Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה ההתאוששות מורפולוגי של נוירונים תוקנו במהלך הקלטות אלקטרו באמצעות מילוי biocytin ו postprocessing immunohistochemical שלאחר מכן. אנו מראים כי חלקים עבים המלאה biocytin כי היו מוכתמות coverslipped ניתן restained עם ימים או חודשי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן.
Abstract
קלטות אלקטרו של תאים באמצעות טכניקת מהדק התיקון אפשרו לזיהוי סוגי נוירונים שונים המבוססים על דפוסי ירי. הכללת biocytin / Neurobiotin ב האלקטרודה ההקלטה מתירה פוסט הוק התאוששות של פרטים מורפולוגיים, אשר נחוצים כדי לקבוע את arborization הדנדריטים ואת באזורים אליהם מכוונים את האקסונים של הנוירונים המוקלטים. עם זאת, בהתחשב בנוכחות של נוירונים דומים מורפולוגית עם זהויות הנוירוכימיים ברורות ופונקציות, מכתים immunohistochemical עבור חלבוני תא מסוג ספציפי חיוני לזהות נוירונים באופן סופי. כדי לשמור על קישוריות רשת, חלקים במוח להקלטות פיסיולוגיות ערוכים בעובי של 300 מיקרומטר או גדולים יותר. עם זאת, עובי זה לעתים קרובות מעכבת postprocessing immunohistological עקב בעיות עם חדירה נוגדן, דבר המחייב את resectioning של הרקמה. Resectioning של פרוסות הוא אמנות מאתגרת, לעתים קרובות Resulטינג אובדן רקמות המורפולוגיה של התאים שמהם נתוני אלקטרו הושגו, עיבוד הנתונים שמישים. מאז ההתאוששות של מורפולוגיה תגביל אובדן נתונים ומדריך בבחירת סמנים עצביים, אימצנו אסטרטגיה של מחלים מורפולוגיה התא הראשון, ואחריו immunostaining משנית. אנחנו מציגים גישה מעשית biocytin המילוי במהלך הקלטה פיסיולוגיים immunostaining סדרה נוסף של ההתאוששות של מורפולוגיה, ואחריו restaining סעיפים כדי לקבוע את הזהות הנוירוכימיים. אנו מדווחים כי הקטעים היו מלאים biocytin, קבועים עם paraformaldehyde (PFA), מוכתמים, ו coverslipped ניתן להסיר restained עם ימי נוגדן ראשוניים שניים לאחר מכן. restaining זה כולל הסרת coverslip, כביסה הפרקים, פתרון חיץ, ו הדגירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לחשוף את זהותו הנוירוכימיים. השיטה היא יתרון עבור ביטול datהפסד עקב חוסר יכולת לשחזר מורפולוגיה עבור בצמצום סמנים הנוירוכימיים להיבדק המבוסס על מורפולוגיה.
Introduction
המוח ידוע גיוון המאפיינים המבניים ותפקודיים של האלמנטים העצביים הפרט שלה. הבנת התפקידים של סוגי נוירונים ברורים בתפקודי המוח והפתולוגיה דורש אפיון זיהוי חד משמעי של הנוירונים. מבחינה מבנית, תכונות המורפולוגיות המוגדרות לפי מיקום somato-הדנדריטים לקבוע את תשומות פוטנציאל שתא מוח נתון מקבל, בעוד הדפוס של arborization אקסונלית מזהה מטרות postsynaptic פוטנציאליות. המגוון המבני של נוירונים כבר מוערך מאז ימי המחקרים היסטולוגית הזרע של רמון y קחאל 1. הופעתו של טכניקות הקלטת תא בודד עולה כי נוירונים מבחינה מבנית גם להראות הבדלי דפוסי ירי ומאפיינים הסינפטי. המגוון במבנה ופיזיולוגיה בולט במיוחד נוירונים מעכבים GABAergic 2,3. בנוסף, היא הפכה יותר ויותר נראה כי structurallנוירונים דומה y יכול להביע סמנים הנוירוכימיים שונים ולהראות מקביל הבדלים פונקציונליים 4. בדומה לכך, נוירונים עם אותו הסמנים הנוירוכימיים יכולים להיות מבנים נפרדים ופונקציות 5-10. לכן, בפועל, הניתוח של המאפיינים הפונקציונליים של נוירונים ותפקידם הרשת כרוך להגדיר הן זהויות מורפולוגיים הנוירוכימיים. אפילו עם כניסתו של קווי עכבר כתב מיקוד סמנים הנוירוכימיים ספציפיים, זה לעתים קרובות יש צורך לקבוע מורפולוגיה וזהות תת סוג מבוסס על immunohistology 11.
השיטה הסטנדרטית המשמשת לאפיין תאים רשמו פרוסות מוח חריפות היא למלא אותם עם biocytin או Neurobiotin במהלך ההקלטה, לתקן את הסעיפים paraformaldehyde (PFA) בעקבות ההקלטות, ולהשתמש אימונוהיסטוכימיה כדי לחשוף את המורפולוגיה הנוירוכימיה. מאז עובי סעיפים עבור פיזיולוגיה פרוסה הם בדרך כלל 300 מיקרומטראו יותר, כי רוב הנוגדנים מצליחים לחדור לאורך כל הדרך בעומק זה, פרוסות צריך להיות מחדש מחולק ל -60 מיקרומטר או פחות כדי לאפשר immunostaining סימולטני biocytin וסמנים הנוירוכימיים 12-14. למרבה הצער, resectioning מייגע; סיכוני אובדן רקמות במהלך חתך; ויכול להוביל דיפרנציאלי הצטמקות רקמות, שמסבך שחזורים מורפולוגיים. בנוסף, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול לעזור לצמצם את הסמנים המועמדים כי צפוי לבוא לידי ביטוי על ידי התאים. יש לנו שונה פרוטוקולי immunohistology biocytin הסטנדרטיים כדי לאפשר עיבוד סדרה של החלקים ראשונים להתאוששות של מורפולוגיה ואז לזיהוי סמנים הנוירוכימיים פוטנציאליים.
