Abstract
Växter kan producera värdefulla substanser, såsom sekundära metaboliter och rekombinanta proteiner. Reningen av den senare från växtbiomassa kan effektiviseras genom värmebehandling (blanche). En blanche anordning kan utformas mer exakt om de termiska egenskaperna hos bladen är kända i detalj, det vill säga, den specifika värmekapacitet och värmeledningsförmåga. Mätningen av dessa egenskaper är tidskrävande och arbetsintensiv, och kräver vanligen invasiva metoder som kontaktar provet direkt. Detta kan minska produktutbytet och kan vara oförenligt med inneslutnings krav, till exempel, inom ramen för god tillverkningssed. Att ta itu med dessa frågor, var en icke-invasiv, kontaktfria metod utvecklats som bestämmer den specifika värmekapacitet och värmeledningsförmåga av en intakt växt blad i ungefär en minut. Metoden innefattar applicering av en kort laserpuls med definierad längd och intensitet till ett litet område av denblad prov, vilket orsakar en temperaturökning som mäts med en nära infraröd sensor. Temperaturökningen kombineras med kända blad egenskaper (tjocklek och densitet) för att bestämma den specifika värmekapaciteten. Värmeledningsförmågan beräknas sedan baserat på profilen för den efterföljande nedgång temperaturen, med värmestrålning och konvektiv värmeöverföring beaktas. De tillhörande beräkningar och kritiska aspekter av provhantering diskuteras.
Introduction
Den storskaliga bearbetning av biologiska material kräver ofta värmebehandlingssteg, såsom pastörisering. Utrustning för sådana processer kan utformas mer exakt om de termiska egenskaperna hos de biologiska materialen är väl karakteriserade, inklusive den specifika värmekapaciteten (Cp, s) och termisk konduktivitet (λ). Dessa parametrar kan bestämmas lätt för vätskor, suspensioner och homogenat av kalorimetri en. Däremot kan mäta sådana parametrar i fasta prover vara arbetsintensiv, och kräver ofta direkt kontakt med provet eller ens dess förstörelse 2. Till exempel, fototermiska tekniker kräver direktkontakt mellan provet och detektorn 3. Sådana begränsningar är acceptabla under livsmedelsförädling, men är oförenliga med strikt reglerade processer såsom produktion av biofarmaceutiska proteiner i växter inom ramen för god tillverkningssed 4. jagn ett sådant sammanhang kan behövas upprepas (t.ex. veckovis) övervakning av termiska egenskaper under en sju veckors tillväxtperiod för enskilda anläggningar som en kvalitetskontroll verktyg. Om en sådan övervakning skulle kräva och konsumera ett blad för varje mätning, skulle det inte finnas någon biomassa kvar att bearbeta vid tidpunkten för skörd.
Dessutom, med användning av endast bladdelar i stället skulle orsaka sårskada till produktionsanläggningen och öka risken för nekros eller patogen infektion, återigen minskar processutbytet. Sannolikheten för patogen infektion kan också öka om en metod med direktkontakt till provet skulle användas, vilket inducerar en risk för att en hel sats av växter kan infekteras genom kontakt med en kontaminerad sensoranordning. Liknande aspekter måste beaktas för övervakning av anläggningen betonas som torka, t ex i en ekofysiologiska sammanhang. Till exempel är vattenförlusten ofta övervakas av en förändring i den friska biomassa, vilket kräver en invasiv Treatment av växterna under utredning 5, till exempel, dissekera ett löv. I stället bestämma den specifika värmekapaciteten, vilket beror på vattenhalten i ett prov, på ett icke-invasivt sätt som beskrivs här, kan användas som en surrogatparameter för vätskestatus växter. I båda fallen (läkemedelsproduktion och ekofysiologi) skulle artificiella spänningar som induceras av destruktiva eller invasiva mätmetoder vara skadliga eftersom de kan snedvrida experimentella data. Därför tidigare rapporterade flash metoder 6 eller placeringen av prover mellan silverplåtar 7 är olämpliga för sådana processer och experiment eftersom de antingen kräva direktkontakt med provet eller destruktiv. Parametrarna c p, s och λ måste bestämmas för att utforma processutrustning för en blanche steg som kan förenkla produktrening och därmed minska tillverkningskostnaderna 8-10. både cp, s och λ kan nu snabbt bestämmas genom beröringsfri oförstörande nära infraröd (NIR) laser sondering på ett konsekvent och reproducerbart sätt 11 och denna nya metod kommer att förklaras i detalj nedan. De resultat som erhölls med denna metod har framgångsrikt används för att simulera värmeöverföringen i tobaksblad 12, vilket gör att konstruktionen av lämplig processutrustning och valet av motsvarande parametrar såsom blanchetemperaturen.
