Introduction
성장 분석은 일반적으로 환경 적 요인에 대한 유전자형 결정 성장의 차이 및 / 또는 표현형의 반응을 설명하기 위해 식물 과학자들에 의해 사용되는 도구 세트에 따라 달라집니다. 그들은 성장의 기본 메커니즘을 탐구하는 크기와 무게 전체 식물의 측정 또는 장기 성장 속도의 계산을 포함한다. 장기 성장은 세포 수준에서 세포 분열과 팽창에 의해 결정된다. 따라서, 분석 성장이 두 프로세스의 정량화를 포함하는 전체 장기 성장 1의 차이를 이해하는 열쇠이다. 따라서, 비 전문 실험실에서 사용하는 것이 상대적으로 쉽다 세포 성장 파라미터를 결정하는 적절한 방법을 위해 중요하다.
운동 학적 분석은 이미 장기 성장 모델이 개발을위한 강력한 프레임 워크를 제공하는 방식으로 설정되어있다. 이 기술은 선형 시스템에 최적화 된,이러한 애기 장대의 뿌리와 잎 외떡잎로서뿐만 아니라, 쌍떡잎 식물 잎 3 비 - 선형 시스템에 대한. 오늘날,이 방법은 점점 방법 유전 호르몬 발달을 연구하는 데 사용되는, 환경 적 인자, 세포 분열 및 다양한 기관에서 팽창 (표 1)에 영향을 준다. 제한이 식물 재료의보다 많은 양을 필요로 기술 (예, 대사 산물에 대한 장기의 크기와 공간적인 조직에 의해 부과 될 수 있지만, 또한, 또한, 그들의 기본적인 생화학 적 분자, 및 생리적 규정 (표 2)에 세포 과정을 연결하는 프레임 워크를 제공한다 측정 프로테오믹스 등).
예컨대 옥수수 (ZEA 메이스) 잎과 같은 외떡잎 잎 순차적 성숙에 도달하는 분열 조직 및 연신 존을 통과하는 세포가 선단을 향해 판의베이스를 이동하는 선형 시스템을 나타내는존. 이는 성장 (4)의 공간 패턴의 정량적 연구 이상적인 모델 시스템 만든다. 또한, 옥수수 잎 (몇 cm (5)에 걸친 분열과 신장 영역) 큰 성장 영역이 다른 조직 수준의 연구에 대한 가능성을 제공합니다. 이 분자 기술, 생리 학적 측정 및 세포 생물학 접근 (표 2)의 범위를 통해 운동 학적 분석에 의해 정량화 세포 분열 및 확장을 제어 (추정) 규제 메커니즘의 조사를 할 수 있습니다.
여기서는 단자엽 나뭇잎의 운동 학적 분석을 수행하기위한 프로토콜을 제공한다. 첫째, 우리는 리프 축의 위치와 얼마나 학적 매개 변수를 계산하는 함수로서 세포 분열과 세포 신장 둘의 적절한 분석을 수행하는 방법을 설명한다. 둘째, 우리는 또한이가 샘플링 디자인의 기초로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 여기서 우리는 두 가지 사례를 토론 고해상도 샘플링을D는 각각 향상된 데이터 해석 및 시간 / 비용의 절감을 가능하게 샘플링을 집중했다.
운동의 표 1. 개요 세포 분열 및 다양한 기관에서 확장 정량화하는 방법을 분석한다.
| 오르간 | 참고 |
| 외떡잎 잎 | 16, 20, 21, 22 |
| 루트 팁 | 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 |
| 쌍떡잎 식물 잎 | 21, 30, 31 |
| 혀끝의 분열 조직을 촬영 | (32) |
운동의 표 1. 개요 세포 분열 및 다양한 기관에서 확장 정량화하는 방법을 분석한다.
분자 수준에서 자신의 규제기구 학적 분석에 의해 정량 세포 과정과 표 2에 연결합니다. 다양한 종 및 기관에서 생화학 및 분자 분석 결과에 세포 프로세스의 정량화를 연결하는 다양한 연구에 대한 참조. 크 실로 글루칸 endotransglucosylase (XET), 말론 디 알데히드 (MDA), 사이클린 의존 키나제 (CDK). 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
참고 : 운동 학적 분석을 위해 다음 프로토콜은 정상 상태 성장하는 동안 잎에만 유효합니다. 이것은 몇 일 (6)의 기간 동안 안정한 잎의 신장 속도와 셀 길이와 리프 팽창 공간 패턴을 의미한다.
