12,5% SDS-gel, plaats 5 pi van een ongekleurde eiwit ladder in een extra rijstrook, en ze te scheiden door elektroforese. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue en documenteren van de resultaten. Een fundamentele SDS protocol werd opgericht door Laemmli in 1970 ^15.

Representative Results

Figuur 1 toont een voorbeeld van de antigeenspecifieke serum titer één immunisatie uitgevoerd in het laboratorium. In deze figuur, de immune sera A en B werden getitreerd van 1:50 tot 1: 5.000.000 in vergelijking met een serum van naïeve muizen. Het antigeen werd bekleed op de vaste fase, en de specifieke antilichamen werden gedetecteerd met een POD-geconjugeerde geit anti-muis Ig antilichaam. Beide sera van de geïmmuniseerde muizen vertoonden een beduidend hogere antigeenspecifieke titer vergeleken met naïeve muis. Het signaal bij een verdunning van 1: 5000 volstaat om naar de volgende stap, de celfusie.

De groei van hybridoma zichtbaar was na 7 tot 10 dagen HAT selectie door de ontwikkeling van celklonen, zie figuur 2. Het beeld werd genomen uit een 96-well plaat 10 dagen na de fusie. De celklonen en de aminopterinemono- of polyklonaliteit van de putjeswerden gevolgd door individuele microscopische analyse (vergroting: 10x objectief, 10x oculair). Monoklonale putjes werden gelabeld met een punt op de bovenkant van de plaat. Wanneer de platen werden getest in ELISA, kunnen antigeenspecifieke signalen van monoklonale hybridoma gemakkelijk worden geïdentificeerd. Positieve hybridoma kweken werden opnieuw gekloneerd, uitgebreid en cryoconserved totdat de kweek was monoklonale, stabiel en antigeenspecifieke. Het kweeksupernatant werd verzameld gedurende de periode van kweken om het geproduceerde monoklonale antilichaam te zuiveren via proteïne A-gemedieerde affiniteitschromatografie. Figuur 3 toont een standaard elutieprofiel van een monoklonaal antilichaam met een IgG1 isotype.

Gezuiverde monoklonale antilichamen werden verder gekarakteriseerd door een SDS PAGE, zie figuur 4. Op 50 en 25 kDa, de zware en lichte ketens waren duidelijk zichtbaar, waarin de zuivering van een antilichaammolecuul. Laan 2 showed een controle antilichaam met hetzelfde isotype.

Figuur 1: Serum titratie na immunisatie. De sera van twee muizen werden getitreerd in verdunningen van 1:50 tot 1: 5.000.000 en getest op antigen specificiteit met een ELISA. Als controle serum van een niet-geïmmuniseerde muis werd gebruikt in een verdunning van 1:50. Het antigeen-specifieke signalen werden positief voor zowel geïmmuniseerde muizen en de splenocyten van muis werden gebruikt voor een hybridoma genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Foto's van mono- en Polyklonale hybridomen. Mono- en polyklonale hybridomas werden microscopisch geanalyseerd 10 dagen na celfusie. De foto's tonen de gebruikelijke uitkomst voor stabiele hybridoma cellijnen met monoklonale (A) en polyklonaal (B) eigenschappen. Een schaal bar: 10 micrometer; B schaal bar: 10 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Standaard elutieprofiel van een monoklonaal antilichaam met een IgG1 Isotype. De gegenereerde monoklonale antilichaam werd gezuiverd met proteïne A-gemedieerde affiniteitschromatografie, en het elutieprofiel van een IgG1 antilichaam wordt afgebeeld. De eerste piek geeft de geëlueerde monoklonale antilichaammolecuul bij pH 5,0. De volgende pieken geven pH 3,5 en pH 2,0. De pH vermindering noodzakelijkde kolom van alle stoffen volledig schoon en de kolommatrix komende zuiveringen regenereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Standard SDS PAGE voor een monoklonaal antilichaam met een IgG1 Isotype. De zuiverheid van het antilichaam eluens werd bepaald door Coomassie-gekleurde SDS-PAGE. 5 pg van de antilichaamoplossing werden op L2 en vergeleken met 5 ug van een standaard IgG1 antilichaam in L3 onder gereduceerde omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het genereren van monoklonale antilichamen door hybridoma technologie vereist een intense en gedetailleerde analyse epitoop, vooral met betrekking tot de uiteindelijke toepassing bij het antilichaam de doelstelling moet herkennen. Dit wordt vaak onderschat door de gebruikers en leidt tot antilichamen met zwakke prestaties. Het fusieproces is altijd willekeurig, waardoor het resultaat van specifieke hybridoma's is sterk afhankelijk van de celverhouding en de vitaliteit op dit punt. Na beperkte verdunning, de cellen zijn zeer onstabiel en vereisen strikte controle van celgroei en antilichaamproductie. Deze parameters moeten zorgvuldig worden geanalyseerd bij het oplossen van de methode.