Metoden är enkel att installera (Figur 1) och har två faser, mätning och analys, som var och en består av två viktiga steg. I mätningsfasen, tas ett prov blad först lokalt värms upp av en kort laserpuls och den maximala provtemperaturen registreras. Temperaturprofilen för provet registreras därefter under en tid av 50 s. I analysfasen, blad egenskaper såsom densitet (lätt och noggrant bestämmas genom pyknometrisk measurement) kombineras med den maximala provtemperaturen för att beräkna c p, s. I det andra steget, är temperaturprofilen bladet används som ingång för en energibalans ekvation, med ledning, konvektion och strålning i beaktande, för att beräkna λ.
Detaljerade steg-för-steg-instruktioner finns i protokollenheten, expanderar på innehållet i den medföljande videon. Typiska mätningar sedan visas i resultatdelen. Slutligen fördelar och metodens begränsningar lyfts fram i diskussionsavsnittet tillsammans med potentiella förbättringar och nya ansökningar.
Figur 1: Apparat som användes för att bestämma blad termiska egenskaper. A. Fotografi av mätapparaten som används för att bestämma den specifika värmekapacitet och värmeledningsförmåga på leaves. De perifera enheter (datorer, oscilloskop) visas inte. B. Schematisk representation av mätapparat. Lasern och ansluten utrustning är markerade i rött, är NIR detektor för temperaturmätning som visas i lila, är provbladgrönt och fotodiod effektsensorn är blå. C. Ritning av de delar av mätningen setup med samma färgkod som i B. storlek bar indikerar 0,1 m. D. Skärmdump som illustrerar de typiska elementen i laserstyrprogram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. växtodling och Provberedning
- Spola varje mineralull block med 1-2 L avjoniserat vatten och därefter med en L av 0,1% [m / v] gödselmedelslösning. Placera en tobak (Nicotiana tabacum eller N. benthamiana) frö i varje block och försiktigt spola med 0,25 liter gödsel lösning utan att tvätta bort utsädet.
- Odla plantorna i 7 veckor i ett växthus eller fytotron med 70% relativ fuktighet, en 16-timmars fotoperiod (180 | imol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) och en 25/22 ° C ljus / mörker temperatur regimen.
- Flytta växterna till mätningsapparaten. Om växterna är orörliga, skörd enstaka blad för mätning av termiska egenskaper.
2. Bestäm Leaf tjocklek och densitet
- Bestäm bladtjockleken
- Bered en 2% [m / v] agaros-lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ochAutoklavera den. Låt lösningen svalna till 40 ° C och bädda in ett blad placerades provet i en Petri-skål. Stelna agarosen genom att placera petriskål i ett kylskåp vid 4 ° C under 30 min.
- Skär agarosen blocket i 200-im skivor med hjälp av en vibratome med ett rakblad skärvinkel av 15 °. Använda en skärhastighet på 1,0 mm s -1 och en amplitud av 0,5 mm.
- Mount fem tvärgående bladsektioner på en glasskiva med hjälp av cyanoakrylat som ett fixativ. Bestäm blad tjocklek under ett mikroskop med en 20 x objektiv och ett okular med 10 gångers förstoring med hjälp av mätinstrument som är inbyggda i mikroskop programvaran enligt tillverkarens anvisningar.
- Bestäm bladtjocklekarna i provområden utan ådror.
- Alternativt, fastställa vilken bladtjocklek med en uppringd lastprofilen på en ven fritt område av bladet bladet. Se till ratten-gauge hålls vinkelrätt mot planet för bladet bladet.
cautioN: cyanoakrylatbaserat är hudirriterande och kan även limma fingrarna tillsammans om de inte hanteras med omsorg.
- Bestäm bladtäthet
- Bestäm tommassa (m 0) av en torr pyknometer, sedan fylla den med vatten och bestämma massan igen (m 1). Torka pyknometern helt, placera ett blad inuti och bestämma massan (m 2) en gång till. Med bladet inuti, noggrant fylla pyknometern med vatten och bestämma massan (m 3).
- Beräkna bladdensiteten (Ps) med användning av ekvation 1.
Ekvation 1:
3. Bestäm Spectral transmission och reflektion av löv
- Placera ett blad i provkammaren av en UV / VIS-spektrofotometer genom att fastställa det mellan provhållande klämmor. För transmissionsmätningar, placera bladet framför Det ector. För reflektion mätningar placera bladet på baksidan av detektionskammaren.
- Lansera spektrofotometern styrprogram. Välj ett spektrum från 900 nm till 1600 nm. Starta en ny skanning och registrera värdena för transmission (μ T) och reflektion (μ R) som visas av UV / VIS-spektrofotometer programvara, baserat på den spektrala kurvan.
- Utför alla mätningar med åtminstone tre biologiska replikat. Öka antalet biologiska replikat till fem eller fler om kan man räkna med en heterogent prov kvalitet, dvs variation i bladytan morfologi och tjocklek.
- Beräkna effekten för sändning (P T) och reflektion (P R) genom att multiplicera den uppmätta μ T eller | i R-värden av den uppmätta lasereffekten P Laser enligt ekvationerna 2 och 3.
