Introduction
Tillväxtanalys beror på en uppsättning verktyg som ofta används av växtvetenskapsmän att beskriva genotyp bestäms tillväxtskillnader och / eller fenotypiska svar på miljöfaktorer. De inkluderar storlek och vikt mätningar av hela anläggningen eller ett organ och beräkningar av tillväxttakten för att utforska de bakomliggande mekanismerna för tillväxt. Organtillväxt bestäms genom celldelning och expansion på cellnivå. Därför, inklusive kvantifiering av dessa två processer i tillväxtanalyser är nyckeln till att förstå skillnader i tillväxt hela organ en. Därför är det viktigt att ha en lämplig metod för att bestämma celltillväxtparametrar som är relativt lätt att använda av icke-specialiserade laboratorier.
Kinematisk analys har redan etablerat sig som en metod som ger en kraftfull ram för utvecklingen av tillväxtorgan modeller 2. Tekniken har optimerats för linjära system,såsom Arabidopsis thaliana rötter och monokotyledona bladen, men även för icke-linjära system, såsom tvåhjärtbladiga blad 3. Numera är denna metod alltmer används för att studera hur genetiska, hormonella, utvecklings och miljöfaktorer påverkar celldelning och expansion i olika organ (Tabell 1). Dessutom ger det också en ram för att koppla cellulära processer för att de underliggande biokemiska, molekylära och fysiologiska föreskrifter (tabell 2), även om begränsningar kan införas av organstorlek och spatial organisation för tekniker som kräver större mängder av växtmaterial (t.ex. metabolit mätningar, proteomik, etc.).
Monokotyledona blad, såsom majs (Zea mays) blad, representerar linjära system i vilka celler rör sig från basen av bladet mot spetsen, i följd passerar genom meristem och töjning zonen för att nå den mognazon. Detta gör den till en idealisk modellsystem för kvantitativa studier av de rumsliga mönster för tillväxt 4. Dessutom lämnar majs har stora tillväxtzoner (meristem och töjning zon som sträcker sig över flera centimeter 5) och ge möjligheter till studier på andra nivåer i organisationen. Detta gör det möjligt för undersökningen av (förmodade) reglerande mekanismer som styr celldelning och expansion, kvantifieras genom kinematisk analys genom en rad molekylära tekniker, fysiologiska mätningar, och cellbiologiska metoder (tabell 2).
Här ger vi ett protokoll för att utföra en kinematisk analys i monokotyledona blad. Först förklarar vi hur man genomför en ordentlig analys av både celldelning och cellförlängning som en funktion av läget utmed bladet axeln och hur man kan beräkna kinematiska parametrar. För det andra, visar vi också hur detta kan användas som en grund för provtagningsdesign. Här diskuterar vi två fall: hög upplösning provtagning end fokuserad provtagning, vilket möjliggör förbättrad tolkning av data och spara tid / pengar, respektive.
Tabell 1. Översikt över kinematisk analyserar metoder för kvantifiering av celldelning och expansion i olika organ.
| organ | referens |
| monokotyledona blad | 16, 20, 21, 22 |
| rotspetsar | 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 |
| tvåhjärtbladiga blad | 21, 30, 31 |
| skjuta apikala meristem | 32 |
Tabell 1. Översikt över kinematisk analyserar metoder för kvantifiering av celldelning och expansion i olika organ.
Tabell 2. Samband mellan cellulära processer kvantifieras genom den kinematiska analys deras reglering på molekylär nivå. Hänvisningar till olika studier som anknyter kvantifiering av cellulära processer till resultat från biokemiska och molekylära analyser i olika arter och organ. Xyloglukan endotransglucosylase (XET), malondialdehyd (MDA), cyklinberoende kinaser (CDK). Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande protokoll för kinematisk analys gäller endast för bladen under steady-state tillväxt. Detta innebär en stabil bladdraghastighet och spatiala mönster av cell längd och expansion i ett blad under en period av flera dagar 6.
1. Växternas tillväxt och mätningar av Leaf Förlängning Rate (LER)
- Välj ett löv i steady-state tillväxt och utvecklingsstadium intresse.