אימונוהיסטוכימיה היא חקרה חלוקת אנטיגן ברקמות או תאים וניתן מדמיינת באמצעות אנזים, תוויות ניאון, יסודות רדיואקטיביים, או חלקיקי קולואיד זהב 15. אני ההליךnvolves באמצעות נוגדנים ראשוניים לתייג ולהגביר ספציפי אחד או יותר אנטיגנים במיוחד, ואחריו שימוש נוגדנים משני ניאון מיקוד הנוגדן הראשוני לשם ויזואליזציה. בשל הצורך להבחין בין ספקטרום הקרינה של כל נוגדנים משני ללא חפיפה, רק מספר מוגבל של אנטיגנים יכול להיבחן בו זמנית. לפיכך, ידע מוקדם של מורפולוגיה יכול להיות שימושי בבחירת סמנים הנוירוכימיים מועמד סיווג התא. מבחינה מושגית, את הרציונל מאחורי עיבוד סדר סעיפים כבר מוכתמים מבוסס על ההנחה כי immunolabeling עבור אחד חלבון או פפטיד אינו אמור להפריע antigenicity ו immunolabeling עוקבת עבור פפטיד עצמאית מבחינה מבנית 16. חוסר ההתערבות זאת בשל הכריכה של נוגדנים על epitope חלבון מסוים על אנטיגן ולכן מאפשר מכתים סימולטני של אנטיגנים מרובים באותו הרקמות. מספר אנטיגנים revealeד על ידי immunostaining הוא מוגבל על ידי צורך ספקטרה שאינה חופפת של נוגדנים משני פלורסנט, בצורך למקד אנטיגנים בודדים עם נוגדנים וגדלו מינים שונים כדי לחסל 17,18 תגובתיות צולבת. אמנם זהו ההיגיון מאחורי הסדרה ולא תיוג סימולטני עם שני נוגדנים ברורים שעשוי אינטראקציה, למיטב ידיעתנו, immunostaining עבור אנטיגן שני לא דווח לאחר השלים immunolabeling עבור אנטיגנים אחד או יותר על חלקים רכובים. כאן, אנו מתארים שיטה immunostaining סדר ויטראז'ים בעבר רכוב חלקים. בעוד אנו בפירוט את התהליך הזה עבור הליך immunolabeling סדר להחלמתם של מורפולוגיה ואחריו מכתים עבור סמנים חלבוניים / פפטיד חלקים עבים, אותם ההליכים ניתן להשתמש בתקן, סעיפים היסטולוגית דקים גם כן. בנוסף, אנו מתארים גישה מעשית למלא נוירונים מוקלטים עם biocytin והתהליך כדי לסלק אתאלקטרודה מהתא עם השלמת ההקלטות כדי לייעל את המילוי של axonal ו סוכות הדנדריטים של נוירונים, כמוצג 6,8 העבודה האחרונה שלנו.
היתרון החשוב ביותר של ההליך המתואר כאן הוא כי המורפולוגיה של התא רשם ניתן לשחזר באופן מלא צלמה לפני שתנסה כריתה או immunostain הפרוסות. למרות בעיות עם החדירה של נוגדנים מסוימים עשויות להבהיר את זה צורך פרוס כריתה עבור immunostaining המשנית, הנהלים המפורטים כאן היו מונעים את הצורך לשחזר נוירונים מורכבים ממקטעים מרובים היה למנוע בעיות עקב אובדן רקמות הצטמקות הפרש, אשר יכולים לסכן את שיקום בעקבות resectioning. יתרון נוסף הוא כי התהליך יהיה להפחית עלויות, זמן, מאמץ, ונוגדנים יקרים ידי הגבלת immunostaining מחדש חתך פרוס שבו מלאה biocytin נוירונים הם התאוששו. ההיבט המעשי ביותר הוא המודעותimmunostaining ditional שניתן לבצע על חודשים מוכתם סעיפים לפני השימוש בטכניקה הנ"ל. בפרט, ההתאוששות של מורפולוגיה תפחית את הפוטנציאל ניכר כי נתונים פיסיולוגיים מתאי נמחקת בשל חוסר יכולת להשיג אפיון מורפולוגי בסיסי של סוג התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מילוי 1. Biocytin במהלך Electrophysiology
הערה: הקוראים יכולים להפנות למקורות חלופיים טכניקות הקלטת תיקון- clamp בסיס מכשור 19-22, אשר לא פרטו על כאן. הצעדים המפורטים כאן להניח כי הציוד והנהלים להקלטות-מהדק תיקון כבר מבוססים, והתיאור יוגבל הפרטים הקשורים biocytin-מילוי immunostaining פוסט-הוק. כל הניסויים שתוארו בכתב היד הזה בוצעו על חולדות.
- באמצעות vibratome, להכין חלקים במוח החי של האזור הרצוי בעובי של 300 - 350 מיקרומטר 23.
- הכן פתרון פנימי המכיל biocytin 0.2% על ידי הוספת 2 מ"ג biocytin ל 1 מ"ל של פתרון פנימי 6. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, sonicate הפתרון הפנימי עבור 10 - 15 דקות עד biocytin מתמוסס לחלוטין. בשלב הבא, לטעון את פתרון פנימי בתוך מזרק 1 מ"ל מצויד עם 0.2 &# 160; מיקרומטר נקבוביות מסנן גודל פוליפרופילן קצה המחובר microloader. שמור מזרק טעינה זה על חפיסה קרה כדי לשמור על היציבות של Mg-ATP ו Na-GTP בפתרון הפנימי.
הערה: כרטיס גלוקונאט אשלגן המכיל פתרון פנימי (126 מ"מ-גלוקונאט K, 4 מ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 4 מ"מ Mg-ATP, 0.3 מ"מ Na-GTP, ו -10 phosphocreatine מ"מ) הוא אופטימלי עבור התאוששות של סמנים הנוירוכימיים מסוימים, כולל parvalbumin, במהלך immunolabeling. מניסיוננו, באמצעות cesium- ופתרונות פנימיים מבוססי כלור מפחיתה את היכולת להתאושש immunostaining עבור סמנים הנוירוכימיים מסוימים. Neurobiotin או תא-impermeant, אפשר לתקן, נותב הקוטב המשלב Alexa Fluorophore עם biocytin יכול לשמש כחלופה biocytin. - תחת התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום, לדמיין את התא המתאים להקלטה. כדי למזער את ההפרעה של האקסון, להתקרב גוף התא על ידי הפחתת פיפטה לאורך צירו באמצעות f "גישה"משיחה זמינה ברוב micromanipulators. להקים כל תא הקלטות תחת התערבות הפרש לעומת אינפרא אדום באמצעות פרוטוקולי פיזיולוגית תיקון- clamp 19-22.
