Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Abstract

Hücre içi antimikrobiyal aktivite ve ökaryot hücre sitotoksisite geleneksel önlemler uç nokta deneyleri güveniyor. Böyle uç nokta tahlilleri gibi hücre erimesi, koloni oluşturan birim tespiti veya reaktif ilave olarak okunmasını önce birkaç ek deneysel adımlar gerektirir. Örneğin, yüksek verimli bir tarama sırasında deneyleri binlerce gerçekleştirirken, tahliller, bu tür için gerekli alt çaba dikkate değerdir. Bu nedenle, yüksek verimli bir antimikrobiyal keşif kolaylaştırmak için, eş zamanlı olarak hücre içi bakteri büyümesine nin inhibitörlerini teşhis etmek ve ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için gerçek zamanlı bir tahlil geliştirilmiştir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı olarak, hücre içi bakteri büyümesi tespit bakteriyel lux operon'u ^(1. nesil tahlili) ya da floresan protein muhabir ^(2. nesil dik deney) ya da bakteriyel bir tarama suşları işaretleyerek sağlanmıştır. Toksik olmayan, hücre zan-geçirgen olmayan, nükleik asit bağlayıcı bir boyaAyrıca makrofaj ilk enfeksiyon sırasında ilave edildi. Bu boyalar, canlı hücreler dahil edilmemiştir. Ancak, cansız konakçı hücreler girişi ve nükleer DNA floresan etiketleme (deoksiribonükleik asit) izin membran bütünlüğünü kaybeder. Özellikle, DNA, konakçı hücre ölümünün bir çözelti bazlı okunmasını sağlar flüoresan kuantum verimi büyük bir artış ile ilişkili bağlama. Bu mikro-biçiminde bir yüksek girdi boyunca araştırma yapmak ve mikroskopla hücre büyüme ve sitotoksikliğinin değerlendirilmesi için bu kombine tahlili kullanılmıştır. Özellikle, antimikrobik birlikte uygulanır, iki ya da daha çok antimikrobik maddenin kombine etkisi ayrı uygulandığında daha büyük olan sinerji sergileyebilir. Farklı konsantrasyonlarda antibiyotik kombinasyon permütasyon değerlendirilmesi gerektiğini gibi hücre içi patojenlere karşı in vitro sinerji Test normalde olağanüstü bir iştir. Ancak, bizim gerçek zamanlı tahlil otomatik, dijital dağıtım teknolojisi p ile kombine bulunduuyduruk sinerji testi ermitted. Bu yaklaşımları kullanarak, sistematik hücre içi patojen Legionella pneumophila karşı karşıya antimikrobiyal çok sayıda eylem ve birlikte anket başardık.

Introduction

Hücre içi bölümlerinde geçici büyümek veya ikamet patojenler terapötik tedavisi zordur. Zorlayıcı yada nispeten gibi Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp gibi hücre içi patojenler zorunlu. Francisella tularensis ve Mycobacterium spp. genellikle aylar hatta yıllar arasında değişebilir tedavisi için antibiyotik tedavisi ders uzamış gerektirir. Ayrıca, hücre dışı patojenler geçici hücre içi nişler işgal ve bu şekilde antimikrobiyal tedavinin normal kurslar açıklığı kaçmak ve daha sonra öldürücü enfeksiyon yeni mermi başlatmak için ortaya çıkabilir. Staphylococcus aureus ¹ ve üropatojenik Enterobacteriaceae ^2,3 enfeksiyonları iki giderek tanınan örneklerdir. Bu nedenle, temel bir ilaç keşif hedefi hücre içi bölmelere nüfuz yeni antimikrobiyal tespit etmektir. Optimal tedavi hızla ortadan kaldırmak içinhücre içi organizmalar ve alt önleyici antimikrobiyal maruz kalma yoluyla direnç gelişmesini önlemek, özellikle tercih edilir.

Bu amaçla, biz modeli patojen Legionella pneumophila hücre içi büyüme hedefleyen hücre içi sızan antimikrobiyallerin tanımlamak için bir yüksek verimli bir tarama teknolojisini geliştirdi. ⁴ Önceki klinik gözlemler, standart antimikrobiyal duyarlılık testi doğru bu organizmaya karşı in vivo terapötik etkinlik tahmin etmediğini göstermektedir. Bu β-laktamlar ve aminoglikozid olarak antimikrobik temel sınıfları, aksenik biçimde yetiştirilen Legionella karşı son derece etkili olmasına rağmen, yeterli Legionella bulunan hücre içi nüfuz çünkü ⁵ Özellikle, bu oldu. ^5,6 Daha sonra delil teknik olarak daha karmaşık hücre içi büyüme analizleri etkili bir klinik etkinliğini tahmin önerdi. ⁷

Bu nedenle, hücre içi bakteri büyümesine, gerçek zamanlı saptanması için teknoloji geliştirilmiştir. ⁶ Bu bakteriyel kromozoma ⁴ ya da floresan proteini (daha önce tarif edilen, birinci kuşak deneyi) ya da bakteriyel lusiferaz operon ⁸ entegrasyonu ile modifiye edilmiş bir bakteri suşu kullanılarak ⁹ muhabir (burada tarif edilen ikinci kuşak, dik deney) gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde, ışık veren veya flöresanlı bir sinyal bakteriyel sayısının bir taşıyıcı, gerçek zamanlı olarak okunmasını sağlar.

Ancak, bu nitelikler hücre içi infectio büyük bir karıştırıcı adresi yokn deneyleri, konakçı hücreler üzerinde hedef dışı etkiler. Özellikle, konakçı hücre ölümü doğal hücre büyümesini sınırlar ve antimikrobiyal etki yanlış pozitif bulmaktır. Tarama kütüphanelerinde olduğu gibi birçok bileşik ökaryotik hücre toksik, böyle yanlış pozitif takipte, çözüm için son nokta sitotoksisite deneyleri çok sayıda gerektiren, gerçek antimikrobiyal korkutur olacağını vardır.