OBS: Det finns en skillnad mellan steady-state tillväxt och repetitiva tillväxt, vilket innebär liknande rumsliga mönster på varandra följande blad på samma axel. Under de tidiga stadierna av planttillväxt, successiva blad växer vanligtvis allt snabbare på grund av den ökande storleken på tillväxtzonen 7. Även några högre bladpositioner kan ha en liknande tillväxtmönster 8, är detta en övergående fas som kan påverkas av behandlingar under utredning. Det är därför viktigt att jämföra linjer och tr eatments strikt på samma blad läge, även om det kan vara att utveckla vid en annan tidpunkt. Även vid en konstant draghastighet, är tillväxttakten profilen inte nödvändigtvis densamma vid olika utvecklingsstadier. Därför är det viktigt att analysera bladen vid samma utvecklingsstadium 8, typiskt definieras av antalet dagar efter uppkomst. - För att utföra en fullständig kinematisk analys av bladtillväxt i monokotyledoner, växa åtminstone 15 anläggningar för varje behandling och genotyp under kontrollerade förhållanden i ett odlingsrum.
- Vid den tidpunkt då blad intresse visas (uppkomst från krans av omgivande blad), börja mäta längden av bladet dagligen med en linjal tills bladet är fullt utbyggt (Figur 1i). Bladlängden innebär längden från jordnivå till spetsen av bladet. Var noga med att inte bryta eller skada blad, eftersom detta kan förändra dess tillväxt.
re en "src =" / filer / ftp_upload / 54.887 / 54887fig1.jpg "/>
Figur 1:. Schematisk översikt av en kinematisk analys av löv majs Bladet av intresse mäts med en linjal under tre dagar för att beräkna Leaf Förlängning Rate (LER). Därefter blad skördas och en tre-centimeter segment används för bestämning av meristem storlek. Detta görs genom att mäta längden från basen upp till den mest distala mitotiska figur efter DAPI-färgning. (A) Exempel på proliferativa mitotiska siffror och (B) formativa mitotiska siffror. De första elva centimeter från bladbasen på den andra sidan av mitt ven används för att skära tio en centimeters segment för mätningar cell längd. Dessa mätningar utgör grunden för att skapa celllängdprofil, som tjänar till att bestämma den mogna cellen längd (l matta) och längden av celler som lämnar meristem (l div) den. De
2. skörd
- På utvecklingsstadiet av intresse (t.ex., den tredje dagen efter uppkomst), välja minst fem representativa pdena från det parti som att genomföra den kinematiska analysen. Fortsätt att mäta resten av växterna som beskrivs i steg 1,3 för att bestämma den slutliga bladlängden.
- Skär ovan jord del av anläggningen. För att hålla meristematisk del intakt, skär så nära som möjligt till rötterna (figur 1ii).
- Utgående från de yttre bladen, ta bort alla blad upp till bladet av intresse genom att försiktigt rulla dem en efter en. Om det behövs, ta bort några extra millimeter från basen för att ta bort bladen. Också bort spets och små blad som omges av löv av intresse (Figur 1iii).
- Skär en 3 cm segment, med start från basen på en sida om mitt venen, och lagra den i ett 1,5 ml provrör som fylls med 3: 1 (volym: volym) absolut etanol: ättiksyralösning (FÖRSIKTIGHET: bära handskar) vid 4 ° C under 24 h upp till flera månader (Figur 1iv). Detta segment kommer senare att användas för att bestämma längden på meristem.
- Frånandra sidan av venen, skär ett 11 cm långt segment av basen (Figur 1 v) och placera den i ett 15 ml rör fyllt med absolut etanol vid 4 ° C under åtminstone 6 h för att avlägsna pigment (Figur 1 vi).
OBS: Senare, använder bara de första 10 cm för att bestämma cell längd profilen (se diskussion). - Förnya absolut etanol för ytterligare en runda av städning vid 4 ° C under åtminstone 24 timmar (Figur 1vi).
- Slutligen, ersätta absolut etanol med ren mjölksyra (OBS: handskar) för rengöring och lagring vid 4 ° C under 24 timmar eller tills vidare användning (Figur 1vi).
3. meristem Längd Mått
- Bered en sköljbuffert innehållande 50 mM natriumklorid (NaCl), 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA; FÖRSIKTIGHET: handskar) och 10 mM Tris (hydroximetyl) aminometan-saltsyra (Tris-HCl; pH 7).