Ekvation 2:ftp_upload / 54.835 / 54835eq2.jpg "/>
Ekvation 3:
OBS: Transmissionen kan också bestämmas med en fotodiod sensor under mätningen (se 6.3).
4. Ställ in mätapparaten
- Montera en fiberkopplade enkel bar NIR diodlaser (våglängd = 1550 nm) i en kon 25,4-mm diameter på en rostfritt stål hållaren. Anslut en styrenhet för att ställa in uteffekten (P Laser) av NIR laser till 4-6 W.
- Placera en bi-konvex lins med en brännvidd av 25,4 mm vid änden av könen för att justera strålknippets bredd till 13 mm.
- Placera en fotodiod effektsensorn 354 mm under botten av linsen. Sedan dämpa fotodioden genom att placera ett neutralt densitetsfilter med en optisk densitet av 1,0 och en 22-mm keramiskt skikt ovanför sensorn.
- Ansluta fotodioden effektsensorn till ett oscilloskop med hjälp av en koaxialkabel.
- Anslutaen 10 x 10 cm ram, som har en 6 x 6 cm provexponeringsområde med ställningen av mätningen installationen på en höjd av 308 mm under linsen (Figur 1). Fixera bladet position i rymden genom att montera in den i 10 × 10 cm ram.
- Anslut en NIR-detektor till en persondator med hjälp av en universal serial bus (USB) kabel och installera gränssnittet programvara för detektorn.
- Placera detektorn vid en 45 ° vinkel i förhållande till laserstrålen 135 mm över det keramiska skiktet. Rikta in mätområdet för detektorn till laserpunkten på provet genom att variera sensor position och vinkel tills den maximala temperatursignalen observeras.
- Använda lasern för styrgränssnittet programvara för att justera utgångslasereffekt till 5 W och varaktigheten av laserpulsen till 0,5 s. Välj "Strömreglering" kommando i kontrollalternativ fönstret under den grafiska representationen av lasereffekten och justera lasereffekten genom att skriva "5" i & #34, Effekt [W] ". Fält Justera laserpulslängd genom att skriva" 0,5 "i" Time [s] "fältet.
- För att bestämma den absoluta lasereffekt för varje uppsättning av experiment, byt ut fotodiod effektsensorn med en termisk yta absorbereffektsensorn vid slutet av varje uppsättning av experiment och mäta laser uteffekt för 20 s utan ett prov.
5. Förbered bladprover
- Använd intakta och oskadade blad för mätningarna.
- Om det är relevant för utredningen, härma typiska bladskador typer av piercing bladet med en skalpell, gnugga blad mellan latexhandskar, exponera bladet till en öppen eld eller en laserstråle för 2-3 s, eller använda andra tekniker för att simulera andra typer av skador.
- Försiktigt men snabbt montera provet blad mellan provhållande klämmor.
6. Ta Temperaturmätningar
- Undvika direkt kontakt mellan bladet och det keramiskadämparen placeras ovanför fotodiod sensorn för att förhindra artificiell värmeöverföring som stör beräkningen av c p, s och λ (se avsnitt 9).
- Använda temperaturmätning programvara för att samla temperaturprofilen för provet blad för totalt 60 s via NIR-detektor. Först registrera baslinjen temperatur under 10 s, sedan aktivera laser för 0,5 s och fortsätta datainsamling för 49,5 s.
- Starta en mätning genom att klicka på "Mätning" och sedan "Ny mätning". Efteråt klicka på den gröna pilen ovanför den grafiska representationen av den termiska profilen. Spara temperaturprofilen genom att klicka på "Spara" ikonen (en stiliserad skiva) ovanför den grafiska representationen av profilen.
- Kontrollera den överförda lasereffekt med hjälp av fotodiod effektsensorn genom att beräkna skillnaden i signal för mätningar med och utan ett prov blad med ett oscilloskop anslutettill fotodioden effektsensorn via en koaxialkabel (Figur 2).
- Bestämma höjden på de två flankerna (f 1, S och f 2, S) i spänningsprofilen förvärvas med oscilloskopet.
- Upprepa mätningen utan en prov blad som referens (f 1,0 f 2,0). Beräkna överföring μ T som förhållandet mellan dessa mätningar enligt ekvation 4 (se även figur 2).
Ekvation 4:
Figur 2: Mätning blad överföring med hjälp av en fotodiod effektsensorn. A. Typiska spänningsprofil för en referensexperiment utan ett prov blad visualiseras med ett oscilloskop. B. spänningsprofilmed ett prov blad monterat i anordningen. I båda fallen, är den utsända lasereffekten är proportionell mot var och en av de två flankerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Beräkna den specifika värmekapaciteten för Leaf Sample
- Beräkna den maximala skillnaden AT [K] temperatur under laserpulsen genom att subtrahera rumstemperatur T 0 [K] från den maximala bladtemperaturen T ma x [K] (ekvation 5).
Ekvation 5:
- Beräkna den energi som absorberas av ett löv (E S [J]) utifrån den effektivlasereffekt och laserpulslängd (ekvation 6), där P R [W] är den reflekterade lasereffekt och P T [W] är den utsända laser kraft.