Bu durumda, aynı anda ökaryotik hücre canlılığı ve hücre içi büyümeyi değerlendirmek mümkün büyük ilgi olmuştur. Özellikle, canlı olmayan ökaryotik hücrelerin karakteristik hücre zarı bütünlüğünün kaybıdır. hücre membranının geçirgenliği test probları, bu nedenle, hücre canlılığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Daha önce ulaşmak ve ölü hücrelerin nükleer DNA leke putatif hücre zan-geçirgen olmayan, floresan, DNA bağlayıcı boyaların bir dizi becerisi ile karakterize edilir. ⁴ nükleer DNA bağlayıcı, bu boyalar, kuantum bir büyük artışı gösterecektirArka plan çözüm floresan üzerinde artan sinyal sonuçlanan m floresan verim. Bu nedenle, bu boyalar, ökaryotik hücre ölümünün kantitatif okuma sağladı. ⁴ Özellikle, biz birkaç J774 makrofajlar ile uzun süreli işbirliği inkübasyon sırasında kendileri toksik olmayan olduğu bulundu. ilk enfeksiyon sırasında ilave zaman, gerçek zamanlı, mikroskopik bir mikro florimetre ile ölçülür ve gözlemlenebilir ökaryotik hücre ölümünün flüoresan okuması sağlamaktadır.

Bu nedenle, bir bakteri muhabir ve toksik olmayan, zar geçirgenliği olmayan kullanımını birleştirerek, DNA bağlayıcı boyalar, biz bakteri yükü ve aynı zamanda ökaryotik hücre sitotoksisitesini hem ölçmek için basit, tahribatsız, gerçek zamanlı test geliştirmek başardık. Bu deney, US hücre içi büyümesini inhibe etme yeteneği için ~ de dahil olmak üzere fonksiyonel olarak karakterize edilmemiş aktivitesi 250 antimikrobiyal ve> 240,000 küçük molekülleri 384 oyuklu plaka biçiminde ekran ~ 10,000 bilinen biyoaktif maddelerin sağladıLegionella pneumophila, aynı zamanda her bir bileşik için ökaryotik hücre sitotoksisite verileri oluştururken. Legionella hücre içi büyümeye karşı bilinen antimikrobiyal ⁶ Yaptığımız analizler bugüne kadar bu tip en kapsamlı araştırma oldu. ⁶

bir arada kullanıldığında, bizim deney formatının verimliliği göre, aynı zamanda, daha sonra bilinen antimikrobiyal potansiyel sinerjistik etkiler araştırdı. En yaygın sinerji testlerinin bir sözde dama deneyi, standart olarak iki ya da daha çok antimikrobik maddenin iki kat seri dilüsyonları kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi ile gerçekleştirilir. İki ya da daha çok antimikrobik madde, ayrı olarak uygulanan her etkilerin toplamından daha birlikte uygulandığında, bu deneylerde ^10, sinerji daha etkisinin gözlenmesi ile tanımlanır. Unutmayın ki, şimdiye kadar, sadece odaklanmış ve seçici sinerji testi, hücre içi Legionella pneumophila karşı yapıldı

Sinerji testi kolaylaştırmak için, otomatik dijital dağıtım teknolojisi ⁶ ile birlikte bizim gerçek zamanlı hücre içi büyüme / ökaryot sitotoksisite deneyi kullandı. Bu otomasyon DMSO veya sulu bir çözelti tek başına ya da 384-kuyucuklu bir biçimde kombine içinde çözülmüş bileşiklerinin seri seyreltmeleri dağıtmak için izin. ¹¹ Ayrıca, bu tür sağlam sıvı taşıma teknolojisi kolayca daha yüksek çözünürlük gerçekleştirmek için bize izin, kare-kök-iki (yerine standart daha düşük çözünürlük, katlama), iki boyutlu olarak özgüllüğünün yüksek düzeylerine ulaşmak için seyreltme kombinasyonları, dama tahtası sinerji analiz. İki katlı bir seyreltme serisi ¹² kullanırken bu çözünürlük tekrarlanabilirlik ilgili sinerji alanında endişeleri ele özellikle değerliydi. Son olarak, bizim tahlil nicel ve ayrıca therefore inhibisyon geçişleri ölçüldü. Bunun bir sonucu olarak, deney büyüme inhibisyonu benzer olan kombinasyon konsantrasyonları bağlantı isocontours olan isocontour isobolograms içinde eksprese önleyici tüm bilgileri, yakalanan. ⁶ Bu çizim stratejisi kombinatoryal doz-yanıt eğrilerinin görselleştirme sağladı. Bizim metodoloji göstermek için, bu analizleri gerçekleştirmek için bizim protokol tarif ve temsili sonuçlar göstermektedir.