- Ta 3 cm långt segment från avsnitt 2.4 och såak den i bufferten för 20 min (figur 1vii).
- Medan du väntar, använd sköljbuffert för att framställa en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgningslösning av 1 pg / ml, hålla den på is och i mörker.
- Färga kärnorna genom att placera meristem segmentet för 2-5 minuter i DAPI färglösningen. Arbeta på is och i mörker (Figur 1vii).
- Kontrollera om fluorescenssignalen genom att snabbt montera segment på en mikroskopi glas och täcka den med ett täckglas. De epidermala celler bör visa fluorescens, medan de underliggande cellskikt inte borde.
- Om färgningen inte är tillräcklig, placera segmentet tillbaka i DAPI-färgning lösning för några extra minuter.
- För att stoppa färgning montera segment i en droppe sköljning buffert på en mikroskopi bild och täck med ett täckglas.
- Använda ett mikroskop utrustat med UV-fluorescens vid en 20X förstoring, vilket möjliggör visualisering av omkring 1000 EpiDermal-celler på en gång. Rulla hela segmentet och leta efter proliferativa mitotiska siffror (metafas, anafas, telofas och cytokines), men undvik formativ celldelning av utvecklings stomata (Figur 1viii) 9. Definiera var den mest distala mitotiska figur ligger.
- Bestämma längden av meristem genom att mäta avståndet mellan basen av bladet och den mest distala epidermal mitotisk figur. Använda en bild-analysmjukvara (t.ex. ImageJ) för att mäta den fulla längden av bildramen.
- Räkna antalet bildrutor som täcker hela meristem längd (från bladbasen till den mest distala mitotiska figur) och multiplicera detta tal med längden av en ram för att få hela meristem längd (Figur 1ix).
4. Cell Längd Profil
- Ta det segment som lagras i mjölksyra (steg 2,5) och placera den försiktigt på bänken. Skär segment witha skalpell i 10 delar av en cm vardera (figur 1x).
- Montera de successiva bladsegmenten på en mikroskopi bild i en liten droppe av mjölksyra. Se till att alltid möta antingen adaxial eller abaxial uppåt. I princip finns det ingen preferens för en viss sida.
- Använda ett mikroskop utrustat med differentialinterferenskontrast (DIC) optik för att analysera de segment, med början från bladbasen. Mät med ett bildanalysprogram längden på minst 20 replikat epidermala celler i filer direkt anslutning till stomatala filer för att konsekvent välja samma celltyp.
- Gör detta med jämna positioner längs varje segment (4 positioner per segment räcker), och se till att skriva ner motsvarande position för varje mätning hela bladet (Figur 1xi).
- Bestämma den genomsnittliga celllängden vid varje mm längs bladaxeln med hjälp av en lokal polynom utjämning pÖRFARANDE, genomförs på ett R-script (Figur 1xii, Kompletterande fil 1).
OBS! R-skript är ett dataserier med ökande utjämning. Hur mycket utjämning som krävs är något godtycklig och helst bör bara ta bort den lokala buller, men inte påverka den totala kurvan. Se till att använda samma mängd utjämning för alla prover inom ett experiment. - Genomsnitt celllängden vid varje position mellan växter och beräkna medelfelet för att skapa en cell längd profil längs bladaxeln.
5. Beräkningar av Kinematiska parametrar (se kompletterande fil 2)
- Beräkna LER genom att förändringen i bladlängd mellan två på varandra följande tidpunkter (t.ex. 24 h, som i steg 1,3) och dividera den med tidsintervall.
- Beräkna längden på odlingszonen (L gz) motsvarande läget distalt från basen, där cellerna når 95% av sin mogna cell längd på den utjämnade celllängden profil.
- Ta till varje position på den utjämnade celllängden profil 95% av genomsnittet av alla cell längder efter den positionen (Figur 2).
- Jämför den utjämnade cell längd (steg 4,4) med den beräknade 95% cell längd vid varje position. Med utgångspunkt från basen av bladet slutar tillväxtzonen på den plats där den aktuella celllängden motsvarar 95% av följande celllängder (Figur 2, se tilläggsdata 2).