Equation 6:
- Beräkna massan hos den upphettade bladyta (m S [kg]) med användning av Ekvation 7, där d S [m] är bladtjocklek enligt 2,1), r Laser [m] är radien hos laserpunkten, V S [ m 3] är den uppvärmda blad volym, och ρ S [kg m -3] är bladdensiteten enligt 2.2).
Ekvation 7:
- Beräkna c p, s [J kg -1 K -1] enligt ekvation 8 genom att dividera den absorberade energin E S med produkten av den uppvärmda bladyta massan m S och maximitemperaturskillnaden AT.
Ekvation 8:
8. Förbered temperaturprofilen Data för Thermal Konduktivitet Beräkningar
- Använd "Export" kommando av NIR sensorstyrprogram för att exportera tid och temperatur rådata som en * .dat-fil och öppna filen i ett kalkylblad processor.
- Applicera ett: 100 datareduktion, t ex med användning av en "OM (MOD (Value; 100) = 0;" x "," 0 ")" kommandot, vilket resulterar i en datatäthet av en datapunkt per 0,1 s.
- Beräkna den genomsnittliga baslinje temperaturen T B [° C] för varje temperaturprofilen över de initiala 10 s av en mätning, under vilken lasern var fortfarande avstängd. Då, beräkna skillnaden mellan T B och den faktiska omgivningstemperaturen T 0 [° C].
- Använd denna skillnad att individuellt normalisera varje profil genom att flytta det till T 0 (y-normalisering), t ex om T B - T 0 = 2,0 K, sedan subtrahera 2,0 K från varje värde temperatur i temperatur profile (figur 3A).
- Normalisera tidskoordinaten för varje temperaturprofil (x-normalisering) genom att ta bort varje datapunkt innan den maximala provtemperatur (Tmax) och tilldela nya tidsvärden som börjar med t = 0 för T max (figur 3B).
- Skärmen varje profil för plötsliga temperaturvariationer, dvs temperaturskillnader som är mer än tre gånger baslinjen ljudnivå, vilket är typiskt 3 × 0,31 K ≈ 1,0 K. Ta bort dessa regioner från datamängden, eftersom de motsvarar mätningen artefakter (Figur 3C ).
- Montera en exponentiellt avtagande funktion (ekvation 9) till data med hjälp av ett kalkylblad processor, där T t [K] är monterade blad provtemperaturen vid tiden t [s], T 0 omgivningstemperaturen, A [K] är amplituden och t 1 [s] sönderfallskonstanten (Figur3D).
Ekvation 9:
- Använd monterade funktion för att beräkna temperaturen nedgång i provet blad 0-80 s efter laserpulsen.
- Omvandla temperaturdata som uppmätts i [° C] till [K] skala genom att lägga till ett värde av 273,15 till varje temperaturdata punkt (figur 3E).
Figur 3: system databehandling för beräkningen av λ. A. Efter datareduktion, temperaturprofilerna är normaliserade till den omgivande temperaturen. B. Därefter alla datapunkter innan den maximala provtemperaturen (T max) bort. C. Mätning artefakter (visas i "inkonsekvent" datamängd) identifieras utifrån den temperatur skift större än thREE gånger baslinjen buller och avlägsnas från dataset före montering på en exponentiell funktion. D. Celsiustemperaturskalan omvandlas till Kelvin skalan. E. För varje tidsintervall, är λ beräknas baserat på temperaturprofilen. F. Ett fönster av 20 s definieras i som kan observeras en relevant temperaturförändring. G. Baserat på den valda tidsfönstret är genomsnittet och standardavvikelsen beräknad för λ. H. Representativa resultat för två olika N. tabacum bladprover. Orange pilar och linjer indikerar effekten av motsvarande processteg på de presenterade data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
9. Beräkning av värmeledningsförmågan hos Leaf Prov
- Beräkna temperaturen differeiou mellan provblad och miljön för varje 0,1-s-intervallet enligt ekvation 10, där AT x [K] är temperaturskillnaden, är T t [° C] den monterade bladprovtemperaturen och T 0 [° C] i omgivningstemperatur (fig 3E).
Ekvation 10:
- Antag att nedgången i temperatur beror på den kombinerade effekten av konvektiv värmeöverföring, värmestrålning och värmeledning. Använd motsvarande energibalans (ekvation 11) som ligger till grund för beräkningen av λ, där AE Temp [J] är skillnaden i värmeenergi av provet vid två på varandra följande tidpunkter, AE rad [J] är energiskillnaden på grund för värmestrålning, är AE conv [J] energiskillnaden på grund av konvektiv värmeöverföring, och Δ, E dir [J] är energiskillnaden på grund av värmeledning.