1. 식물 성장과 잎 신장 속도의 측정 (LER)
- 정상 상태의 성장에 잎과 관심의 발달 단계를 선택합니다.
참고 : 동일한 축의 연속 잎 유사한 공간 패턴을 의미 정상 성장 및 반복적 성장의 차이가있다. 묘목 성장의 초기 단계 동안, 연속 된 잎은 일반적으로 성장 영역 (7)의 크기를 증가시키는 것이 점점 더 빠른 증가로 인해. 약간 높은 위치 리프 유사한 성장 패턴 (8)이있을 수 있지만,이 연구중인 치료제에 의해 영향을받을 수있는 과도 단계이다. 라인과 TR을 비교하는 것이 중요 그것은 다른 시간에 개발 될지라도, 엄격하게 동일한 위치에서 리프 eatments. 비록 일정한 신장 속도로 성장 속도 프로파일은 반드시 상이한 발달 단계에서 동일하지 않다. 따라서, 일반적으로 출현 후 일수에 의해 정의 된 동일한 발달 단계 8에서 잎을 분석하는 것이 중요하다. - 성장 룸에서 통제 된 조건 하에서 각각의 치료 및 유전자형 적어도 15 식물을 성장, 외떡잎에 잎 성장의 전체 운동 학적 분석을 수행합니다.
- 잎이 완전히 (그림 1I) 확장 될 때까지 관심의 잎 (주변 잎의 가마에서 출현)가 나타납니다 당시 통치자 매일 잎의 길이를 측정하기 시작합니다. 리프 길이 판의 선단에 오물 레벨까지의 길이를 의미한다. 이 성장을 변경할 수 있으므로, 휴식 또는 잎이 손상되지 않도록주의하십시오.
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그림 1 :. 옥수수 잎의 운동 학적 분석의 도식 개요는 관심의 잎은 잎 신장 비율 (LER)를 계산하는 세 가지 일 연속 통치자로 측정된다. 그 후, 리프 수확되고 세 cm 세그먼트는 분열 크기의 결정에 사용된다. 이것은 DAPI 염색 후 가장 말단 유사 분열의 그림을베이스까지의 길이를 측정하여 수행됩니다. 증식 유사 분열 수치와 (B) 조형 유사 분열 수치의 (A) 예. 중간 정맥의 다른 쪽 판베이스에서 제 십일cm은 셀 길이를 측정 한 10 상자 cm 세그먼트를 절단하는 데 사용된다. 이러한 측정은 성숙한 세포의 길이 (L 메트) 및 분열 (패 DIV)를 떠나는 셀의 길이를 결정하는 역할을 셀 길이 프로파일을 생성하기위한 기초를 제공한다. 그만큼
2. 수확
- 관심의 발달 단계에서 (예를 들어, 출현 후 셋째 날), 적어도 다섯 대표 쪽을 선택배치에서 lants이되는 운동 학적 분석을 수행합니다. 마지막 잎의 길이를 결정하는 단계 130에서 설명한 바와 같이 식물의 나머지를 계속 측정.
- 식물의 위 지상 부분을 잘라. 뿌리에 최대한 가깝게 잘라 그대로 (그림 1II을)를 분열 부분을 유지합니다.
- 외부 잎에서 시작, 부드럽게 하나씩 줄이기 모든 관심의 잎까지 잎 제거합니다. 필요한 경우, 잎을 분리 기지에서 몇 가지 추가 밀리미터를 제거합니다. 또한 관심 (그림 1iii)의 잎으로 둘러싸인 정점 작은 잎을 제거 할 수 있습니다.
- 중간 정맥의 일측에 상기베이스부터 3 CM 구간을 잘라, 3 가득 1.5 mL를 시험관에 보관 : 1 (V : V) 무수 에탄올 : 아세트산 용액 (주의 : 장갑을 착용)에서 몇 달에 24 시간까지 4 ° C를 (그림 1iv). 이 세그먼트는 나중에 분열의 길이를 결정하는 데 사용된다.
- 로부터정맥의 다른 측면은,베이스에서 11cm 세그먼트를 잘라 (그림 1 V) 및 안료 (그림 1 VI)를 제거하기 위해 적어도 6 시간 동안 4 ° C에서 무수 에탄올로 가득 15 ML 튜브에 넣습니다.