Verdere beperkingen van de techniek omvatten de tijd die nodig is voor het genereren van cellijnen en de selectie van het gewenste antilichaam-producerende cel. Door de tetraploïde set chromosomen na fusie, de cellen zijn zeer instabiel en vervolgens lager worden ingesteld om opnieuw haploïde. Dit zou kunnenleiden tot het verlies van antilichaam genen, waardoor de cellen niet meer antilichamen produceren. Een andere beperking is dat de selectie van het gewenste antilichaam-producerende cellen is gebaseerd op de kweeksupernatant en niet op het gezuiverde antilichaam oplossingen. Daarom is een definitieve karakterisering van het antilichaam, meestal alleen mogelijk na massacultuur van de geselecteerde hybridoma kloon. Daarom is het risico dat het antilichaam niet kunnen werken in de uiteindelijke toepassing is zeer hoog.

Verschillende technologische modificaties, zoals laser-enabled analyse en verwerkingstechnologie (LEAP) ^16, affiniteitsinvangmiddel oppervlakte-(ACSD) ¹⁷ of gel MicroDrop technologie ¹⁸ werden beschreven om de nadelen te omzeilen bij de selectie van geschikte antilichamen. Al deze methoden kunnen verschillende aspecten van hybridoma genereren en selecteren verbeteren, maar de meeste vereisen dure apparatuur of optimalisatie voor elke cel li¹⁶ ne.

Andere verbetering of modificatie die is ontwikkeld in ons lab is een nieuwe strategie immunisatie met chimere virusachtige deeltjes (VLP's), zoals beschreven in Messerschmidt et al ^19. De deeltjes kunnen worden gewijzigd door de gewenste epitoop sequenties ingebed in de virale mantel structuur en gepresenteerd op het oppervlak van deze deeltjes. Dit leidt tot een zeer snelle en specifieke immunisatie na 4 weken in de desbetreffende dieren. De gegenereerde monoklonale antilichamen IgG2 of isotypen IgG1 en zijn afhankelijk van de epitoop selectie zeer specifiek voor de natieve antigeen. We ontwikkelden een specifieke selectiestap voor hybridomacellen door kunstmatige celoppervlak markers. De gebruikte transgene myeloma cellen vertonen een stabiel ingebracht oppervlak marker. Dit oppervlak marker kan worden gebruikt om antigeen of isotype-specifiek gekozen hybridomacellen direct na fusie, zonder beperking van de verdunning en zonder bovenmatige ELISA screening,zoals bij conventionele hybridoma technologie ²⁰ daadwerkelijk noodzakelijk.

Zoals hierboven vermeld, zijn er enkele veelbelovende alternatieven beschikbaar monoklonaal antilichaam generatie die in de toekomst zouden de behandeling verbeteren en de nadelen van de huidige hybridoma technologie beperken. Niettemin zal de procedure altijd nodig om de nadere identificatie van de gewenste epitoop in combinatie met een strenge en zorgvuldig geplande applicatie, zodat de gegenereerde monoklonale antilichaam werkt met succes. Het genereren van monoklonale antilichamen door hybridoma technologie een belangrijke en noodzakelijke stap in de toekomst vanwege de enorme vraag in de wetenschap, diagnostiek en therapie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich	39391-10ML
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
ovalbumin	Sigma Aldrich	A5503
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
Falcon tubes 15 mL	Biochrom GmbH	P91015
reaction vials, 1.5 mL	Carl Roth GmbH & C0.KG	CNT2.1
hollow needle	Carl Roth GmbH & C0.KG	C724.1
glass wool	Carl Roth GmbH & C0.KG	6574.1
Sephadex G25 coarse	Sigma Aldrich	GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	F5881-10ML
ELISA plates, 96 well	Greiner bio-one	655101
neonatal calf serum	Biochrom GmbH	S1025
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Pipette tips 200 µL	Greiner bio-one	739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	Dianova	115-035-003
tetramethylbenzidine	Carl Roth GmbH & C0.KG	6350.2
Natriumdihydrogenphosphat	Carl Roth GmbH & C0.KG	K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4623.3
RPMI 1640	Life technologies GmbH	31870074
L-glutamine	Carl Roth GmbH & C0.KG	HN08.2
beta-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
TC-flask 25 cm2	Peske GmbH	86-V025
TC-flask 75 cm2	Peske GmbH	86-V075
ethanol, 96%	Carl Roth GmbH & C0.KG	P075.1
cell strainer	VWR international	734-0002
Falcon tubes 50 mL	Biochrom GmbH	P91050
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
electroporation cuvette, 2 mm	Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.	EKL2,25
hypoxanthine	Sigma Aldrich	H9636-25G
azaserine	Sigma Aldrich	A4142
thymidine	USB Europa GmbH	22305 1 GM
TC-plates 96 well	Biochrom GmbH	P92696
TC-plates 24 well	Biochrom GmbH	P92424
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
dimethylsulfoxide	Carl Roth GmbH & C0.KG	4720.1
protein A sepharose	Sigma Aldrich	P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1	Carl Roth GmbH & C0.KG	K929.1
unstained protein ladder	BioRad Laboratories	161-0363
comassie brilliant blue R-250	BioRad Laboratories	161-0406