Protocol

1. Gerçek Zamanlı Hücre içi Büyüme ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite Tahlili

1. Hazırlama Konukçu Hücreler (J774A.1 Hücreleri)
   1. % 9 demir takviye buzağı serumu RPMI 1640 içinde süspansiyon kültür J774A.1 Mus musculus makrofaj benzeri hücre. doku kültürü şişelerinde İlk geçit. Hücreler ortam içinde 15 ml 75 cm ² doku kültürü şişesi içinde Biraraya getirilen sonra 15 ml doku kültürü şişesi döndürülür ve 50 mi aktarıldığı ortamı aynı tip, 65 ml kazıma ve seyreltme ile bölünmüş 250 ml'lik bir bakteriyel çalkalayıcı şişeye.
   2. 250 ml ve / veya doku kültür ortamı ile beşte biri hacime kadar doldurulmuş 1.000 mi bakteriyel şişelerinde süspansiyon içinde ölçek büyütme, kültür için. Dakikada yaklaşık 120 devirde dönme hızı ayarlanarak havalandırınız. Istikrarlı büyüme için tam% 5 CO ₂ ve 37 ° C'de inkübe edin.
   3. Bunlar aralığında yoğunluğa ulaşmak Hasat hücreleri 2.5 x 10 ⁶ hücre/ 5 x 10 ⁶ hücre / ml aralığındadır. ölü hücreler sitotoksisite deneylerinde arka plan gürültüsünü artacak olarak,% 25 geçmemesi (en kolay Tripan mavisi ile test) ölü hücre yüzdesini emin olun.
   4. Beyaz levha, doku 384 oyuklu mikro 30 ul doku kültürü ortamında 5 x 10 ⁴ J774A.1 hücre göz başına, kültür-işlemden geçirildi. Deney gününde% 90 izdiham elde etmek için mikro gece boyunca inkübe edin.
2. Hazırlama Işıklı veya Floresan Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (Lp02 :: Flaa :: lüks ⁸⁾ uygun ortamda bakteriler, yani tamponlu kömür maya özütü (BCYE) orta. Bir timidin okzotrofik suşu kullanılarak durumunda, 100 ug / ml timidin ile orta tamamlar. konfluent elde etmek için yeni bir BCYE plaka üzerinde kalın organizmaların yayılması ve (donmuş stoktan ise) (önceki plaka geçidinden ise) bir gün kuluçka ya da iki üç gün ile deneyler için bakteri yamaları hazırlayınbüyüme.
      1. 10 g maya ekstresi, 10 g N çözülmesiyle BCYE tabak hazırlayın - HPO _4- (2-asetamido) -2-aminoetansülfonik asit, 0.35 g K ₂ ve deiyonize su 950 ml içinde 1 g monobazik potasyum α-ketoglutarat. Potasyum hidroksit (11.9 mol çözeltisi ≥2.5 mi) ile pH 6.9 olacak şekilde ayarlanır.
      2. 15 g agar ve 2 g aktif kömür ilave et; 1 L nihai hacme getirmek. Manyetik bir karıştırma çubuğu ve otoklav ekleyin. 55 ° C'ye soğutun, orta ve deiyonize su içinde çözülmüş 0,4 g L-sistein ve 0.42 g amonyum demir (III) sitrat ihtiva eden ilave filtre ile sterilize edilmiş çözeltiler. Petri plakaları dökme önce karıştırmak için mıknatıs karıştırma plakası kullanın.
      3. Aksenik büyüme ortamında L. pneumophila büyüme testi için, kömür dışında BCYE için kullanılan bütün kimyasal reaktifler birleştirerek ACES-maya özü suyu (AYE) hazırlamak ve ağar. Filtre sterilize ve hemen kullanmak, ya da daha sonra deneyler için dondurma.
   2. sa süspanse organizmalarUygun şekilde, 100 ug / ml timidin takviyesi ile J774A.1 hücreler için kullanılan me doku kültürü ortamı.
3. makrofaj Enfeksiyon
   1. (Bakteri üremesi inhibisyonunun ve ökaryotik hücre erimesi açısından tarama bileşikleri ve pozitif ve negatif kontroller) çıkar test bileşiklerinin ekleyin. Tercihen, aracın yeterli seyreltme sağlamak için DMSO (dimetil sülfoksit) veya sulu bir çözelti içinde ≥500x de stok solüsyonları çözülür.
      1. stok çözeltileri donmuş olarak muhafaza edilmesi de, kararsız bileşikler ve antibiyotiklere donma-erime döngülerinden kaçınmak.
   2. Doku kültür ortamı içinde 2.5 x 10 ⁶ CFU (koloni oluşturucu birim) / m ve flüoresan raportör etiketli bakteriler 1.0 x 10 ⁷ cfu / ml hedef ve uygun, toksik olmayan, membran geçirgenliği olmayan nükleik asit- eklemek için ışık yayan bakterilerin seyreltin 2.5x nihai deney konsantrasyonu boya bağlama.
   3. her bir J774A.1 kültür karışımı 20 ul ekle, nihai deney hacmi50 ul nihai bakteri konsantrasyonu 1 x 10 ⁶ CFU / ml (lux operon raportör) veya 4 x 10 10 ⁶ CFU / ml (floresan protein raportör).
   4. % 100 CO ₂ 5% 1-3 gün boyunca 37 ° C'de buharlaşan kenar etkileri önlemek için bağıl nemi inkübe edin.
4. Tahlil Okuma
   1. gazetecilere için uygun olarak bir mikroplaka luminometresiyle ve florimetrede bakteriyel büyüme ve ökaryotik hücre toksisitesini Oku kullanılır.
      1. termal (yaklaşık 10 dakika boyunca ya da kapaklı bir biyolojik güvenlik kabini kapalı olarak) yaklaşık 20 dakika boyunca aralık kapaklı bir laboratuar tezgah üzerinde tek kat olarak yerleştirme öncesinde lüminesans okuma mikropleytin denge, sıcaklık ilişkili kenar etkileri önlemek için.
   2. Daha sonra zaman noktalarında gerçek zamanlı okuma isteniyorsa inkübatör için mikropleytin dönün.