주 : 나중에, (설명을 참조) 셀 길이 프로파일을 결정하는 첫 번째 10cm를 사용한다. - 적어도 24 시간 (그림 1vi) 4 ° C에서 청소의 또 다른 라운드의 무수 에탄올을 갱신.
- 마지막으로, 순수 젖산과 무수 에탄올을 대체 (주의 : 장갑을 착용) 청소 및 저장을 위해 4 ° C에서 24 시간 동안 또는 추가 사용 (그림 1vi)까지.
3. 분열 조직 길이 측정
- 50 mM 염화나트륨 (NaCl을), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 포함 된 세척 버퍼 준비 (EDTA 단계;주의 : 장갑을 착용) 및 10 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 - 염산 (트리스 - 염산, pH가 7).
- 2.4 절 등등에서 3cm 세그먼트를 타고20 분 (그림 1vii)에 대한 버퍼를 AK.
- 대기하는 동안, 얼음 및 진한에서 유지 한 μg의 / ㎖ 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 염색 액을 조제 린스 버퍼를 사용한다.
- DAPI 염색 용액에 2-5 분 동안 분열 조직 세그먼트를 배치하여 핵을 염색. 얼음과 어둠 (그림 1vii)에서 작업 할 수 있습니다.
- 빠르게 현미경 유리에 세그먼트를 장착하고 커버 유리를 덮어 형광 신호를 확인합니다. 표피 세포가있는 동안 기본 세포 층이 안, 형광을 표시해야합니다.
- 염색이 충분하지 않은 경우 일부 여분 분간 DAPI 염색 용액에 다시 넣어 세그먼트.
- , 염색을 중지 커버 유리와 현미경 슬라이드와 커버에 버퍼를 세척 한 방울의 세그먼트를 장착합니다.
- 1,000 epiderm의 시각화를 허용하는 20X의 배율로 UV 형광 장착 된 현미경을 사용하여알 세포를 한 번에. 세그먼트에 걸쳐 스크롤 증식 유사 분열 수치 (중기, anaphase (핵분열 말기), telophase 및 세포질 분열)을 찾아,하지만 개발 기공 (그림 1viii)의 조형 세포 분열을 피하기 9. 가장 말단 유사 분열 그림이있는 위치를 정의합니다.
- 잎의베이스와 가장 후방 표피 유사 분열 지수 사이의 거리를 측정함으로써 분열의 길이를 결정한다. 이미지 프레임의 전체 길이를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용한다.
- (가장 먼 유사 분열의 그림을 판베이스)에서 전체 분열 길이를 커버 프레임 수를 세어 전체 분열 길이 (도 1ix)을 획득 한 프레임의 길이만큼이 값을 곱한다.
4. 셀 길이 프로필
- 젖산 (단계 2.5)에 저장되어있는 세그먼트를 가지고 벤치에 조심스럽게 놓습니다. 세그먼트 재치를 잘라1cm 각 (그림 1 배)의 10 세그먼트 하는 메스.
- 젖산의 작은 방울의 현미경 슬라이드에 연속 잎 세그먼트를 탑재합니다. 지속적으로 향축 또는 배축면이 위로를 직면해야합니다. 원칙적으로, 특정 측면에 대한 선호가 없습니다.
- 리프베이스부터 세그먼트를 분석하는 미분 간섭 대비 (DIC) 광학계를 구비 한 현미경을 사용한다. 일관 동일한 세포 유형을 선택하기 위해 이미지 분석 소프트웨어와 기공 파일로 직접 인접하는 파일의 적어도 20 복제 표피 세포의 길이를 측정한다.
- 세그먼트 (세그먼트 충분할 당 4 위치)의 각각을 따라 등 간격 위치에서이 작업을 수행하고, 잎 (그림 1xi)에 걸쳐 각 측정에 해당하는 위치를 기록해야합니다.
- 로컬 평활 다항식 P를 사용하여 리프 축을 따라 각 mm의 평균 셀 길이를 결정rocedure,에 R-스크립트 (; 보충 파일 1 그림 1xii)에서 구현.
주 : R-스크립트 매끄럽게 증가하는 일련의 데이터를 제공한다. 필요한 스무딩 양은 단지 로컬 잡음을 제거하지만, 전체적인 곡선에 영향을 미치지 않아야 이상적 다소 임의적이며. 한 실험에서 모든 샘플에 대한 평활화의 동일한 금액을 사용하십시오. - 식물 사이의 각각의 위치에서의 셀 길이를 평균 판 축을 따라 셀 길이 프로파일을 생성하기 위해 표준 오차를 계산한다.