הערה: הימנע מתקרב התא מהכיוון של האקסון המשוערת, כפי שהוא ינתק את האקסון, דמיינו כמו בועה בסוף לחתוך (החץ הירוק באיור 1). כמו כן, להימנע מהפעלת לחץ חיובי גבוה פיפטה ההקלטה בעת שהתקרב התא כדי למזער לשפוך של biocytin, אשר יגרום מכתים רקע גבוה.
איור 1. מוצע מטוס מתקרב תאים עבור Biocytin ממלא. התמונה ממחישה תא גרגיר (GC) מתמלא biocytin במהלך ההקלטה שעובדה לחשוף biocytin (באדום באמצעות streptavidin 594 מצומדות). יש GC דנדריטים שלה מכוונים במישור XY. שים לב תא הגרגיר ניתקהאקסון (חץ ירוק) בשל התנועה פיפטה במישור XY. שים לב הוא אידיאלי להתקרב נוירון זה במישור XZ. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.
- בתצורת מהדק מתח, לקבוע את הקיבול כל התא והתנגדות סדרה בתגובה הקטן (5 mV), קצרות (30 מילישניות) מתח צעדים באמצעות באמצעות בדיקת תפקודי קרום במצב אמבטית רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיה תוכנת ניתוח. פעולה זו תבטיח את בקביעת תנאי הקלטה כל התא כדי לאפשר מילוי biocytin.
- לנהל הקלטות פיסיולוגיות במצב משני שוטף או מתח- clamp לפי צורך. זמן הקלטת מינימום של> 10 דקות ב 34 מעלות צלזיוס הוא אידיאלי.
הערה: ארוכה יותר פעמי הקלטה עשויות להיות נחוצות עבור מחקרים שבוצעו בטמפרטורת חדר. - עם השלמת ההקלטות הפיזיולוגיות, להקים מחדש את התצורה-מהדק תיקון על ידי העברת פיפטה ההקלטה לאט בצעדים קטנים, לסירוגין כלפי מעלה (לאורך ציר ה- Z) וכלפי חוץ (לאורך ציר ה- X) במצב מתח- clamp.
- במקביל לפקח על התנגדות קיבול קלט באמצעות "מבחן קרום" הפונקציה כדי להמחיש את האובדן ארעי קיבולים וקריסת התגובות הקיימות כדי בקו ישר, המציין את מחדש והאיטום של התא ואת ההקמה מחוץ-out- תיקון בקצה פיפטה. החזקת תא פוטנציאל depolarized (-40 mV) תקל על תהליך האיטום מחדש.
הערה: הליך זה להסרת תא בדרך כלל מבטיח התאוששות מלאה של סומה דנדריטים. אל תפעילו לחץ חיובי פיפטה ההקלטה במהלך הליך זה או תוך ניתוק התא מן פיפטה. ויזואליזציה של סומה של התא נרשם הפרוסה מציינת התנתקות מוצלחת. הנוכחות של פסולת הסלולר או תיקון קרום בסוף הקצה המנותק בדרך כלל מצביעה על עקירה של סומה לא תניב מורפולוגיה הסלולר שלמה. - אָחוֹראה ניתוק פיפטה מהתא, לשמר את הפרוסה לתא הקלטה עבור 3 - 5 דקות על מנת להבטיח את התחבורה של צבע כדי הדנדריטים דיסטלי ותהליכים אקסונלית.
- מעביר את הפרוסות לצלחת 24 גם המכילה 4% PFA עבור קיבעון.
זהירות: PFA הוא מסרטנים, וציוד מגן אישי מתאים, כוללים כפפות ומסכת פנים, חייב לשמש כדי למנוע עור לגירוי שאיפה. PFA דליק יש להרחיק מהישג ידם של אש. PFA הוא לא מסולק לטמיון יש לאסוף כפסולת כימית. קיבעון PFA חייב להיות מבודד מאזורים מנוצל להכנת פרוסה חי כדי למנוע זיהום של ההתקנה פיזיולוגיה, כולל טפטפות ההעברה. - 24 - 48 שעות לאחר קיבוע PFA, להעביר את פרוסות 0.1 M פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לאחסון לפני immunostaining.
הערה: באופן אידיאלי, biocytin התאוששות immunostaining הם הטובים ביותר כאשר היא מבוצעת מיד לאחר קיבעון, למרות לכל מכתים נוצר בתוך 7 ד תשואות קיבעון תוצאות טובות. פרוסות יכול להישמר PBS 0.02 - 0.05% אזיד הנתרן מכתים שבוצעו עד ולמעלה מ -90 ימים לאחר קיבוע. למרות קיבעון לילה PFA עובד היטב עבור רוב הנוגדנים, יתכן כי חלק מן הנוגדנים פועלים בצורה הטובה ביותר כאשר משך הדגירה מקבע מצטמצם. קיבוע ב PFA במשך 48 שעות מקטין את זמינות אנטיגנים ומצמצמת את הסיכוי immunostaining משני מוצלח עבור סמנים הנוירוכימיים.
זהירות: אזיד הנתרן הוא מאוד מסוכנים מגרה במגע עם העור או העיניים או על בליעה או שאיפה. יכול לגרום למוות חשיפת יתר חמורה. המסרטנת ו מוטגניות של המתחם אינן ידועות. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים לרבות כפפות, משקפי להתיז, חלוק מעבדה, ומכשיר הנשמה אבק. אזיד הנתרן לא ממומשת ב לטמיון יש לאסוף כפסולת כימית.
(יום 1)
הערה: ההליך immunostaining הבא מיועד סעיפים "פנויות" ודורש רציפה רועד במהירות נמוכה (2 מהפכות / min, סל"ד) על שייקר עבור כל הצעדים הדגירה.
- שטפו את 3x רקמות במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
הערה: 0.1 M PBS ניתן לרכוש מסחרית או המיוצרים במעבדה כדלקמן (עושה 1 ליטר): 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na 2 HPO 4, ו 0.24 גרם של KH 2 PO 4 ב 1 L של dH 2 0.