2. Veri Analizi

1. Pozitif ve negatif con veri normalleştirmekTrols ökaryotik hücrelerin hücre içi bakteriyel büyüme ve yüzde sitotoksisite için yüzde veya kat-engellenmesini hesaplamak için.
2. _P + _n u u | 3 (σ _P + σ _n) / - deney sağlamlığını değerlendirmek için, = 1 'Z analiz Z-faktörü (Z)' kullanılarak bakteri büyümesi inhibisyonu ve sitotoksisite hem de pozitif ve negatif kontroller arasındaki istatistiksel ayırma hesaplamak |. Bu denklem, σ _p ve σ _n, sırasıyla pozitif ve negatif kontrol kuyuları, standart sapmaları göstermektedir; μ _p ve u _n, sırasıyla, pozitif ve negatif kontrol kuyuları için ortalama değerlerdir.
   1. yüksek verimli tarama deneyleri için, ilgi konusu test bileşiklerinin etkilerini değerlendirmek için standart z değerleri (ya da diğer bir alternatif, kantitatif istatistiksel ölçümleri) hesaplar. Alternatif olarak, basit bir kat azalma hesaplamak veya daha alakalı potansiyel fizyolojik olarak azalma kat log geometrik kopyalayan bakteriler için etki büyüklüğü ölçüsü.

3. Tek ve Çok boyutlu (yani, Sinerji) Doz-yanıt Test ve Veri Yorumlama

1. Protokol 1. bölümde tarif edildiği gibi makrofajların ve bakteri hazırlayın.
2. Hemen önce enfeksiyon veya aksenik inkübasyon (yani minimal inhibitör konsantrasyon veya MIC) ve düşük yüksek ucunda yayılarak amacı ile, seyreltme serisi iki katına, bir seri tamamen büyümeyi ortadan kaldıran bir konsantrasyon deneysel ilgi antimikrobiyal eklemek belirgin bir aktivite gösteren bir son konsantrasyona.
3. üreticinin protokolüne göre bir antimikrobiyal dilüsyonları doğrudan otomatik ilavesi ile tek doz-yanıt ve kombinatoryal sinerji testi kurulumu kolaylaştırmak için otomatik bir sıvı taşıma sistemi kullanın.
4. Örneğin, alt-katlama seyreltileri kullanılması düşünülebilir841 / 54841eq1.jpg "/> - seyreltme serisi katlayın ve tahlil verilerinin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği artırmak için çoğaltır.
5. Makrofaj Enfeksiyon için, ışık yayan bakterilerin doku kültür ortamı içinde 2.5 x 10 ⁶ CFU (koloni oluşturucu birim) / ml hedef seyreltin. Her bir J774A.1 kültür, nihai deney hacmi 50 ul, nihai bakteri konsantrasyonu, 1 x 10 ⁶ CFU / mL karışımın 20 ul ekle; ve% 100 nispi nemde,% 5, 37 ° C'de _CO2 inkübe edin.
   1. Aksenik büyüme testi için, hay ortamı içinde, 1 x 10 ⁶ CFU / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar ışık yayan bakterilerin seyreltilmesi 384 oyuklu plakanın her oyuğuna 50 ul% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de inkübe % 100 nispi nemde.
6. Bakteri büyümesini inhibe antimikrobiyal kombinasyonlar için fraksiyonel inhibitör konsantrasyonu endeksi hesaplayın. Bakteriyel g tam veya>% 99 inhibisyon ile sonuçlanır kombinasyon halinde her bir ilaç (a, b,. n.) içinrowth, (FIC _{A, B, n,...),} ayrı ayrı, kesirli önleyici konsantrasyon hesaplanması aşağıdaki gibidir: FIC _a = bileşiğinin konsantrasyonu "bir" minimal inhibitör konsantrasyonu ile bölünen, "a" tek başına. _. Sonra birleştirici FIC indeksi hesaplamak veya vb FIC _b hesaplamak, aynı formül kullanılarak FIC FIC _a + _b + FIC =. . Her bir inhibitör kombinasyon için .FIC _n.
   1. sinerjiyi değerlendirmek için 1.0 ila uzağa sapma kombinatoryal endeksi kullanın. tutucu bir sinerjistik etkinin göstergesi ve ≥ 4, bir antagonist etki olarak ≤ 0.5 bir kesim düşünün. ¹²
   2. Konu, isobolograms isocontour isobolograms ve / veya isosurface kombinasyon etkileri ⁶ alternatif grafik temsilleri isobolograms.

Representative Results

Mikrolevha hücre büyüme deneyi

Şekil 1 tahlil adımlarını diyagramları. gösterilen otomatik adımlar elle yapılabilir. Ancak, verim büyük ölçüde sıvı taşıma sistemleri kullanılarak kolaylaştırılır.