운동 학적 매개 변수 5. 계산 (보조 파일 2 참조)
- (단계 130에서와 같이 예를 들면 24 시간) 두 개의 연속 시점 사이 리프 길이의 변화를 고려하여 시간 간격을 분할함으로써 LER을 계산한다.
- 세포가 성숙한 CE의 95 %에 도달 여기서베이스로부터 먼 위치에 대응하는 성장 영역 (L의 GZ)의 길이를 계산평활 셀 길이 프로필에 게요 길이.
- 그 위치 (도 2) 다음의 모든 셀의 길이의 평균의 평활 셀 길이 프로필 95 %의 각 위치에 가라.
- 각 위치에서 계산 된 95 % 셀 길이의 셀 평활화 길이 (단계 4.4)을 비교한다. (, 보완 데이터 2도 2 참조) 잎의 기부에서 시작하여, 성장 영역은 실제 셀 길이는 다음의 셀의 길이의 95 %를 동일 위치에서 종료한다.
그림 2. 성장 영역의 종료를 결정하는 분열 조직은 : 적색 별표 표시된 위치에서는, 실제의 셀 크기보다 작은 95 %가이 위치에 따라 모든 셀의 평균 셀 크기 (빨간색 점선) (적색 고체 인 선). 성장 영역 (L의 GZ의 끝, AB로 표시95 %이 위치 (청색 선 다음 모든 셀의 평균 셀 크기의 (점선 파란색 라인)) 실제 셀 크기를 동일 곳 루 스타)에 위치해 있습니다. 분할 영역 (D), 신장 영역 (E), 성숙 영역 (M). 점선 화살표는 로컬 크기와 잎의 끝 부분에 기초 위치에서 이동하는 잎의 선단부의 평균 크기의 95 % 사이의 융합을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 성장 영역 (L의 GZ) 및 분열 크기의 길이 차이 등의 연신 존 (L EL)의 길이를 계산한다 (L 메르을, 3 단계에서).
- 성숙한 영역의 평균 셀 길이와 성숙 세포의 길이 (L 매트)를 계산한다.
- 를 얻을 리터 매트에 의해 LER 나눈다셀 생산 률 (P).
- N 및 N의 GZ 메르 차이로 연신 존 (N EL) 세포의 수를 계산한다. 분열 조직 (N 메르) 세포의 수는 분열에 대응 한 간격으로 위치한 셀의 누적 개수와 동일. 성장 영역 (N의 GZ) 세포의 수는 증가 영역에 대응 한 간격으로 위치한 셀의 누적 개수와 동일.
- P의 / N의 메르로서 평균 셀 분할 률 (D)을 계산한다. 세포주기 기간 (T의 C)는 LN (2) / D 같다.
- P가 N EL 나누어 연신 존 (T EL)의 시간을 계산한다. 분할 영역에서 시간은 로그 2 (N 메르) * T의 C 같습니다. 분열 조직을 떠나 세포의 길이 (L의 사업부)분열 조직 끝의 평활 셀 길이 프로필에서 셀 길이 같다.
- LN (L 매트) -ln (리터 사업부)] / T 엘 : 평균 다음 공식을 사용하여 세포의 확장 속도 (R 엘)을 계산합니다.