הערה: אם את הסמן הנוירוכימיים הרצוי ידוע, מכתים עבור חלבון / פפטיד יכול להתבצע בו זמנית עם biocytin מכתים (שלבים 2.2 - 2.4). אם מכתים עבור biocytin בלבד, עבור לשלב 2.5. - בלוק עם 10% חסימת סרום (BS; עז בסרום נורמלי (NGS) מדולל 0.3% Triton X-100 ב PBS עבור 1 ש 'ב RT): אופציונלי.
הערה: כל טוב צריךלקבל את אותו הנפח של הפתרון; הנפח המומלץ הוא בין 250 - 500 μL / טוב. הבחירה של סרום החסימה מבוססת על המינים שבה הנוגדנים משני גדלים (למשל, NGS משמש אנטי עז צבען מצומדות (מיני נוגדן ראשוני בהתאמה)). אם מתעורר הצורך להשתמש נוגדנים משני וגדל מינים שונים כדי immunostain סעיפים, כולל 10% של כל בסרום נורמלי בחסימת צעד (2) ו -3% של כל בסרום נורמלי עבור צעדים הדגירה נוגדנים ראשוניים ומשניים. - (אופציונלי) דגירה מקטעים נוגדן ראשוני, CB 1 R (polyclonal, שפן ניסיונות) עם 0.3% Triton X-100, ו BS 3% ב 0.1 M PBS ב RT O / N. CB 1 R משמש לזיהוי סוג קולטן קנבינואידים 1 הביטוי.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי ולא נדרשים לחשוף את המילוי biocytin. איור 2 מדגים קטע שכותרתו עבור biocytin ו- R CB 1 במהלך תהליך מכתים הראשון. O / N incubation ב RT מספיק עבור רוב של נוגדנים ראשוניים; עם זאת, נוגדנים ראשוניים מסוימים, לרבות R CB 1, דורשים 3 - 5 ד של דגירה. אם הדגירה צריכה להיות יותר מ 1 ד, מומלץ דגירה על 4 מעלות צלזיוס כי טריטון X-100 יכולים permeabilize פרוסות ויכולים לגרום להתפוררות של הרקמה במהלך דגירה ממושכת בטמפרטורת חדר. כלול שליטה שלילית חסרת נוגדן ראשוני בסעיף לפחות אחד מכל סדרה של ניסויים כבקרה את הספציפיות של הנוגדנים משני. עבור פקדים שליליים, הנוגדן הראשוני מושמט, אך 0.3% Triton X-100 ב 0.1 M PBS ו BS מתווספים.
איור 2. מוצלח CCK מכתים 1 שבוע בעקבות השחזור של Biocytin מכתים ו- C annabinoid קולטן מסוג 1 (CB 1 R) - <תיוג> חזק. (A - C) תמונות Confocal ב 60X מראה הנוירון מלא biocytin (א) ו immunoreactivity R CB 1 (ב), שמסומן על ידי ראש חץ. סעיף אותו היה מעובד עבור immunostaining CCK לאחר שבוע 1 (C). השכבה-העל של תמונות מוצגת D. immunoreactivity CCK התגלה באמצעות מרחיקות אדום היה פסאודו בצבע ב ציאן. (E) שיחזור מורפולוגי של התא מלא biocytin בבאור א כי biocytin והכתים CB 1 R ניכרים גם לאחר immunostaining CCK השני. כמו כן שים לב ההתפלגות הצפויה של R CB 1 ודפוסים immunostaining CCK. (F - H) תמונה מוגדלת של האקסון מהתא, כמו A, קרוב תכנית שיתוף לוקליזציה של biocytin ו- R CB 1 אקסונים (ראשי חץ). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר (A - D), 100 מיקרומטר (E), ו -10 מיקרומטר (
(יום 2)
- שטפו את המוח בסעיפים 3x במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
- דגירת המקטעים המצומד צבע אדום streptavidin (ריכוז: 1: 1,000; עירור: 594 ננומטר עם פליטה בספקטרום האדום נראה לעין) BS 0.3% Triton X-100 ו -3% ב 0.1 M PBS ב 4 ° CO / N כהה (עטוף בנייר כסף) כדי לחשוף את biocytin. אופציונליים: כלול נוגדנים משני, חזיר אנטי-גינאה עיזים (ריכוז: 1: 500; עירור: 488 ננומטר ופליטה בירוק), עם הדגירה לעיל אם בעקבות הדגירה העיקרית האופציונלית בשלב 2.3.
הערה: נוגדנים משני יהיה צורך רק אם מכתים נוגדן ראשוני פומבי (שלב 2.3) מתבצע. כדי להמחיש biocytin, streהמצומד ptavidin-fluorophore עם ספקטרום פליטה באדום מומלץ, כפי שהוא עוזר לדמיין אקסונים עדינים בפירוט עם ניגודיות טובה יותר (איורים 1 - 3). במהלך immunostaining הכפולה או משולשת, על מנת למנוע תגובתיות צולבת של נוגדנים משני אחד עם השני, להוסיף נוגדנים משני בזו אחר זו באופן סדרתי (2 מרווח h בין תוספות הסידוריות של הנוגדנים מספיק). איור 3A ממחיש תא מלא biocytin מעובד ללא מכתים נוגדן ראשוני פומבי צילמו לפני resectioning.
איור 3. Immunostaining שנית מוצלח בעקבות השחזור של Biocytin מורפולוגיה Resectioning. (A1) Confocal תמונה של פרוסה 300 מיקרומטר מראה את ההתאוששות של המורפולוגיה הדנדריטים של תא מלא biocytin. (<מתח ממברנה A2) עקבות strong> של הנוירון בתגובת 500 ו -100 זריקות נוכחיות ברשות. (ב) שחזור של סומה המלאה biocytin בתוך סעיף 50 מיקרומטר המתקבל לאחר resectioning בסעיף 300 מיקרומטר (ב A1) לאחר ההרכבה והדמיה. (B2) immunostaining לאחר הסעיף דק חשף colocalization של סומה מלא biocytin (פאנל מימין) עם CCK (פאנל באמצע). התמונה הממוזגת מודגמת בלוח הימני. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לוח A2 משועתקת באישור ואח יו. , In press 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
(יום 3)
- חלקים במוח לשטוף 3x במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
- כדי להגן על הקרינה ועל מנת להקל מחדש מכתים בעתיד, ההר השנימשא בתווך הרכבה מימית מבוסס וסוגר את הקצוות של coverslip עם לק ברור.