Figur 2:. Fastställande av slutet av tillväxtzonen meristem: Vid det läge som indikeras med en röd stjärna, är den faktiska cellstorlek som är mindre än 95% (röd streckad linje) av den genomsnittliga cellstorleken hos alla celler efter denna position (röd fast substans linje). I slutet av odlingszonen (L gz, angiven med ablue stjärna) ligger där 95% (prickade blå linje) av den genomsnittliga cellstorleken hos alla celler efter denna position (heldragen blå linje) är lika med den faktiska cellstorleken. Division zon (D), töjning zonen (E) och mogna zon (M). Streckade pilarna visar konvergensen mellan den lokala storlek och 95% av den genomsnittliga storleken över den distala delen av bladet när du flyttar från de basala positioner till spetsen av bladet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Beräkna längden på töjningszonen (L EL) som skillnaden mellan längden på odlingszonen (L gz) och meristem storlek (L mer; bestäms i steg 3).
- Beräkna den mogna cell längd (l matta) som den genomsnittliga celllängden i mogna zonen.
- Dividera LER av l mattan för att erhållacellproduktionshastigheten (P).
- Beräkna antalet celler i töjningszonen (N el) som skillnaden mellan N gz och N meren. Antalet celler i meristem (N mer) är lika med kumulativa antalet celler som finns i intervallen som motsvarar meristem. Antalet celler i odlingszonen (N gz) är lika med den kumulativa antalet celler som finns i de intervall som motsvarar tillväxtzonen.
- Beräkna den genomsnittliga celldelningshastighet (D) som P / N meren. Cellcykeln löptid (T c) är lika med ln (2) / D.
- Beräkna tiden i förlängningen zonen (T el) genom att dividera N el av P. Tiden i division zonen lika log 2 (N mer) * T c. Längden av celler som lämnar meristem (l div)är lika med cell längd från den utjämnade celllängden profil i slutet av meristem.
- Beräkna den genomsnittliga cellexpansionstakt (R el) med hjälp av följande formel: ln (l matta) -ln (l div)] / T el.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi en jämförelse mellan välvattnade växter (kontroll, 54% markvatteninnehåll, (SWC)) och växter utsätts för torkstressförhållanden (torka, 34% SWC) i termer av deras bladtillväxt. Alla växter odlades i en tillväxtkammare under kontrollerade förhållanden (16 timmar dag / 8 timmar natt, 25 ° C / 18 ° C dag / natt, 300-400 μEm -2 s -1 fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR). De torka fastställdes genom att undanhålla vatten tills rätt SWC nåddes och sedan ytterligare underhållas. i en förstudie visade det definieras som den femte bladet är den första att dyka upp och utvecklas under denna spänningstillstånd. Därför var det valts som blad intresse. den slutliga Leaf Längd (LL) i torkstressutsatta plantor var 40% lägre än ett av de välvattnade växter, vilket berodde på en lägre LER (tabell 3). för att förstå den cellulära grunden för leaf tillväxtsvar, genomförde vi en kinematisk analys. Totalt sett är bladdraghastighet en funktion av cellproduktion i meristem och mogna cellstorlek bestämdes i töjningszonen (Figur 3). Därför måste förkortningen av bladet bero på effekter på en eller båda av dessa parametrar. Våra resultat visar att medan den mogna cell längd (l matta) inte påverkades, var cellproduktionshastigheten (P) reduceras med 71% (tabell 3). L mattan beror på längden av cellerna som lämnar meristem (l div) , den tid dessa celler tillbringar i töjningszonen (T el), och den relativa cellexpansionshastigheten (R el). Ingen effekt observerades för l div, medan R el minskade med 67% under de torka. Denna effekt kompenserades av nästan tredubbling av T el, vilket resulterade i samma l mattan </ Sub> som i kontrollförhållanden. Minskningen i cellproduktionshastigheten var i sin tur orsakas av både en lägre genomsnittlig celldelningshastighet (D) och ett mindre antal celler i meristem (N-mer). Längden av meristem (L mer) reducerades i motsats till längden av odlingszonen (L gz), som inte påverkades nämnvärt. Sammanfattningsvis visar dessa resultat att i det här fallet, antalet celler, till skillnad från cellstorlek, hade en viktig roll i att bestämma bladstorlek.