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Representative Results
여기, 우리는 그들의 잎 성장의 관점에서 가뭄 스트레스 조건 (가뭄, 34 % SWC)를 실시 잘 급수 설비 (제어, 54 % 토양 수분 함량, (SWC))과 식물 사이의 비교를 나타낸다. 모든 식물은 ° C를 하루 / 밤, 300-400 μEm -2 초 -1 광합성 활성 방사선 (PAR). 가뭄 조건 25 ° C / 18을, 통제 된 조건 (16 시간 일 / 8 시간 밤에서 성장 챔버에서 성장했다 올바른 SWC에 도달 한 후, 추가로 유지 될 때까지 물을 원천에 의해 확립되었다. 예비 연구에있어서, 제 5 판 따라서, 그것은의 리프로 선택되었다. 등장이 스트레스 조건 하에서 처음 개발 한 것으로 정의 된 관심. 마지막 잎 길이 (LL) 가뭄 스트레스 식물의 낮은 LER (표 3)에 기인 잘 물을 식물의 것보다 40 % 낮았다. 레아의 세포 기초를 이해하기F 성장 반응, 우리는 운동 학적 분석을 수행 하였다. 전반적으로, 잎의 신장 속도가 분열 조직 및 신장 영역 결정 성숙한 세포 크기 (도 3)에서의 세포 생산의 함수이다. 그러므로, 잎의 단축은 하나 또는 이들 파라미터의 모두 효과로 인한 것임에 틀림 없다. 우리의 결과는 성숙한 세포 길이 (L 메트)가 영향을받지 않는 동안의 전지 생산 속도 (P)가 71 % (표 3)에 의해 감소되었음을 보여준다. L 매트는 분열 떠나는 셀의 길이 (L 개의 DIV)에 따라 이들 세포는 연신 존 (T EL)에 보내는 시간과 상대 셀 팽창률 (R EL). R 엘은 가뭄 조건에서 67 %로 감소하는 동안 아무 효과는 리터 사업부에 대한 관찰되지 않았다. 이 효과는 거의 동일한 L 매트 결과 T EL, 배로하여 보정 하였다 <제어 조건에서와 같이 / 서브>. 전지 생산 속도의 감소가 있었다 차례로 낮은 평균 세포 분열 율 (D) 및 분열 (N 메르) 세포의 작은 수의 양에 의해 발생. 분열 조직 (L 메르)의 길이가 크게 영향을받지 않았다 성장 영역 (L의 GZ)의 길이와 대조를 감소시켰다. 결론적으로, 이들 결과는이 경우에, 휴대 번호, 셀 크기는 달리 잎 크기를 결정하는데 중요한 역할을 한 것으로 나타낸다.
| 운동 학적 매개 변수 | 기음 | 디 | % 변화 CD | p 값이 |
| LL | 727 ± 15 | 436 ± 23 | -40 | 0.000 |
| LER (mm / 시간) | 2.8 ± 0.1 | 0.8 ± 0.0 | -73 | 0.000 |
| 리터 매트 (μm의) | 140 ± 3 | 130 ± 6 | -7 | NS |
| P (세포 / 시간) | 20 ± 1 | 6 ± 0 | -71 | 0.000 |
| D (세포 · 세포 -1 · 시간 -1) | 0.028 ± 0.003 | 0.010 ± 0.001 | -63 | 0.000 |
| T의 C (시간) | 26 ± 3 | 71 ± 7 | 173 | 0.000 |
| T의 사업부 (시간) | 249 ± 27 | 656 ± 71 | 164 | 0.000 |
| L 메르 (mm) | 15 ± 1 | 11 ± 1 | -25 | 0.010 |
| N 메르 | 740 ± 31 | 590 + 20 | -20 | 0.000 |
| R 엘 (μm의 · μm의 | 0.043 ± 0.002 | 0.014 ± 0.001 | -67 | 0.000 |
| 리터의 DIV (μm의) | 24 ± 2 | 23 ± 2 | -4 | NS |
| T 엘 (시간) | 42 ± 2 | 125 ± 11 | 199 | 0.000 |
| N 엘 | 844 ± 54 | 735 ± 65 | -13 | NS |
| L의 g 용 Z (mm) | 68 ± 1 | 61 ± 5 | -11 | NS |
| N의 g z를 | 1584 ± 33 | 1326 ± 66 | -16 | 0.010 |
다섯 번째 잎의 정상 성장 동안 세포 분열 세포의 팽창에 대한 표 3에 운동 학적 분석. 가뭄 스트레스 데이터를 실시 잘 물을 식물과 식물 (여기서 n = 10 LL를 들어, N = 5) SE ± 평균입니다. 학생의 t- 시험을 통계 분석으로 사용 하였다. 파라미터 : 리프 길이 (LL), 잎의 신장 속도 (LER), 성숙한 셀 길이 (L 매트), 전지 생산 속도 (P), 세포 분열 속도 (D), 세포주기의 기간 (T 온도), 시분할 존 ( T DIV), 분열 조직의 길이 (L 메르) 분열 조직 (N 메르 셀의 수), 상대 셀 신장율 (R EL)의 분열 (패 DIV 떠나는 세포)의 길이, 연신 존 시간 (T EL), 연신 존 (N EL), 성장 영역의 길이 (L의 GZ), 성장 영역에있는 셀의 수 (N의 GZ) 잘 탈수 조건 (C), 가뭄 스트레스 세포 수 ( D) d를 중요하지 (NS).