הערה: עדיף restain סעיפים מוקדם ככל האפשר כדי למנוע קשיים בהסרת לק משקופית, שריצה עובש, והתייבשות של רקמות עקב דליפה של הרכבה בינונית משקופית הזכוכית. ניתן למנוע זיהום מיקרוביאלי באמצעות אזיד הנתרן 0.02% ב PBS.
זהירות: אזיד הנתרן היא רעילה ביותר ודליקים כאשר הוא בא במגע עם מים. עיין נהלי עבודה סטנדרטיים עבור טיפול וסילוק של חומרים מסוכנים.
(ימים 4 - 7) - בצע הדמיה confocal עם עירור ב 594 ו 488 ננומטר בהגדלה של 20X או 40X לחשוף נוירונים מלאות biocytin בסמנים אדום neurochemical (CB 1 R) בירוק. להעריך colabeling (איור 2).
- הגדר את חשיפת המצלמה פחות מ -100 ms כדי למנוע photobleaching ו obtaבערימות תמונה confocal של סוכות axonal ו הדנדריטים של הנוירון כולו. השתמש ערימות התמונה confocal וחבילות תוכנה התחקות נוירון לשחזר את המורפולוגיה העצבית.
3. מכתים של הנוגדן הראשוני שנית
הערה: בעוד צעד immunostaining השני יכול להתבצע 90 ד לאחר המכתים הראשון, מכתים אופטימלי מושג אם מכתים הנוגדן השני העיקרית מתבצע בתוך 7 - 10 ד.
(לאחר 7 - 90 ד)
- החל אצטון כדי מקלון צמר גפן ויסיר את לק הנחה של שקופיות זכוכית.
- הסר את coverslip בזהירות בעזרת מלקחיים בסדר-קצה ולשים כמה טיפות של 0.1 M PBS על הסעיפים.
- מוציאים בזהירות את הסעיפים משקופית באמצעות מברשת צבע עדין ולשטוף אותם 0.1 M PBS עבור 24 - 48 שעות על שייקר מכוסה בנייר אלומיניום באור נמוך ב 4 מעלות צלסיוס
הערה: זה חיוני כדי לכסות חלקים עםרדיד luminum להימנע photobleaching. - כדי להבטיח הסרה מלאה של הרכבה בינונית, לשטוף את סעיפים 1 - 2x למחרת ב 0.1 M PBS במשך 10 דקות כל אחד.
- המשך עם הדגירה הנוגדן הראשוני השני (למשל, כולציסטוקינין, ונוירופפטידים נמצא interneurons GABAergic מסוימים (CCK; ריכוז: 1: 1,000; נוגדנים חד שבטיים העכבר)) עבור 1 ד (איור 2).
הערה: הליך זה דומה לשלב 2.3, אך עושה שימוש נוגדן שונה. בנוסף, צעד החסימה מושמט במהלך מחדש מכתים. - שטוף את החלקים במוח שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד 0.1 M PBS (pH = 7.4).
- כתם עם עז נוגדנים משני מצומדות fluorophore אנטי העכבר (ריכוז: 1: 500; גל עירור: 647 ננומטר), ולוודא כי ספקטרום פליטת עירור של נוגדנים משני אינו חופף עם streptavidin (ריכוז: 1: 1,000; גל עירור: 594 ננומטר) immunofluorescence לפניכתמים.
- הר בסעיפים במדיום הרכבה מימי וסוגרים את הקצוות של להחליק את המכסה עם לק ברור.
הערה: אחסן את הסעיפים ב 4 מעלות צלזיוס תיבת אחסון אטומה כדי להגן על הקרינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם סיום מוצלח, בסעיפים לשמר את המילוי biocytin ואת immunolabeling ביצע בשלב 2 וניתן צילמו באמצעות confocal או מיקרוסקופ epifluorescence. בנוסף, חלקים מעובדים גם יראה immunostaining עבור אנטיגן שכותרתו במהלך עיבוד שלאחר מכן בשלב 3. במקטע באיור 2, את המורפולוגיה של נוירון מלא biocytin בחלק עבה (300 מיקרומטר) התגלה באמצעות streptavidin דמיינו (R CB 1) האדום בפריימריס הראשונים דמיינו בירוק. Immunostaining הראשונה בוצעה תוך 7 ד קיבוע PFA. הפרוסה הייתה רכובה בינוני הרכבה מימית, צלמה באמצעות מיקרוסקופ confocal, ומאוחסן לתקופה של חודשים לפני מחדש מכתים עבור נוגדן CCK. הערת המורפולוגיה של הנוירון המוקלט, כולל סוכות axonal (איור 2E), שוחזר מתמונות confocal obtained לאחר ההליך מכתים הראשון. Colocalization של האקסון עם immunoreactivity CB 1 R (איור 2 F - H) היה צפוי מבוסס על מחקרים פיזיולוגיים. המכתים השני CCK בוצע על סעיפים חודשיים לאחר ההליך המכתים הראשון. CCK היה צלם ב מרחיקות אדומות היה פסאודו בצבע ב ציאן לשם ויזואליזציה. באופן דומה, איור 3 הדגים דוגמא של תא שבו biocytin התיוג נתגלה צלם קטע עבה (איור 3A1). הפיזיולוגיה הפנימית של הנוירון מתוארת באיור 3A2. פרוס מחדש מחולק ב 50 מיקרומטר, ולמרות כמה קטעים המכילים תהליכים דנדריטיים אבדו, בקטע המכיל סומה התאושש (איור 3B1). immunostaining CCK לאחר הסעיף דק הראה ביטוי CCK בירוק סומה שכותרתו biocytin. הרכבה פרוסה עבה בתווך מימי מונע מדוארהצטמקות רקמות xcessive. בממוצע, סעיפים 300 מיקרומטר רכוב באמצעות בתווך מימי להתכווץ בכ 25.67 ± 3.14% (n = 5 פרוסות) כאשר נמדד שבוע לאחר הרכבה. לפיכך, חלקים עבים רכוב באמצעות בתווך מימי הם ~ 225 מיקרומטר, המאפשר resectioning. במחקרים מלאים כמה, הוא אשר כי תהליך immunolabeling בפעם השנייה לא הביא תיוג הלא ספציפית על ידי הנוגדן. לדוגמה, ידוע כי parvalbumin (PV) ו immunoreactivity CCK הם בלעדיים הדדית ב נוירונים בהיפוקמפוס. בקרות שבו צעד immunolabeling הראשון (2) עבור biocytin (אדום) ו CCK (ירוק) היה ואחריו התיוג השני parvalbumin (עם עירור ב 405 ננומטר ופליטה בכחול) הראו דפוסי ביטוי שאינו חופפים (איור 4). בנוסף, דפוסי מכתים הייחודי אקסונלית למינרית של נוירונים להביע סמנים הנוירוכימיים ספציפיים (PV, CCK, CB 1 R) לא שונו על ידי סריהl נהלים מחדש מכתים (איורים 2 - 4). יתר על כן, מכתים משני חשף באופן עקבי תיוג שיתוף של נוירונים המלאים biocytin עם הסמנים הנוירוכימיים הצפויה על בסיס ההקלטות הפיזיולוגיות. לפיכך, אנו בטוחים כי נוהל restaining אינו מוביל לאובדן סגולי תיוג.