Ekvation 11:
- Ersätt de allmänna villkoren i energibalansen med den faktiska fysiska egenskaper som ger ekvation 12, där AT t [K] är skillnaden i monterat blad provtemperaturen, ε den enhetslös emissions, σ [kg s -3 K -4] Stefan -Boltzmann konstant, A rad [m 2] området värmestrålning, h [J s -1 m -2 K -1] den konvektiva värmeöverföringskoefficienten, A omv [m 2] området konvektiv värmeöverföring, A dir [m 2] området värmeledning och l [m] den karakteristiska längden.
Ekvation 12:
- Beräkna characteristic längden l baserat på korrelationen: l = V / A.
- Använda den uppvärmda provvolymen V S och tvärsnittsarean av provet blad för att beräkna A [m 2]. Tvärsnitts bladyta motsvarar A cond enligt ekvation 13, där A cond är det område där överföring, vilket sker, r Laser är radien för den laserpunkt och d s är bladtjockleken.
Ekvation 13:
- Beräkna en rad och A konv enligt ekvation 14, där A Laser är det område av laserfläcken.
Ekvation 14:
- Suppleant Ekvationer 9, 12 och 13 i ekvation 11 och lösa det senare för λ, vilket ger ekvation 15 där t Laser är than laserpulslängd [s].
Ekvation 15:
- Antag ett värde av 0,94 för ε och beräkna λ för varje 0,1-sekundersintervall under de första 20 sekunderna av temperaturprofilen. Genomsnitt 200 värden för λ som erhållits på detta sätt och beräkna standardavvikelsen (Figur 3F - H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mätning av Leaf Properties
Användning av ovanstående mikroskopiska metoden, en bladtjocklek av 0,22-0,29 x 10 - 3 m bestämdes för både N. tabacum (0,25 ± 0,04 x 10 - 3 m, n = 33) och N. benthamiana (0,26 ± 0,02 x 10 - 3 m, n = 24), vilket ligger väl inom 0,20-0,33 x 10 - 3 m intervall tidigare rapporterats för bladen av olika växtarter 3. Att bestämma tjockleken med en fjärrmätare gav värden av ~ 0,28 x 10-3 m (n = 10), vilket var inom en standardavvikelse av resultaten från den mikroskopiska mätning. Således kan ratten spåriga mätning att föredra framför den mikroskopiska metoden för tjockleksbestämning i rutin applikationer som det var lättare att tillämpa ochresultaten för Cp, s och ʎ avvek mindre än 10% från mer arbetsintensiv teknik. Densiteten N. tabacum och N. benthamiana blad var 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), vilket matchar 631-918 kg m - 3 intervall tidigare rapporterats för blad i andra arter 3.
Beräkning av den specifika värmekapaciteten
Temperaturprofiler som samlats in för Nicotiana arter visade en snabb ökning under tiden för laserpulsen tills maximal temperatur (T max) uppnåddes inom mindre än 1 s. Efter pulsen, minskade temperaturen exponentiellt tills den nådde omgivande temperatur (T 0) (Figur 3A - E). Den specifika värmekapaciteten (c p, s -1 K -1 för N. tabacum och 2252 ± 285 J kg -1 K -1 för N. benthamiana. Två odlings inställningar och varaktig användes för varje arter (se avsnitt 1.2), men detta påverkade inte c p, s (Figur 4). Emellertid c P, S-värden minskade linjärt från den gamla (botten) till unga (överst) blad (R 2 = 0,85) i fallet med N. tabacum (Figur 4A), vilket korrelerade till vattenhalten [gg -1 biomassa] som hade bestämts som skillnaden mellan våt biomassa vid tidpunkten för skörd och massan efter 72 h inkubation vid 60 ° C 11. Denna korrelation mellan vattenhalt och specifik värmekapacitet var i överensstämmelse med tidigare observationer av andra författare 13. Ett omvänt samband observerades för N. benthamiana (R2 = 0,79), där skillnaden mellan de specifika värmekapaciteter av blad av olika mognadsgrad (botten = gamla, topp = ung) var endast 13% jämfört med 21% för N. tabacum. Denna skillnad kan ha sitt ursprung i det faktum att vattenhalten i blad av N. benthamiana är nästan konstant under de olika grader av blad mognad 11. En känslighetsanalys visar att skillnader i Cp, s var proportionell mot fluktuationer i mätparametrarna i ekvation 8. Effekten av den reflekterade och överförs lasereffekt var sub-proportionellt, eftersom dessa parametrar var inte individuella faktorer i ekvation 7. Följaktligen effekten av fel i dessa två parametrar var mindre än de som orsakas av fluktuationer i lasereffekt eller omgivningstemperatur. I allmänhet gjordes mätningen anses vara robusta, eftersom alla parametrar involverade i beräkningen av Cp, hade ar en koefficienten variation på mindre än 10% (figur 4C och D).