그림 3 :.기구 학적 매개 변수 사이의 관계의 마지막 잎 길이 (LL)을 차례로 전지 생산 (P)와 성숙한 세포 길이 (L 매트)에 의존 잎 신장 비율 (LER)에 따라 달라집니다. 분열 조직 (N 메르) 세포의 수와 D의 역수로 세포 분열 율 (D)을 함께 세포주기의 기간 (T 온도)와 P를 결정한다. 연신 존 (T EL) 분열 조직 (패 DIV)를 떠나는 세포, 길이 및 상대적 셀 팽창률 (R EL)의 시간은 성숙한 세포의 길이 (L 매트)를 결정한다. 연신 존 (N EL)에 셀의 수..jove.com / 파일 / ftp_upload / 54887 / 54887fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
장기 성장의 상세한 분석 등의 응용뿐만 아니라, 운동 학적 분석 잎 성장 영역 지역화의 맵을 제공하는 분자 subzonal 해상도로 샘플링을 허용하며 생화학은 4,10,11를 분석한다. 예로서,도 4a는 상기와 동일한 조건으로 실시 식물의 잎, 옥수수의 성장 영역을 따라 말론 디 알데히드 (MDA) 정량화를 도시한다. MDA는 ROS에 의해 지질 과산화 중에 형성된 이차 대사 산물이며, 산화 손상 (12)의 수준을 반영한다. MDA는 성장 구배 11 따른 농도 변화의 분석을 허용 그 염기부터 잎마다 cm로 측정되었다. 가뭄 처리 40 % 잎 쇼트닝, 발달 영역의 길이를 야기 같이 (멜줄기, 대조군 식물에 신장 영역과 성숙 영역) 가뭄 스트레스 식물 동일한 영역 (도 4b)의 길이와 일치하지 않았다. 도 4b에서 보듯이, 대조군 식물의 분열 조직은 약 1.5 cm 길이이고, 연신 영역은베이스 판에서 1.5 ~ 6.8 cm에서 스팬. 응력 식물의 분열 조직은 0 내지 1.1 cm 1.1 cm 6.1에서 연신 영역에서 지역화 하였다. MDA 수준 전체 성장 영역은 대조구에 비해 가뭄 스트레스를 식물에서 증가 하였다. 운동 학적 분석의 도움으로, 우리는 MDA 함량은 특히 모두 제어 및 가뭄 치료에 대한 성숙한 영역에서 증가한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 발달 영역의 크기를 모른 채, 우리는 가뭄 스트레스, 그 결론을 내릴 것이다, 제어 식물에 비해 초기 발달 단계에서 MDA 함량 증가,이 계정으로 인해 지역의 이동을하지 않는 잘못된 것 마에하기잎 단축을 그. 따라서, 생화학 적 측정에 앞서 학적 분석을 수행하여 데이터를 정확하게 해석하기 위해 매우 중요했다.
그림 4 : 고해상도 생화학 적 측정의 예와 집중적 인 분석을 위해 샘플링 (A) 말론 (MDA) 재배 식물 (열 세그먼트로 분할) 옥수수 잎 성장 영역을 따라 측정 농도 잘 급수 조건과 식물 가뭄을 실시. 치료 10. 데이터는 평균 ± SE이다 (N = 5). 양방향는 ANOVA 통계 분석으로 사용하고, P 값은 그래프 패널 (인자 : 건조 (d) 및 세그먼트 (들))의 옆에 표시된다; FW : 신선한 무게. 제어 및 가뭄 스트레스 식물에서 서로 다른 성장 영역 (B) 시각화. 분할 영역 (D), 연신 존 (E) 및성숙한 영역 (M). 세포를 125 배로 확대된다. (C) 제어 및 가뭄 처리 식물의 세포 길이 프로필. 데이터는 평균 ± SE이다 (N = 5). 제어 및 가뭄 처리 식물 모두에 초점을 맞춘 샘플링에 (D)의 차이. 파란색 상자는 모두 치료에 동일한 발달 단계를 비교하는 샘플링 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
고해상도의 연구에서 동일한 발달 영역을 비교하는 가능성을 제공하는 것 이외에, 운동 학적 분석은 또한 동일한 발달 단계의 세포를 포함하는 특정 영역의 샘플을 취하는 더 집중 분석을위한 기초로서 사용될 수있다. 우리는 첫 10 C의 미세한 셀 길이 측정의 평활화에 의해 제공되는 셀 길이 프로필, 비교제어 가뭄 스트레스 식물의 잎베이스에서 entimeters이. (c)은 셀 길이 프로파일을 사용하여, 우리는 발전 영역의 길이를 결정할 수 있고, 또한 제어 및 가뭄 스트레스 식물 모두에서 성장 속도의 역학을 수행 할 수 있음을 보여준다. 이과 성숙 영역에서 젊은 성숙한 세포 (고원의 시작) (상기 가파른 증가의 중간에) 신장 영역에서 세포를 확장 (가파른 증가 전) 분열 조직에서 세포 증식의 특정 샘플링을 허용했다. 우리의 결과로 인해 가뭄에 응답하여 잎 단축에, 이러한 영역은 통제와 스트레스를 식물에 대응하지 않았다 것으로 나타났습니다. , 증식 확대 및 대조군 식물에 젊은 세포 성숙을 샘플링하기 위해, 우리는 각각 판 기지국에서 첫 번째, 다섯 번째 및 아홉 번째 cm 필요했다. 그러나, 스트레스 식물, 이러한 세그먼트는 각각, 제 1 내지 제 4 및 여덟째 cm에 대응한다. 더 집중 이러한 종류의샘플링 등 RNA 시퀀싱, 프로테오믹스 (proteomics), 대사 체학 같은 더 비싼 수고 또는 시간 소모적 인 연구의 경우에 유용한 것으로 입증
보충 파일 1 :. 다항식 스무딩 절차에 대한 R-스크립트는 바로이 파일을 다운로드를 클릭하십시오.