Şekil 2, bir 384 gözlü mikroplaka, çift okuma, gerçek zamanlı hücre içi büyüme ve (Lp02) ya da lux operon (Şekiller 2A, 2B) ya da mNeptune2 floresan protein ile işaretlenmiş Legionella suşu (ökaryotik hücre sitotoksisite tahlili temsilcisi sonuçları göstermektedir Şekil 2C, 2D) muhabiri. Pozitif ve negatif kontrol bileşikleri (DMSO, antibiyotikler, saponin), bir yüksek verimli bir tarama ortamda performansını taklit etmek için bir pim aktarım robot kullanımı ile plakalara ilave edildi. önemli Legionella (Şekil 2A, 2C), sırasıyla, mNeptune2 etiketli bakteriler için ışık yayan bakteriler için 24 ila 72 saat ve 48 ila 72 saat sonra, saponin liziz ve antibiyotik ile tedavi edilen kontrollere kıyasla kolayca ayırt edilebilir. Legionella genellikle 48 ila 72 saat boyunca kopyalayan sonra konakçı hücreleri lyses. Bu, zaman içinde SYTOX Green (temsilcisi geçirgen olmayan, nükleik asit bağlayıcı boya ve bir ev sahibi hücre ölümü belirteci) artmış floresan gösteren Şekiller 1b ve 1d, takdir edilebilir. Sitotoksisite sonunda deterjan (saponin) gözlenen maksimum miktarda, konak hücre parçalama, pozitif kontrol ulaşır. mNeptune2 etiketli organizmalar genellikle daha hızlı bir konakçı hücre öldürme için hesap, lux operon etiketli bakteriler daha dört kat daha yüksek bir aşı olarak ilave edildi ve daha önce mNeptune2 deneylerde flüoresan sinyalinde bir artış ilişkiliydi. , Etkili antibiyotik tedavisi (levofloksasin veya azitromisin) prev beklendiği gibihem bakteriyel büyüme ve konak hücre parçalama şubenin kiralama. Bunun aksine, konakçı hücrenin yok edilmesi suretiyle hücre içi büyüme sınırlı sitotoksik bileşikler (örneğin, saponin) kolay bir şekilde düşük bir parlaklık ve mNeptune2 floresan ve yüksek sitotoksisite ilişkili sinyalinin bir kombinasyonu ile tespit edilebilir. Ayrıca, kombine lüminesans ve mNeptune2 floresan (bakteriyel büyüme), hem de azalma ve sitotoksisite gözlem bir bileşik gerçek hücre içi büyüme inhibitörü olması makul güven sağladı (örneğin, azitromisin ve levofloksasin pozitif kontroller) yerine birlikte sahte parazitin yol yanlış pozitif daha bakteriyel muhabir sinyali.

Tablo 1-3 temsilci üç farklı bakteri gazetecilere için Z '(lux operon'u, mNeptune2, tdTomato) ve kontrollere gelen floresan okumaları göreceli gösterir. A dan Z ye '> 0.5 Statistica gösteriryüksek verimli ayarları için Lly sağlam tahlil uygun; Bununla birlikte, düşük Z ', deney amaçları, örneğin, güvenilir bir test bileşikleri veya düzensizlikler daha çok ya da daha az ince etkilerini ayırt yeteneğine bağlı olarak uygun olabilir. Şekil 2'de elde edilen sonuçlara göre, mNeptune2 bakteriyel lusiferaz operon kadar hassas bir raportör değildi. Bu nedenle, beklendiği gibi, güçlü bir negatif olarak mNeptune2 sinyali arasındaki fark, (DMSO) ve pozitif (levofloksasin, azitromisin, saponin) büyümesini önleyici kontrol aksine, inkübasyon günde 2 ya da 3 kadar gözlenmemiştir erken, lux uygun güçlü bir sinyal enfeksiyon sonrası 1. günde operon raportör bakteri. Bunun aksine, tdTomato, alternatif bir bakteriyel flüoresan raportör enfeksiyöz boyunca optimal Z 'göstermiştir. Suboptimal flüoresan özellikleri tdTomato s uygun okuma için kullanılan aralık içinde floresans uyarma ve emisyon kuyruk varlığından kısmen atılanignal. Bu aşma levofloksasin karşılaştırma karşı tdTomato saponin bulunan pozitif Z 'den takdir edilebilir (bakteri çoğaltmak değil nereye iki koşullarda bakteri sayısında önemli bir fark ima). Bu sonuç, kuyruk tdTomato emisyon olarak tespit edilir ve bu nedenle saponin ve antibiyotik kontroller arasında sahte bir farka neden olan güçlü bir floresan sinyali neden saponin liziz ile açıklanabilir. floresan ile kombinasyon halinde bakteriyel lux ve mNeptune2 muhabir en azından daha fazla matematik sinyal dekonvolüsyon olmayan, çift-okuma, solüsyon bazlı, gerçek zamanlı deneyleri, tdTomato ve floresan kombinasyonu için kullanılabilir görünür iken, bu nedenle, değildir.

Şekil 3, daha önce lux operon'u, raporter etiketli organizmalar kullanılarak bilinen antimikrobiyal doz-yanıt eğrilerinin örnekleri yayınlamıştır. ⁶ Özellikle, Legionella yapardoku kültürü ortamında büyümez. Bu nedenle, makrofaj enfeksiyon deneylerde bakteri çoğaltma sadece hücre içi büyüme gösterir. (- (2-asetamido) -2-aminoetansülfonik asit N) maya özütünün Ancak, Legionella sıvı ACES, özel, düşük sodyum aksenik biçimde artacaktır. Hücre içi ve aksenik büyüme üzerindeki Burada ²⁰ etkileri karşılaştırıldı. Bu iki büyüme sistemleri kullanarak, örneğin β-laktam (meropenem, seftriakson) ve aminoglikozid (veriler gösterilmemiştir) gibi polar antimikrobik hücre büyümesinin düşük inhibitörleri aksenik büyüme üzerindeki potansiyel etkilerini tersine olduğu görülmektedir. Muhtemelen makrofaj enfeksiyon deneyleri fakir etkinliği hücre içi Legionella replikatif niş erişmek için bir yetersizlik dayanmaktadır. Bunun aksine, örneğin kinolonlar (levofloksasin) ve azitromisin gibi ökaryotik hücre nüfuz antimikrobik, hem hücre içi ve aksenik bakteriler üzerindeki potansiyel etkilerini göstermiştir.