Figur 4: specifik värmekapacitet och värmeledningsförmåga värdena bestäms för N. tabacum och N. benthamiana. A. Specifik värmekapacitet och värmeledningsförmåga N. tabacum lämnar enligt bladet position på plantan (botten = gamla löv, mitt = mogna blad, top = unga blad). Stjärnor och trianglar indikerar växter som var 49 och 56 dagar gammal, respektive. B. Specifik värmekapacitet och värmeledningsförmåga av N. benthamiana leaves enligt bladet position på anläggningen. Stjärnor och trianglar indikerar växter som odlades i en fytotron eller växthus, respektive. C. Känslighet av specifik värmekapacitet värden för förändringar i inparametrarna. triangles visar specifik värmekapacitet värden från en ökning med 10% (röd, uppåt) eller minskning (blå, nedåt) i enkla modellparametrar. D. Känslighet av termiska konduktivitetsvärden för förändringar i inparametrarna. Trianglar markerar sko värmeledningsförmåga värden från en ökning med 10% (röd, uppåt) eller minskning (blå, nedåt) i enstaka modellparametrar. Felstaplar i A och B indikerar standardavvikelsen (n≥3), medan i C och D representerar de komplett sortiment av värden som erhållits under 10% variation känslighetsanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Beräkning av den termiska konduktiviteten
Värmeledningsförmågan (ʎ) beräknades från de temperaturprofiler efter exponentiellbeslaget (fig 3) i kombination med ekvationer för ledande och konvektiv värmeöverföring såväl som termisk strålning. Ekvation 15 gav medelvärden av 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) för N. tabacum och 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) för N. benthamiana. Det fanns ingen korrelation mellan ʎ och växt ålder eller odling inställning, även om en korrelation mellan blad ålder och ʎ observerades för N. benthamiana (Figur 4B), överens med tidigare rapporterade åldersberoende skillnader i andra växtarter 14. Som diskuterats ovan, vatteninnehållet var en osannolik orsak till denna skillnad, eftersom det visade sig vara homogen över blad av varierande mognad för N. benthamiana. I stället vi spekulera i att förändringar i lEAF vävnad, t ex, cellväggssammansättning, var ansvariga för denna observation genom att ändra värmeöverföringsegenskaperna av bladen och därmed påverka värdet av ʎ. Bestämningen av ʎ var känslig för förändringar i omgivningstemperaturen. En känslighetsanalys visar att variationer på ± 2,3 K förändrat värde ʎ med 64-125%. Enligt ekvation 15, har den omgivande temperaturen en effekt av makt fyra på värmestrålning och därmed direkt påverkar värdet på ʎ.
Utvärdering av Mätapparaten
Det var möjligt att ställa in mätningsenheten inom 3 timmar. När detta var fullständig, uppstartningstiden för systemet var ca 15 min per mätserie. Enstaka mätningar tog mindre än tre minuter, inklusive provberedning och hela mätningscykeln. Analys av tiden laserexponering visade att ettupphettningstid av 0,5 s resulterade i en ökning med 19,9 ± 4,3 ° C temperatur (n = 55) var den bästa kompromissen mellan den höga AT (uppnås genom långa laserpulser) som erfordras för ett bra signal-till-brusförhållande (SNR) och den låga AT (uppnås genom korta laserpulser) som krävs för att undvika vävnadsskada. Pulsvaraktigheter som är längre än 0,5 s resulterade i förlusten av massa från provet, vilket troligen återspeglar avdunstning av vatten och / eller skador på bladvävnad som provtemperaturen nådde upp till 70 ° C, medan endast 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) observerades för 0,5 s laserpulser. För löptider på mindre än 0,5 s, temperaturen buller på ± 0,31 K (standardavvikelse, n = 25) svarade för mer än 5% av AT och var därmed en betydande del av AT. I kontrast, vid 0,5 s bullret utgjorde endast 2,5% av signalen och således betraktas som obetydlig. Dessutom gjorde proverna inte värma upp till mer än ~ 45 ° C, vilket ären temperatur som tobaksplantor kan också utsättas för i den naturliga tropiska till subtropiska livsmiljö och som är bara till skada för växtarter som finns i tundramiljöer 15. Effekttätheten hos lasers var 170 kW m -2, medan naturlig solstrålning är typiskt i området av 1,0 till 1,4 kW m -2 16,17. Men på grund av den mycket korta tiden för puls, detta högre dos energi hade nog inte skada bladvävnaden som indikeras av en nyligen publicerad mikroskopisk analys 11. Temperaturdata som används för att beräkna ʎ var begränsade till de första 20 s efter laserpulsen eftersom endast under denna period gjorde buller (± 0,31 K) svarar för mindre än 5% av provets temperatursignalen och därmed betraktas som obetydlig. När temperaturdata från mer än 20 s tid användes de beräknade värdena för ʎ minskat (Figur 3F). En möjlig förklaring var att vissa av de antagandenVid beräkning av ʎ inte ansöka om låga värden på AT. Speciellt, kan term som beskriver värmestrålning i ekvation 15 har påverkats eftersom den påverkas av den fjärde strömmen av temperaturen. Dessutom kan blad området kring provet kan utsättas för laser har värmts upp något och därför kanske inte ha varit den perfekta kylflänsen antas i modellen att minska den effektiva AT x och slutligen beräknade ʎ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kontaktfria, icke-förstörande mätmetod som beskrivits ovan kan användas för att bestämma Cp, s och ʎ i en samtidig och reproducerbart sätt. Beräkningen av ʎ särskilt beror på flera parametrar som är känsliga för fel. Ändå var effekten av dessa fel antingen linjär eller under proportionella och variationskoefficienten för alla parametrar visade sig vara mindre än 10%. Även om den metod som sålunda kan betraktas som robusta, kan vissa tekniska förbättringar göras för att minska de återstående felkällor.