איור 4. חוסר חפיפה בין מרקרים סותרים על Immunostaining השנייה בעקבות Immunostaining לפני ואת הרכבה של סעיפים. (A - C) תמונות Confocal ב 10X מראה נוירון מלאות biocytin (א) באדום, שמסומן על ידי ראש חץ, ו immunoreactivity CCK בירוק (B), המצוין על ידי החץ. הערת חוסר החפיפה. סעיף אותו היה מעובד עבור parvalbumin (PV) immunostaining בכחול לאחר יותר מ -2 חודשים (C). overlay של תמונות מוצג D. ראוי לציין, כי אקסונים PV מופצים שכבת תאי גרגיר, עם CCK בשכבה המולקולרית בדפוס nonoverlapping הצפוי. כמו כן שים לב חוסר colocalization של שני סמנים ב somata העצבית. התמונות בטיסה ימינה להמחיש כי נוירון שכותרתו biocytin מבטא PV (חץ) ולא CCK (חץ). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר (א - ד), 20 מיקרומטר (לוחות מימין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אחת הסיבות הנפוצות עבור biocytin תת אופטימלית ממלא הוא ניתוק מקרי של תהליכים עצביים עם פיפטה הקלטה בעת שהתקרב התא. תוספת האבוד של התא מופיע בתור בועה של biocytin בסוף האקסון, כפי שמודגם באיור 1 (חץ ירוק). blebs אקסונליתמחדש לעתים קרובות דמיינו כאשר תיקון תאים שטחיים, אקסונים אשר אפשר להתיר במהלך הליכי פריסתו. עם זאת, אופטימיזציה של המטוס של חיתוך וידע של דפוס והפצת axonal של מעמד התא הממוקד יכולה לסייע הימנעות מתקרבת סומה מהכיוון של האקסון המשוער, אשר יכול גם לנתק את האקסון, וכתוצאה מכך את המראה של בועה אקסונלית . ברוב סוגי תאים, עדיף להתקרב גוף התא לאורך ציר ה- Z (חץ לבן עם סימן). סוגיה שנייה נוגעת הפעלת לחץ חיובי יתר פיפטה בעת שהתקרבה התא. זה לא יכול להזיק התא רק וקשריו אלא גם גורם פתרון הפנימי המכיל biocytin לשפוך סביב התא, מה שמוביל קרינת רקע גבוהה. רקע מכתים גדל גם כאשר לוקח את הזמן כדי לפנות את התא הוא ממושך או כאשר האיכות פרוסה אינה אופטימלית, אשר יכול לסכן את היכולת להגדיר מורפולוגיה הסלולר (איור 5 א). אפשר למשוך סומה החוצה בעת פירוק פיפטה. זה יגרום חוסר מורפולוגיה סומטי (איור 5). כדי למנוע תלישת התא, להזיז את פיפטה מעלה והחוצה בצעדים קטנים תוך שימוש בהגדרות תנועה "קנס" של המניפולטור. אם התא מופיע שיצורף פיפטה בדרך של הרחבת קרום ארוך, ברז / קפיצים המניפולטור בעדינות כדי לסלק את פיפטה מן התא. הימנע משימוש הגדרות מניפולטור הגסות עד שהתא וחלץ מלא.
איור 5. תמונות להמחיש מוצלח ממלאות Biocytin. (א) תמונה מראה קרינת רקע גבוהה בשל לחץ חיובי יתר פיפטה ההקלטה, וכתוצאה מכך חשיפת תא עניה. מבנים פיינר של תהליכים עצביים, כולל אקסונים, הם דמיינו מעבר לאזור של הלשפוך דואר. כמו כן, שימו לב כי סומה כבר שלף. (ב) תא עצב עם סומה שלף במהלך ניתוק פיפטה. חצים מראים ממלאים מוצלחת של האקסון דנדריטים, ואילו סומה ומחוברים הפרוקסימלי בחצים טרם נתגלה. (C) תא תוקן בשכבה שטחית של הפרוסה (<50 מיקרומטר מפני שטח) תוצאות בתאי מולא מפגין האקסון לחתוך דנדריטים (ראשי חץ). שים לב והאגלים (חיצים) של דנדריטים תא גרגיר, המציין בריאות תא עלובה (C). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לבסוף, על מנת לשחזר מורפולוגיה הסלולר שלמה בלי אקסונים ניתקו או דנדריטים, עדיף למקד תא> 50 מיקרומטר עמוקים אל פני השטח הפרוסים. תאים שטחיים יכולים להיות תהליכים שישקוצץ ועשויים חסרים במידה הרגילה תשומות הסינפטי.