IC50 ve tespit edilebilir CC ₅₀ (% 50 ökaryotik hücre ölümünü indükleyen konsantrasyon), ve seçicilik, CC ₅₀ / _IC50 hesaplanmıştır (konsantrasyon% 50 bakteri büyüme inhibisyon için). Her üç önlemler ilaç keşif çabaları bileşik ilerlemesi için önemli bir kriterdir. Şekil 4, bir antibiyotik doksisiklin yanıt olarak, ikili, doz-tepki eğrileri, bir örneğini göstermektedir, zaman içinde aynı tarama kuyu elde edilen veriler. Şekil 4A'da, enfeksiyon 1. günde, yaklaşık yüz kat bakteriyel replikasyon antibiyotik ile gözlenen inhibisyon en yüksek seviyeleri ile karşılaştırıldığında, sıfır antibiyotik test kuyuları belirgindir. Çok yüksek doxycy haricinde en az ilişkili ökaryotik hücre toksisitesi olduCline konsantrasyonları (≥10 ug / ml). 2. günde (Şekil 4B) üzerinde, bakteriyel lux sinyali yaklaşık olarak, düşük antimikrobik konsantrasyonlannda gözlemlenen önemli bir bakteriyel replikasyon ilişkili sitotoksisitesi gün 1 daha fazla 10 kat fazladır. Beklendiği gibi, bakteriyel replikasyon kaynaklı konakçı hücre ölümü antimikrobiyal doz-yanıt eğrisi boyunca bakteri sayısı (lux sinyali) ile yakın izler. yüksek antimikrobiyal konsantrasyonlarda sitotoksisite flüoresan bazlı sitotoksisite ölçümleri ile karşılaştırıldığında biraz daha yüksek antimikrobiyal konsantrasyonlarda doğru lüminesan doz-cevap belirgin vites biraz abartılmıştır 1. günde gözlemlenen doksisiklin daha toksik görünür çok yüksek konsantrasyonlarda kadar, taban indirgenir günlük ve doğrusal ölçekler, üzerinde lüminesans ve sitotoksisite komplo yaparken, sırasıyla gösterildiği gibi. CC ₅₀ ila yaklaşık 10 ug / ml iken bakteri büyümesi için _IC50, yaklaşık olarak 100 ng / ml olmuştur 50 ile uyumlu lökosit soyunun doksisiklin tedavisi HL-60 hücre hattı için daha önce tarif edilen. ^21. Bu nedenle, bu çift okuma deneyinde belirlenen genel seçiciliği yaklaşık 100 idi.

Şekil 5, daha önce antimikrobiyal ikili kombinasyonları, hücre içi L. pneumophila karşı geliştirilmiş etki için test edildiği iki boyutlu sinerji testlerle ilgili isocontour isobolograms yayınlamıştır. ⁶ Her ne kadar standart isobolograms tamamen isocontours kullanarak engelleme benzer seviyelerde olan noktaları bağlamak için, mevcut sayısal inhibitör verilere dayanarak, biz seçti, büyümesini engelleyen antibiyotik düşük kombinasyon konsantrasyonlarını bağlayın. Bu diyagramlar sağ en isocontour standart izobologram çizgiye tekabül eder. Konkav isobolograms Genel olarak, sinerji gösterir dış bükey isobolograms generall iseY kayıtsızlık veya antagonizmini gösterir. Sinerji (panel AC) ve ilgisizlik örnekleri, sırasıyla <0.5 ve ≥1, bir FIC endeksi değerlerine karşılık gelen, bu durumda, (DF) 'da gösterilmiştir. ⁶

Not, azitromisin, minosiklin ve rifampisin ikili kombinasyonlar sinerji göstermiştir. Şekil 6'da ^6'da gösterildiği gibi nedenle, bu maddeler, üç yollu kombinasyon halinde birlikte test edildi. Burada yüzey bakteriyel hücre büyüme>% 99 inhibisyonuna yol açan üç antimikrobiyal düşük kombinasyon konsantrasyonları bağlamak için çizilmiştir. gözlenen konkav şekilli yüzey başına üç boyutlu sinerji düşündürmektedir, önemli bir sinerji etkisi gösteren bir düşük FIC endeksi (0.325) karşılık geldi.

Tablo 1: Z 'lux operon rapor içiner, pozitif ve negatif kontrollerin Legionella enfeksiyon-karşılaştırılması. Z ', Şekil 2A, 2B'de gösterilen veri noktalarına karşılık gelir. Bu tablo Chiaraviglio ve Kirby 2014 ⁴ Olumlu lüminesans Z '> 0.25 modifiye edilmiş siyah zemin üzerine sarı karakterler ile vurgulanır.

Tablo 2: mNeptune2-muhabir, Legionella enfeksiyonu için Z ', - pozitif ve negatif kontroller ile karşılaştırılması. Z ', Şekil 2c, 2d gösterilen veri noktalarına karşılık gelir. Pozitif mNeptune2 floresan Z '> 0.25 kırmızı karakterler ile vurgulanır.

Tablo 3: Z ', tdTomat içinO-muhabir Legionella enfeksiyonu - pozitif ve negatif kontroller ile karşılaştırılması. Pozitif tdTomato floresan Z '> 0.25 kırmızı karakterler ile vurgulanır. SYTOX Green ve tdTomato emisyon üst üste ile ilgili yanlış pozitif Z '> 0.25 yeşil karakterlerle vurgulanır.

Şekil 1: Çift haberci deneyi kurulum Resimli gösterimi. 384 oyuklu tabaklara süspansiyon içinde yetiştirilmiş J774A.1 hücrelerin (A) şarjı. Mikro için ilgi çekici bir bileşik (B) eklenmesi. (C), aynı anda enfeksiyonu ve nükleik asit bağlayıcı boyaların eklenmesi; inkübasyon; ve okuma. Bu incir büyük halini görmek için buraya tıklayınız ure.