보충 파일 2. 운동 학적 매개 변수의 계산은 바로이 파일을 다운로드를 클릭하십시오.
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Discussion
옥수수 잎 전체 학적 분석 판 성장의 셀룰러 기반의 판정이 가능하고 효율적인 샘플링 전략의 디자인을 허용한다. 프로토콜은 비교적 간단하지만, 몇 가지주의 사항은 다음 중요한 단계 추천 : (1)은 분열 조직의 길이 결정 (3 단계) 때문에, 분열 조직에 손상을주지 않고 젊은, 동봉 된 잎 (2.3 단계) 분리하는 것이 중요합니다 전체가 필요합니다 분열 조직은 존재합니다. 연습은 사전에 필요할 수 있습니다. (2) 분열 길이 판정은 유사 분열의 해석에 기초한다. 따라서, 우리는 하나의 실험에서, 동일 인물 의한 실행 프로그램에 차이를 줄이기 위해 이러한 측정을 행하는 것을 조언한다. (3) 단지 10 센티미터 실제 셀 길이의 측정에 사용되는 경우에도, 상기 세그먼트의 에지가 전혀 않으므로 셀 길이를 측정 (250 단계)에 세그먼트를 수확 십일cm 포함하지 중요t는 항상 완전히 에탄올 및 / 또는 유산균의 잠수함. 따라서,이 여분 센티미터 성장 영역의 처음 10 센티미터 청산을 보장한다. (4) 마지막으로,이 올바른지 확인하기 위해 학적 파라미터의 결과를 검사하는 데 유용하다. 표 3에서, 예를 들어, 가뭄 스트레스 식물의 전지 생산 속도 (P)를 다른 말로, 71 % 감소하거나하여, P 가뭄은 P 제어의 0.29이다. ≈ P (0.29) 및 분열 조직 세포의 수 (N 메르; -20 % 3도) 세포 생산 평균 세포 분열 율 (-63 % D)에 의존하기 때문에, 다음은 출력을 검증하는데 사용될 수있다 N 메르 (0.8) × D (0.37). 동일은 LER = P × 1 매트에 적용 할 수 있습니다.
이용 가능한 기능에 따라, 프로토콜은 일부 단계에서 수정 될 수있다. (1) 더매일 수동 잎 길이 측정 (1.3 단계)에 대한 dvanced 대안은 선형 속도 변위 트랜스 듀서 (LVDT와) (13)에 기초한다. 그 장점은 분 초 범위, 더 높은 시간 해상도로 측정을 가능하게한다는 것이다. (2) 샘플 동안 완전한 성장 영역을 포함하는 것이 중요하다. 그러나, 환경 조건, 유전자형, 종 및 검사 발달 단계는 성장 영역의 길이를 변경할 수있다. 따라서, 실험의 처리에 응답하여 증가 영역의 길이의 제 추정치를 만들기 위해 유용하다. 이 프로토콜은 B73가 25 ° C에서 성장 된 근친 라인을 기반으로 / 18 ° C 300-400 μEm -2의 -1에서 (주 / 야간) (광합성 활성 방사선 - PAR). (3) 형광을 사용하지 않고, 유사 분열 (단계 3.8)을 시각화하기 위해서는, 예컨대 Fuelgen 얼룩 (14)에 적용될 수있다. (4) 데이터의 스무딩은도 5 점 ...로서 사용하여 MS 엑셀 대신 R에서 수행 될 수있다dratic은 "LINEST"기능 15 피팅.