החסרונות הנפוצים ביותר בנהלי restaining המשויכים הסרת coverslip וההתאוששות של הסעיף מבלי לפגוע ברקמה. סוגיה שנייה נוגעת חדירת נוגדן לרקמה עבה, במיוחד כאשר מודגרות הלילה. במספר מקרים, חדירה טובה יותר הושגה על ידי דוגר את הנוגדן הראשוני עבור עד 72 שעות ב 4 ° C על שייקר מסלולית ממוקם בחדר קר. למרות מחדש חתך ברקמה היא ההליך היעיל ביותר כדי להבטיח חדירת נוגדן, מאריך את משך דגירת נוגדן ראשוני או הגדלת ריכוז חומר הניקוי ל -0.5 - 1% Triton-X100 עשוי גם לסייע נוגדן חדיר 24. מאחר שרוב נוירונים רשמו מוקם בתוך 50 - 100 מיקרומטר מפני השטח של הסעיף, אנו מוצאים כי המכתים של חלקים עבים הוא נאות לתייג biocytinsomata או תהליכים -filled ברמה זו. עם זאת, מומלץ כי היקף תיוג נוגדן נבדק על כל מקטע לפני בפירוש תוצאות שיתוף לוקליזציה שליליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
מילוי התא תוקן עם biocytin הוא הצעד החשוב ביותר כדי להבטיח את ההתאוששות המלאה של המורפולוגיה. מועד להחלמה מלאה של התא, זה הכרחי כדי לבחור את כיוון הדפסה פרוס אופטימלית כדי למזער את ניתוק התהליכים במהלך חיתוך. כיוון זה עשוי להשתנות בהתאם לסוג המעגל ותא בבחינה. הבא, זה הכרחי כדי לאפשר זמן מספיק עבור biocytin מפוזר על דנדריטים אקסונים. צבעים מסוימים, כגון Neurobiotin, יכולים גם לחדור נוירונים מצמידים את התא רשם דרך צומת פער. הגודל של קצה פיפטה גם צריך להיות מותאם, כפי סומה נוטה להיות שלף כאשר הפתיחה היא גדולה וטעינת biocytin נפגעת כאשר קצה פיפטה הוא קטן מדי. בנוסף, נהלים מתאימים, תוך התנתקות ממצב כל תא חיוניים להתאושש סומה. לאחר הקלטת במשך 24 שעות, הדגירה לאחר מכןשל פרוסות PFA 4% ואחריו PBS מבטיח כי cross-linking של הרקמות מצטמצם, שהוא קריטי עבור אימונוהיסטוכימיה. אחסון של פרוסות על 4 מעלות צלזיוס הוא גם חיוני עבור שמירה על שלמות פרוסה. עם זאת, אחסון ממושך ב PFA מפחית הצלחה עתידית לנהלי נוגדן-תיוג. אופטימיזציה של הריכוז ומשך דגירת הנוגדן הראשונית חשובה, כמו אלה יהיו שונים עבור נוגדנים בודדים, וכמה נוגדנים עשויים לדרוש מן 3 - 5 ד דגירה לחדירה אופטימלית ברקמה עבה. כדי להבטיח כי הפרוסות אינן פגומות לפני מכתים נוגדנים משני העיקרי, טיפול הולם יש צורך במהלך ההסרה להחליק את המכסה.
שינויים ופתרון בעיות
ראינו כי אין משך סט בין הכתם הראשון והשני. סעיפים כבר חודשים מוכתם מחדש מאוחר יותר באותו רקמות עם יותר מ כתם אחד. בהעבודות האחרונות שלנו, השוו סעיפים מעובדים בשיטה מחדש מכתים עם אלה פרוטוקולי immunostaining הרגילים באמצעות ולמצוא הבדל ברור בדפוסי המכתים או חוסניו של biocytin הממלאים 6,9,25,26.
בעוד הוא נשאר להיבדק, יתכן כי מחדש מכתים ניתן לבצע יותר מפעם אחת, עם שלמות רקמות להיות גורם מגביל עבור טיפול חזר. הזמינות של fluorophores בדידה גם מציב מגבלה על מספר של אנטיגנים כי ניתן דמיינו. לכן, טיפול זהיר של הרקמה מומלץ. תהליך נוסף, אשר נשאר להיבדק הוא restaining תוך שימוש בפרוטוקולי התאוששות אנטיגן (עבור הקולטנים). מאז שלמות הרקמה נשמרת לאחר הוצאתו להחליק את המכסה, אנו צופים כי ההליך צריך גם לעבוד מכתים פרוטוקולים שממליצים-התאוששות אנטיגן. בהקשר זה, הקלטות פיסיולוגיות לעתים קרובות להניב תאים ללא סמנים הנוירוכימיים ידועים
מגבלות של הטכניקה
מגבלה הקשורים ביצוע מכתים immunohistochemical על חלקים עבים היא החדירה המספקת של הנוגדנים דרך העובי המלא של הסעיף, במיוחד עם דגירת הלילה רגילה הנוגדן הראשוני. יתר על כן, נוגדנים streptavidin שונים, משמשים כדי לחשוף biocytin, יכולים להיות חדירים לרקמות הפרש. לפיכך, מומלץ כי פיילוטים מבוצעים כדי להעריך את עומק חדירת נוגדן וכדי לשנות את זמני דגירה, טמפרטורות, נוגדן טריטון & #160; X-100 ריכוזים על מנת להשיג חדירת פרוסה אופטימלית מכתים עבור כל נוגדן. כמו כן יש לציין כי תיוג מוצלח עם נוגדן אחד או עם streptavidin-biocytin אין פירושה כי נוגדן שני יחדור לאותו העומק של הסעיף. לכן, יש לנקוט זהירות כדי לוודא את החדירה של כל נוגדן לרמה שבה התהליכים בתא שכותרתו biocytin נבחנים שיתוף לוקליזציה עם הסמן הנוירוכימיים. אם החדירה אינה מספקת, הפרוסה ניתן מחדש מחולק על <60 מיקרומטר עבור immunostaining. שים לב, עם זאת, כי מאז הפרוסות עובדו כבר biocytin, את המורפולוגיה של התא יכולה לנפול בפח על ידי הדמית confocal לחסל את האובדן האפשרי של נתונים אנטומיים במהלך מחדש חתך ולהקל שחזור עצבי. למרות זאת, ניתן שמין הגיל ובעלי החיים עלול לשנות את מידת חדירת נוגדן, השתמשנו בהצלחת הליכים אלה ברקמות עכברוש מ 30דיי ושוב יום בן 60 חולדות בעכברים.
מגבלה שנייה היא כי biocytin אינו פלורסנט מיסודו ולא יכול לשמש הדמיה לחיות ואפיון מורפולוגי בזמן אמת במהלך ההקלטה. Fluorophores unconjugated האלטרנטיבי הצהובה לוציפר כבר נוצלו עבור הדמית חיה של התאים 27. הם אינם קבועים ולאבד הקרינה על קיבעון, מה שהופך אותו מעשית לזיהוי הנוירוכימיים פוסט-הוק של הנוירון מוקלט. לאחרונה, fluorophores עם biocytin הוכנסו להתגבר על מגבלה זו והוא יכול לשמש הדמיה לחיות כמו גם לעיבוד פוסט הוק ב-תיוג משולש כפול או, כמפורט כאן. מעניין לציין, כי עד כה, ממלאים biocytin גרם טובות יותר תכונות חשמליות מכתים ללימודים אלקטרו בשילוב אנטומי בהשוואה לוציפר צהוב 28.