Şekil 2: İki, yüksek verimli bir biçimde, hücre içi bakteri büyümesine ve ökaryotik sitotoksisite gerçek zamanlı okuma. Lux operon eksprese Legionella pneumophila ile J774A.1 hücrelerinin hücre içi enfeksiyon sırasında lüminesans (A) ve floresan (B) karşılık gelen sinyalleri. Legionella pneumophila mNeptune2-ifade ile J774A.1 hücrelerinin hücre içi enfeksiyon sırasında flüoresan proteini (C) ve floresan (D) sinyalleri gelir. Dört tedaviler gösterilmiştir: negatif DMSO kontrol ( ); Pozitif sitotoksisite kontrolü, saponin ( ); ve pozitif bakteriyel büyüme inhibisyonu kontrolleri, azitromisin (tion 4 "src =" / files / ftp_upload / 54841 / 54841eq4.jpg "/>) ve levofloksasin ( ). Veri noktaları, yinelenen, 384 oyuklu plakalarda gerçekleştirilir 96 kez tekrarlanan deneyin ortalaması ve standart sapmasını temsil eder. Not Bazı veri noktaları için standart sapma hata çubukları çok az ve bu nedenle veri noktası sembolleri içinde gizli idi. Paneller A ve B Chiaraviglio ve Kirby 2014 ^4'ten değiştirilmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Bir boyutlu, doz-yanıt analizlerin örnek niteliğindeki örnekleri. J774A.1 hücreleri belirtilen çok antimikrobik maddenin iki katlı bir seyreltme serisi Lux operon ifade L. pneumophila ile enfekte edilmiş ve muamele edilmiştir (IaHücre-içi ") halinde beled. Buna paralel olarak, lux operon ifade Legionella as maya özütü ortamında (AYE) aynı nihai konsantrasyona seyreltildi ve ( 'aksenik' olarak adlandırılan), aynı iki kat seyreltme serisi ile işlemden geçirildi. Lüminesans iki gün sonrası bakteriyel aşılama okumak ve antimikrobiyal konsantrasyonuna karşı çizildi. Panel A antimikrobik yaygın Legionella enfeksiyonu tedavi etmek için kullanılır içerir. Panel B, farklı bir makrolit antibiyotik aktivitesini mukayese eder. Panel C değişen ve bazen de hücre içi ve aksenik gücünü zıt antimikrobiyal birkaç farklı sınıfları içerir. Veri noktaları ortalamaları ve durum başına üç ayrı deney kuyuların standart sapmalarını göstermektedir. Bu rakam Chiaraviglio ve Kirby 2015 ⁶ modifiye edilmiş bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Şekil 4: _IC50, CC ₅₀ ve seçiciliği saptanması için bir çift okuma, doz-yanıt deney örneği. hücre içi büyüme ve J774A.1 hücre sitotoksisite üzerinde doksisiklin etkileri gün 1 ve 2 sonrası enfeksiyon saptandı. Veri noktaları ortalamaları ve durum başına üç ayrı deney kuyuların standart sapmalarını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: iki boyutlu sinerji testlerinin örneği. Kombinatoryal seri dilantimikrobik çiftlerinin utions J774A.1 makrofajlarda Legionella hücre büyümesine karşı sinerji için test edilmiştir. Isocontours hatları benzer inhibisyon yüzdesi noktalarını bağlamak. en sağdaki izobologram tam hücre içi büyüme inhibisyonu (> muamele edilmemiş kontroller ile karşılaştırıldığında% 99 lüminesans azalma) ile kombinasyonlar bağlanır ve standart izobologram arsa karşılık gelir. Her grafikte renk kodlu anahtarla tarif olarak gölgeleme yüzde inhibisyonu belirtir. soldan sağa doğru Isocontours karşılık 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, muamele edilmemiş kontroller ile 20, 10, 5, ve% 1 büyümesi görece. Bu rakam Chiaraviglio ve Kirby 2015 ⁶ modifiye edilmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

üç boyutlu bir sinerji tahlilinde Örnek. >% 99 gelişme inhibisyonu ile sonuçlanmıştır azitromisin, minosiklin ve rifampisin düşük kombinasyon konsantrasyonları bir izobologramdır yüzey arsa oluşturmak için bağlanmıştır. Bu rakam Chiaraviglio ve Kirby 2015 ⁶ modifiye edilmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu hücre içi bakteriyel büyüme ve konakçı hücre sitotoksisite eş zamanlı olarak saptanması için gerçek zamanlı analizler açıklanmaktadır. Protokolde birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, sağlam tahlil performansı için, bakteri ve sitotoksisite okumalarla arasında yeterli spektral ayırma olmalıdır. Bu ayırma lusiferaz operon muhabir ve floresan DNA bağlayıcı boyaların kombinasyonlar için esastır. Bununla birlikte, deneyim (Tablo 1-3, Şekil 2), çift kullanımına dayanan, floresan okuyucu örtüşmeyen flüoresan sinyal (örneğin, bir uzak-kırmızı flöresanlı protein raportör ve yeşil bir nükleik asit leke kullanımı) sağlam elde gerektirir çözüm tabanlı veri. Ayrıca, önceki deneyimlerinden, potansiyel mevcut okuyucu optik veya çözüm floresan özellikleri ile ilgili, yeşil veya turuncu emisyon ile sadece DNA lekeleri> 0.5, stron gösteren bir ölçü daha büyük yani kullanılabilir sitotoksisite verileri, Z 'verdig tahlil performansı. ⁴ Bu nedenle, çözüm tabanlı, çift okuma deneyleri biraz gazetecilere kullanılabilir ne açısından sınırlandırılmıştır.