| kinematiska parametrar | C | D | % Förändring CD | p-värde |
| LL | 727 ± 15 | 436 ± 23 | -40 | 0,000 |
| LER (mm / h) | 2,8 ± 0,1 | 0,8 ± 0,0 | -73 | 0,000 |
| l matta (| im) | 140 ± 3 | 130 ± 6 | -7 | NS |
| P (celler / h) | 20 ± 1 | 6 ± 0 | -71 | 0,000 |
| D (celler · cell -1 · tim -1) | 0,028 ± 0,003 | 0,010 ± 0,001 | -63 | 0,000 |
| T ^ (h) | 26 ± 3 | 71 ± 7 | 173 | 0,000 |
| T div (h) | 249 ± 27 | 656 ± 71 | 164 | 0,000 |
| L mer (mm) | 15 ± 1 | 11 ± 1 | -25 | 0,010 |
| N mer | 740 ± 31 | 590 + 20 | -20 | 0,000 |
| R el (xm · xm | 0,043 ± 0,002 | 0,014 ± 0,001 | -67 | 0,000 |
| l div (| im) | 24 ± 2 | 23 ± 2 | -4 | NS |
| T el (h) | 42 ± 2 | 125 ± 11 | 199 | 0,000 |
| N el | 844 ± 54 | 735 ± 65 | -13 | NS |
| L g z (mm) | 68 ± 1 | 61 ± 5 | -11 | NS |
| N g z | 1584 ± 33 | 1326 ± 66 | -16 | 0,010 |
Tabell 3. Kinematisk analys av celldelning och cellexpansion under steady-state tillväxt femte blad. välvattnade växter och växter utsätts för torkstress Data är medelvärden ± SE (n = 5, för LL: n = 10). Students t-test användes som statistisk analys. Parametrar: blad längd (LL), blad töjning rate (LER), mogen cell längd (L matta), cellproduktionshastigheten (P), celldelning ränta (D), cellcykellängd (T c), tid i division zonen ( T div), längden av meristem (L mer), antalet celler i meristem (N-mer), relativ cellförlängning hastigheten (R el), längd av cellerna som lämnar meristem (l div), tid i töjningszonen (T el), antalet celler i töjningen zonen (N el), längden av odlingszonen (L gz), antalet celler i odlingszonen (N gz), välvattnade betingelser (C), torkstress ( D), en d inte signifikant (NS).
Figur 3:. Förhållandet mellan de kinematiska parametrarna Den slutliga bladlängd (LL) beror på Leaf Töjning Rate (LER), som i sin tur beror på produktionscellen (P) och mogen cell längd (l matta). Antalet celler i meristem (N-mer) och celldelningshastigheten (D) tillsammans bestämma P, med en cellcykelvaraktigheten (T c) i form av inversen av D. Tid i töjningszonen (T el), längd av celler som lämnar meristem (l div), och den relativa cellexpansionshastigheten (R el) bestämma den mogna cell längd (l matta). Antalet celler i töjningszonen (N el)..jove.com / filer / ftp_upload / 54.887 / 54887fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förutom dess tillämpning som en detaljerad analys av tillväxt organ, ger kinematisk analys en karta över blad tillväxtzonen lokalisering och tillåter provtagning med en subzonal upplösning för molekylär och biokemiska analyser 4,10,11. Som ett exempel visar figur 4A malondialdehyd (MDA) kvantifiering längs tillväxtzonen av bladet majs i växter som utsatts för samma betingelser som ovan. MDA är en sekundär metabolit bildas under lipidperoxidation genom ROS och återspeglar nivåerna av oxidativ skada 12. MDA mättes i varje centimeter av bladet, från sin bas, vilket möjliggjorde analys av koncentrationsförändringar längs tillväxt gradient 11. Eftersom behandlingen torkan orsakade 40% blad matfett, längden på de utvecklingszoner (meristam, töjning zon och mogna zon) i kontrollplantorna matchade inte längden på samma zoner i torkan stressade växter (Figur 4B). Som ses i figur 4B, meristem i kontrollplantorna var omkring 1,5 cm lång, och töjningen zonen sträckte från 1,5 till 6,8 cm från bladbasen. I stressutsatta plantor var meristem lokaliserad från 0 till 1,1 cm och töjning zonen från 1,1 till 6,1 cm. MDA nivåer och hela tillväxtzonen ökades i torkstressutsatta plantor jämfört med kontrollbehandling. Med hjälp av den kinematiska analysen, kunde vi dra slutsatsen att MDA-halten i synnerhet ökas i det mogna zonen för både kontroll- och torka behandlingar. Utan att veta storleken på de utvecklingsområden, skulle vi dra slutsatsen att under torkstress, MDA innehåll ökar i en tidigare utvecklingsstadium än i kontrollanläggningar, som skulle vara fel eftersom det inte tar hänsyn till förskjutning av zonerna på grund till than blad förkortning. Därför utför kinematisk analys innan de biokemiska mätningar var av avgörande betydelse för att tolka data på rätt sätt.