משמעות של הטכניקה ביחס קיים /שיטות חלופיות
היתרונות העיקריים של שימוש בפרוטוקול המפורטים להלן, שבניגוד resectioning, מבנה התא מלא biocytin והתהליכים להישאר שלמים לא להוביל לאובדן הקבוע של רקמה, ולא על צורך השחזורים מייגעים ממקטעים מרובים. לפיכך, מילוי תא בודד ואחריו immunocytochemistry יכול לעזור בשחזור מורפולוגיים וזיהוי סמנים הנוירוכימיים ספציפיים.
יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו
בסך הכל, אנו מציגים גישה מעשייה רומן להחלמתם של מורפולוגיה פוסט הוק הכפול, משולש immunolabeling של נוירונים הבאים קלטות אלקטרו. התהליך הוא יתרון במיוחד למציאת סמנים חדשים כידע מתפתח, נוירונים הערכה-מחדש שמולאו בעבר, מדמיינים, צלמו. זהו יתרון במיוחד בגלל tהוא אימונוהיסטוכימיה יכול להתבצע שבועות או אפילו חודשים לאחר מכן, תוך חיסכון רקמות נוגדנים. השיטה אינה דורשת כל כימיקלים מיוחדים וניתן לבצעו בבטחה בכל מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות התמיכה מ- NIH / NINDS R01 NS069861 ו NJCBIR CBIR14IRG024 כדי VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Immunostaining |
| KCl | Fluka | 60129 | Immunostaining |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Immunostaining |
| KH2PO4 | Sigma | 229806 | Immunostaining |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Immunostaining |
| Guinea pig anti CB1 | Sigma | Af530-1 | Immunostaining |
| Mouse anti CCK | CURE, UCLA | courtesy of G. Ohning | Immunostaining |
| Rabbit anti Parvalbumin | Swant | PV27 | Immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor conjugate | Molecular Probes | S11227 | Immunostaining |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma | G9023 | Immunostaining |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Immunostaining |
| Secondary Antibodies | Invitogen Molecular probes | Alexa Fluor conjugated dyes | Immunostaining |
| Labnet orbit low speed shaker | Bioexpress | S-2030-LS | Immunostaining |
| Forceps | Dumont | 11231-30 | Immunostaining |
| Slide folders | EMS | 71520 | Immunostaining |
| Vibratome VT 1200 S | Leica | 14048142066 | Electrophysiology |
| Multiclamp 700B amplifier | Molecular devices | Multiclamp 700B | Electrophysiology |
| pCLAMP 10 Software | Molecular devices | pCLAMP 10 | Electrophysiology |
| Digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440 digitizer | Electrophysiology |
| Filter tips | Nalgene | 171-0020 | Electrophysiology |
| Sonicator | Fisher Scientific | 15-335-100 | Electrophysiology |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 | Electrophysiology |
| Biocytin | Sigma | B4261 | Electrophysiology |
References
- Garcia-Lopez, P., Garcia-Marin, V., Freire, M. The histological slides and drawings of cajal. Front Neuroanat. 4, 9 (2010).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Petilla Interneuron Nomenclature, G., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- Armstrong, C., Soltesz, I. Basket cell dichotomy in microcircuit function. J Physiol. 590 (4), 683-694 (2012).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8 (8), e70553 (2013).
- Gupta, A., Elgammal, F. S., Proddutur, A., Shah, S., Santhakumar, V. Decrease in tonic inhibition contributes to increase in dentate semilunar granule cell excitability after brain injury. J Neurosci. 32 (7), 2523-2537 (2012).
- Fish, K. N., Hoftman, G. D., Sheikh, W., Kitchens, M., Lewis, D. A. Parvalbumin-containing chandelier and basket cell boutons have distinctive modes of maturation in monkey prefrontal cortex. J Neurosci. 33 (19), 8352-8358 (2013).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate cannabinoid-sensitive interneurons undergo unique and selective strengthening of mutual synaptic inhibition in experimental epilepsy. Neurobiol Dis. 89, 23-35 (2016).
- Yu, J., Swietek, B., Proddutur, A., Santhakumar, V. Dentate total molecular layer interneurons mediate cannabinoid-sensitive inhibition. Hippocampus. 25 (8), 884-889 (2015).
- Varga, C., et al. Functional fission of parvalbumin interneuron classes during fast network events. Elife. 3, (2014).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Neural Circuits Revealed. , 109 (2015).
- Krook-Magnuson, E., Luu, L., Lee, S. H., Varga, C., Soltesz, I. Ivy and neurogliaform interneurons are a major target of mu-opioid receptor modulation. J Neurosci. 31 (42), 14861-14870 (2011).
- Szabadics, J., Soltesz, I. Functional specificity of mossy fiber innervation of GABAergic cells in the hippocampus. J Neurosci. 29 (13), 4239-4251 (2009).
- Iball, J., Ali, A. B. Endocannabinoid Release Modulates Electrical Coupling between CCK Cells Connected via Chemical and Electrical Synapses in CA1. Front Neural Circuits. 5, 17 (2011).
- Chen, X., Cho, D. -B., Yang, P. -C.
- Ranjan, A. K., et al. Cellular detection of multiple antigens at single cell resolution using antibodies generated from the same species. Journal of immunological. 379 (1), 42-47 (2012).
- Fuccillo, D. A., Sever, J. L. Concepts in Viral Pathogenesis II. , Springer. 324-330 (1986).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochem. 107 (2), 143-148 (2005).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (95), e52358 (2015).
- Walz, W. Patch-clamp analysis : advanced techniques. 2nd edn. , Humana Press. (2007).
- Molnar, P. Patch-clamp methods and protocols. 403, Springer Science & Business Media. (2007).
- Martina, M., Taverna, S. Patch-clamp methods and protocols. , Humana Press. (2014).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons). J Vis Exp. (91), e51706 (2014).
- Jinno, S., Kosaka, T. Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study. Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).
- Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms. Cereb Cortex. , (2015).
- Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations. Chaos. 23 (4), 046109 (2013).
- Scharfman, H. E. Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells. Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).
- Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses. J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).