이 방법의 중요한 한계는 전체 성장 영역이 정상 성장 동안 수확 할 필요가 있다는 것이다. 조도, 온도, 습도의 변동이 리프 신장율 16 영향을주기 때문에 정상 상태의 성장을 보장하기 위해, 식물들은 이상적으로는, 제어 된 성장 조건에서 성장한다. 이 때문에, 운동 학적 분석은 현장 조건 하에서 성장을위한 식물 덜 적합하다. 또 다른 단점은 잎이 불가능 여전히 오래된 잎으로 둘러싸인 잎을 검사 할 수있는 등장 할 필요가있다. 마지막으로, 프로토콜은 적어도 몇 센티미터 포괄 큰 성장 영역이 외떡잎 종 적합하다. 외떡잎 작은 (예 포아, 쌀)의 운동 학적 분석 그러나 가능하지만, 샘플 제조 (17, 18)에 약간의 수정을 필요로한다.
또 자주 사용하는차동 성장 표현형을 분석하는 방법 d는 고전 성장 분석이다. 이 분석은 전체 식물 상대적인 성장 속도를 정량화하고 새로운 영역으로 광합성 및 식물의 다른 부분 (19)으로 광합성 유도 탄소의 기본 할당을 결정한다. 운동 학적 분석 그러나, 세포 분열 및 확장 정량화에 기초하여 성장 표현형에 결합되는 기저 세포 과정의보다 상세한 이해가 가능하다. 또한, 각각의 성장 영역의 길이를 결정할 수있는 가능성을 연구중인 처리에 의해 영향을받는 특정 발달 단계로 리프 축의 분자량 측정의 상관을 허용한다. 이 데이터 해석 중요하다. 시간 또는 예산 때 또는 특정 발달 단계에서의 관심이 제한되면,이 분석의 결과는 분석을 위해 필요한 샘플의 수를 줄이고 집중된 샘플링을 허용한다. 결론적 학적 분석을 사용잎의 성장 스트레스 반응 유전자 변이의 기초가 셀룰러 파라미터의 결정 (S)과 규제 공정 (표 2) 상류에 링크 할 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 VA에 앤트워프 대학에서 박사 친교에 의해 지원되었다; KS에 플랑드르 과학 재단 (FWO, 11ZI916N)에서 박사 교제; FWO (G0D0514N)에서 프로젝트 보조금; 공동의 연구 활동 (GOA) 연구 보조금, 앤트워프 대학의 연구위원회에서 "잎 형태 형성의 시스템 생물학 접근"; 그리고 Interuniversity 매력 폴란드 (IUAP VII / 29, MARS), 모든 비디오에 기여 GTSB 한 Asard, Bulelani L. Sizani과 하마다 AbdElgawad에 벨기에 연방 과학 정책 사무실 (BELSPO)에서 "옥수수와 애기 장대 뿌리와 성장을 쏴" .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pots | Any | Any | We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot. |
| Planting substrate | Any | Any | We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study. |
| Ruler | Any | Any | An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants. |
| Seeds | Any | NA | Seeds can be ordered from a breeder. |
| Scalpel | Any | Any | The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
| 15 mL falcon tubes | Any | Any | The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid. |
| Eppendorf tubes | Any | Any | The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution. |
| Gloves | Any | Any | Latex gloves, which protect against corrosive reagents. |
| Acetic acid | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3 |
| Absolute ethanol | Any | Any | CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion |
| Lactic acid >98% | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1 |
| Sodium chloride (NaCl) | Any | Any | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Any | Any | CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3 |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) | Any | Any | This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Any | Any | Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation. |
| Ice | Any | NA | The DAPI solution has to be kept on ice. |
| Fluorescent microscope | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length. | |
| Microscopic slide | Any | Any | |
| Cover glass | Any | Any | |
| Tweezers | Any | Any | Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
| Image-analysis software | Axiovision (Release 4.8) from Zeiss | NA | The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well. |
| Microscope equipped with DIC | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths. | |
| R statistical analysis software | R Foundation for Statistical Computing | NA | Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/ |
| R script | NA | NA | We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC. Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author. |
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