Montering av provet i anordningen var tekniskt utmanande eftersom en platt blad ytan är att föredra för mätning men provet har naturligtvis en vågformig yta. Detta problem kan övervinnas genom att utforma en dedicerad provhållare med geometrier precist justerat till provet blad, t.ex., blad tjocklek och bredd, fastklämning av provet i föredrarkunna orientering. Detta tillvägagångssätt skulle göra mätningar mer reproducerbar, men skulle äventyra den kontaktfria typen av mätning eftersom ordentlig kontakt mellan provet och innehavaren skulle krävas för att dra bladytan platt. Fördelarna med att använda denna typ av hållare skulle därför bero på sammanhanget av mätningen, dvs., huruvida den precision eller kontaktfria naturen hos mätningen är viktigast. Däremot kan sådana överväganden inte vara nödvändigt alls för bladen med en i sig plan yta, t.ex., ris och besläktade arter.
Konvektiv värmeöverföring på grund av luftrörelser i miljön av provet bör hållas till ett minimum under mätningarna eftersom det starkt påverkar beräkningen av både Cp, s och ʎ 18. Apparaten bör därför avstånd från luftströmmar genereras av luftkonditioneringssystem, radiatorer eller annan utrustning, såsom datorer medintegrerade kylfläktar. Detta är också viktigt eftersom förändringar i den relativa vatteninnehåll av bladen 19 som kan uppstå före eller under mätningen på grund av avdunstning, vilket kan ökas genom luftrörelser 20, inte redovisades i modellen. Således mätningar, särskilt med fristående blad, bör utföras snabbt som beskrivs i protokollet avsnitt för att undvika fel under datainsamling. I framtiden, kan effekterna av indunstning på mätningen minskas eller undvikas om mätningen utförs i en åtminstone delvis sluten mätkammare med en genomförd fuktreglering.
Riktigheten i c p, s och ʎ värden kan ökas genom att mäta de parametrar som används i de motsvarande ekvationerna mer exakt. I fallet med c P, S dessa parametrar är den lasereffekt, högsta och omgivande temperatur och provvolymen, dvs produkten av laser plats område och tjocklek, och samplingstäthet (ekvation 8). De två sistnämnda parametrar måste bestämmas i experiment som åtföljer den aktuella mätningen och deras tillförlitlighet kan förbättras om flera representativa biologiska replikat testas. Men även när en enkel uppringd gauge mätning användes skillnaden i blad tjocklek jämfört med en mikroskopisk analys var endast 11%, vilket påverkade de beräknade värdena för Cp, s och ʎ av samma grad. I motsats härtill kan temperaturer och lasereffekten övervakas under hela mätningen. Noggrannheten av Cp, kan s förbättras om dessa online-data används i stället för fasta värden för lasereffekt och omgivningstemperatur, och data samlas in med hjälp väl kalibrerade sensorer. Dessa överväganden gäller även ʎ, men den omgivande och provtemperaturer är de viktigaste parametrarna eftersom båda påverkar det beräknade värdet av kraften i fyra.
Den aktuella beräkningen av ʎ baserades på flera antaganden om konvektiv värmeöverföring och värmestrålning. Till exempel var den emissions (ε) och konvektiva värmeöverföringskoefficienten (h) inte mäts eller beräknas explicit i metod som presenteras ovan, utan härrör från tidigare publikationer 18,21. Riktigheten i ʎ kunde därför förbättras genom att bestämma dessa två parametrar under de verkliga mätförhållanden. Men med hjälp av litteraturdata för beräkningar ändå gav ʎ värden som låg inom intervallet experimentellt bestämd för andra växtarter för vilka likartade egenskaper kan förväntas på grund av sin fylogeni till Nicotiana arter och deras fysiologi, det vill säga, örtartade växter 3. Även om värdena för ε och h varierades över hela området som tidigare rapporterats för dessa värden i växter, t ex 0,93-0,98 för ε 21, var deras effekt på det slutliga värdet av ʎ <10% och därmed inom den naturliga variationen observerats här.
Den metod som presenteras ovan var inte bara kunna bestämma de termiska egenskaperna hos intakta oskadade blad och fristående blad, men det också identifierat olika typer av mer allvarliga skador infördes avsiktligt före mätning korrekt. Därför kan olika typer av bladprover lätt skiljas, vilket ger ett verktyg för att ta bort, före analys, några dåliga prover som skulle ge uppgifter låg kvalitet. Denna funktion kan användas för kvalitetskontroll vid övervakning av biologiska material, t.ex. prover inte uppfyller specifikationerna i termer av Cp, s och ʎ kan uteslutas från vidare behandling. Detta skulle vara en tillgång i samband med en starkt reglerad processer såsom molekylärt jordbruk 4.