Diğer önemli adım makrofajlar bakteri bulaşmasını oranıdır. Bakteriyel enfeksiyon konakçı hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, çok yüksek bir aşı, erken bir ev sahibi hücre ölümü, bakteriyel bir replikasyon nispeten düşük seviyelerde ve üzerinde çalışılan antimikrobik doğrudan sitotoksik etkilerinin potansiyel gizleme neden olabilir. Uygun enfekte oranı deneysel olarak tespit edilebilir ve çalışma kapsamında, özellikle bakteri suşunun virülans bağlı olabilir. Yaklaşık 1 düşük oranı: 1 iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bu, Şekil 2'de gösterilen ve Tablo 1 Deneyler - çok sayıda enfeksiyon oranları ile yapılan 3 ileride tahlillerinde kullanım için koşulların değerlendirilmesi ve optimizasyonu sağlar. Not, özellikle de Legionella, nat ile bir suş arka plan kullanımı içinively alt konak hücre sitotoksisite (bir flagellin mutant) ⁸ elde edilen yüksek tahlil sağlamlık önemli katkılarda bulunmuştur. Ayrıca, diğer hücre içi dual-okuma tekniği çeviri, patojen-konakçı sistemleri de enfeksiyon protokole ek ayarlamalar gerekebilir. Legionella US sadece hücre içi büyüme artmış bir raportör sinyalini özellik sağlayan doku kültürü ortamı içinde yetişmez. Bununla birlikte, bir çok hücre içi patojenler (örneğin, Brucella) hem hücre ve doku kültürü ortamı içinde değişen oranlarda büyüyebilir. Bu nedenle, ilk enfeksiyon sonrası gentamisin tedavi ve ev sahibi hücrelerin yıkama gibi başka adımlar hücre dışı çoğaltma azaltır ve hücre içi çoğaltma kapasitesine seçici olarak incelenmesini sağlamak için gerekli olabilir. ²²

yüksek verimli tarama ve sinerji testlerde kullanılmak için deney ölçek büyütmeli sorunları kendi grubu ile ilişkilidir. En çok özelliklely, gerekli J774A.1 hücrelerinin büyük bölümü en iyi bakteriyel yerine, geleneksel doku kültür şişeleri (Şekil 1 e bakınız) kültürlenebilir bulmuştur. Ancak, kültür kısırlık korumak için, bu şişeler için sünger köpük ya da diğer filtre kapakları standart bakteri şişesi kapakları tercih bulundu. Standart bir doku kültürü inkübatör içinde küçük bir yörünge çalkalayıcı platformu Yerleştirme yandan ekipman ile ölçek büyütme kültürünü gerçekleştirmek için bize izin verdi. Son olarak, otomatik dağıtım sistemlerinin kullanımı (Şekil 1A, B) büyük ölçüde tahlil kurulum ve birleştirici seyreltme serisinin test kolaylaştırdı.

Özellikle, bakteriyel bir replikasyon yeterli tespiti yeterince ilgi bakteri suşunun bir lux operon'u veya floresan proteinini eksprese edebilme kabiliyetine dayanır. Bu amaçla, fa izin vermelidir güçlü yapısal promotör tarafından sürülen fluoresan lux operon raportör transposon bir dizi oluşturdukbakterilerin çeşitli türleri işaretlenmesi Cile (Kang ve Kirby, veriler gösterilmemiştir). Seçenek olarak ise, hücre içi olan çoğaltma konakçı hücre sitotoksik kanıtlamaktadır patojenler için, tek başına gerçek zamanlı sitotoksisite ölçümleri, hücre içi çoğaltma için bir vekil olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu durumda, sitotoksik ve inaktif bileşikler tek tahlilde güvenilir ayırt edilemez.

gerçek zamanlı okuma üzerinden durumu yüksek verimli tarama deneyleri için özel bir avantaj sağlar. Özellikle, bakteriyel büyüme (koloni oluşturan birim tayini) ⁷ ve sitotoksisite (testin bitiminde hücre canlılığı reaktifi ilave) ^23,24 birkaç deneysel adımlar ve ilgili emeği ortadan kaldırır son nokta değerlendirmesinin kaçınma. Ayrıca, zaman içerisinde kolaylıkla deneysel çaba çok az bir artış ile aynı deney oyuğu içerisinde takip edilebilir. Önemlisi, bakteriyel çoğaltma gazetecilere iki farklı tipte kullanılabilirliği (bakteril lux operon ve floresan protein) yüksek verimli bir tarama deneyi, gelişimi için özel bir öneme sahiptir. Özellikle, lüks operon veya floresan raportör çıkışı ile sahte parazitin yol yanlış pozitif antimikrobiyal okuma sırayla tamamlayıcı dik primer ve sekonder taramada deneyleri, sırasıyla ²⁵ hem gazetecilere kullanımı yoluyla ele alınabilir. Özellikle, bakteriyel lux operon bir kabaca 20 kat bakteriyel büyüme daha duyarlı muhabir olduğunu öğrendim bizim floresan protein gazetecilere daha düşük saptama sınırı 100 kat. Ancak, lüks çıkışı birkaç gen ürünlerinin ve ışık çıkışı için gerekli adımlara dayalı daha yanlış pozitif olasılığı tabidir. ^26. Daha spesifik olarak, ökaryotik tek gen lusiferaz gazetecilere aksine, bakteriyel lux operon lusiferaz alt-tabaka endojen sentezi için iki bileşenli bir lusiferaz enzimi ve genlerin kodlayan beş gen kümesi. it wouldYeterli hassasiyeti sağlamak için birincil bir ekran lux operatörü raportör dolayısıyla kullanımı mantıklı ve ikincil deneylerde floresan protein muhabir özgüllük sağlamak.

Birlikte ele alındığında, açıklanan metodoloji bakteriyel replikasyonu ve ökaryotik sitotoksisite ölçmek için deneyler uç nokta gerçek zamanlı, tahribatsız alternatifler sunar ve bu nedenle hücre içi patojenlere antimikrobiyal etkileri değerlendirmek için bir metodolojik basit ve çok yönlü bir yöntem temsil eder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 μl is insufficient to compensate for settling — increase to 80 μl
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 µl
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1,000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.