Fördelarna med denna nya metod jämfört med andra ilitteraturen innefattar den snabba hanteringen prov, minimal beredning, kontaktfria och icke-förstörande samtidig mätning av c p, s och ʎ, samt användning av gemensam utrustning som kan hittas i många optiska laboratorier. Detta kommer att underlätta bredare tillämpningar av förfarandet jämfört med de som kräver specialiserade och dyrbara anordningar, såsom differential scanning kalorimetrarna. Dessutom kräver kalorimetri direkt kontakt med provet 22 så det finns en risk för skador, och metoden är vanligtvis begränsad till mätning av specifik värmekapacitet 22. I motsats, medan värmekameror kan upptäcka nekros eller fysiska förändringar i löv eller hela växter i en beröringsfri sätt 23, kräver också komplicerad bildanalys och särskilda specialiserade enheter 24 som kan övervinnas i framtiden genom billigare och mer kraftfulla IR-kameror och tillhörande kringutrustning. Spektralanalys är en annan kontakt-free metod för analys av vattenhalten och klorofyllnivåer 25, men det har ännu inte använts för att bestämma specifik värmekapacitet och / eller värmeledningsförmåga.
Mätningsmetoden redovisas här är en robust metod för att bestämma de termiska egenskaperna av växtblad med låga investeringskostnader och korta mättider. Det var framgångsrikt använts för att bestämma Cp, s och ʎ i N. tabacum och N. benthamiana, två arter som är relevanta när det gäller molekylärt jordbruk 4. De beräknade värdena för båda parametrarna baserade på bladtemperaturprofiler var i god överensstämmelse med de som tidigare rapporterats för andra växtarter 3. Metoden är icke-förstörande, kontaktfritt, och inte kräver komplicerad provberedning, vilket ger fördelar i förhållande till alla aktuella alternativa metoder för analys av termiska egenskaper. Den enkla konstruktionen kan också underlätta utvecklingen av hand held enheter för att öka flexibiliteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" tube | Thorlabs | SM1L10E | Tube for fiber holder |
| Agarose | Sigma Aldrich | A0701 | Agarose |
| Bi-Convex lense f=25.4 | Thorlabs | LB1761 | Lense |
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | Thorlabs | PM100D | Console for thermal surface absorber sensor |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO7104 | Oscilloscope |
| DMR light microscope | Leica | n.a. | Light microscope |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-2 | Pycnometer |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Fiber holder | Thorlabs | Fiber holder | |
| Forma -86 °C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Infrared Detector Optris CT | Optris | OPTCTLT15 | Infrared detector |
| Infrared Detector Software Compact Connect | Optris | n.a. | Control software for infrared detector |
| Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer | PerkinElmer | L1050 | UV/VIS Spectrophotometer |
| Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module | DILAS | M1F-SS2.1 | Laser |
| Laser cover | Amtron | LM200 | Laser Cover |
| Laser Driver | Amtron | CS 408 | Laser Driver |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Photodiode sensor | Thorlabs | PDA20H-EC | Power sensor for transmission measurements |
| Precision weight Ohaus Analytical Plus | Ohaus | 80251552 | Precision weight |
| Sample frame | Fraunhofer ILT | n.a. | Fixation of the leaf sample |
| Software Pyro Control | Amtron | n.a. | Laser Power Control Software |
| Stainless-steel-holder | n.a. | n.a. | Holder for measurement set-up |
| Teflon plates 2 cm | Fraunhofer ILT | n.a. | Teflon attenuation |
| Thermal surface absorber Power sensor | Thorlabs | S314C | Sensor for laser power measurements |
| Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome |
| Zoc/Pro 6.51 | EmTec Innovative Software | n.a. | Laser Control Software |
References
- Wilhelm, E. Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. , Royal Society of Chemistry. 516 (2010).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).
- Jayalakshmy, M. S., Philip, J. Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature. International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Schuster, A. C., et al. Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures. AoB PLANTS. 8, (2016).
- Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity. J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).
- Hays, R. L.
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts. J. Vis. Exp. , Under review (2015).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Tödter, N., Wehner, M. Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing. J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Hedlund, H., Johansson, P. Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants. Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).
- Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation. Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).
- Larcher, W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. , Springer Science & Business Media. (2003).
- Cowen, R. A gamma-ray burst's enduring fireball. Science News. 152, 197 (1997).
- Jones, H. G., et al. Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field. Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).
- Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives. Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).
- Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves. Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).
- Jones, H. G., Schofield, P. Thermal and other remote sensing of plant stress. General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).
- Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. Radiation measurement for plant ecophysiology. J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).
- Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues. Fuel. 115, 644-651 (2014).
- Chaerle, L., et al. Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue. Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).
- Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry. J. Agron. Crop. Sci. , 415-429 (2012).
- Yuan, L., et al. Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects. Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).