Figur 4: Exempel på högupplösta biokemiska mätningar och provtagning för detaljerad analys (A) malonaldehyd (MDA) koncentrationer som uppmätts längs majs blad tillväxtzonen (uppdelat i tio delar) av växter som odlas i väl vattnade tillstånd och växter utsätts för torka. behandling 10. Data är medelvärden ± SE (n = 5). Tvåvägs ANOVA användes som en statistisk analys, och p-värden presenteras intill grafen panelen (faktorer: torka (d) och segment (s)); FW: färskvikt. (B) Visualisering av de olika tillväxtzonerna i kontroll och torka stressutsatta plantor. Division zon (D), töjning zonen (E), ochmogna zon (M). Celler förstorade 125 gånger. (C) Cell-längd profilen för kontroll och torka-behandlade växter. Data är medelvärden ± SE (n = 5). (D) Skillnader i fokuserad provtagning i både kontroll- och torka behandlade plantor. De blå rutorna anger provtagningspositionen att jämföra samma utvecklingsstadium i båda behandlingarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förutom att ge möjlighet att jämföra samma utvecklingszoner i högupplösta studier, kan den kinematiska analysen också användas som underlag för mer fokuserade analyser, där endast prover av specifika zoner innehållande celler på samma utvecklingsstadium tas. Vi jämförde celllängdprofiler, som tillhandahålls av utjämning av de mikroskopiska mätningar cell längd, i de första tio centimeters från bladbasen kontroll och torka stressutsatta plantor. Figur 4C visar att med hjälp av cell längd profilen, kan vi bestämma längden på utvecklingsområden och kan också följa tillväxttakten dynamik i både kontroll- och torka stressutsatta plantor. Detta möjliggjorde specifik provtagning av förökande celler i meristem (före den kraftiga ökningen), expanderande celler i förlängningen zonen (i mitten av den kraftiga ökningen) och unga mogna celler i mogen zonen (början av platån). Våra resultat visar att, på grund av blad matfettet som svar på torka, har dessa zoner motsvarar inte i kontrollen och i de stressade plantor. För att prova frodas, expanderar och unga mogna celler i kontrollplantor, vi behövde först, femte och nionde centimeter från bladbasen, respektive. Men i de stressade plantorna, dessa segment motsvarar den första, fjärde, och åttonde centimeter, respektive. Denna typ av mer fokuseradprovtagning har visat sig vara användbara i fall av mer mödosamma, dyra, eller tidskrävande studier, såsom RNA-sekvensering, proteomik, metabolomik, etc.
Kompletterande fil 1. R-script för polynom utjämningsförfarande högerklicka för att ladda ner filen.
Kompletterande fil 2. Beräkningar av kinematiska parametrar högerklicka för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fullständig kinematisk analys på blad majs möjliggör fastställandet av den cellulära grund av bladtillväxt och gör det möjligt att utformningen av effektiva strategier för provtagning. Även om protokollet är relativt enkelt, är viss försiktighet rekommenderas i följande kritiska steg: (1) Det är viktigt att ta bort de yngre, slutna blad (steg 2,3) utan att skada meristem, eftersom meristem längdbestämning (steg 3) kräver den fullständiga meristem att närvara. Lite övning i förväg kan behövas. (2) meristem längdbestämning är baserad på tolkningen av mitotiska figurer. Därför rekommenderar vi att inom ett experiment, samma person utför dessa mätningar för att minska variansen på grund av testamentsexekutor. (3) Även om endast tio centimeter används för de faktiska måtten cell längd, är det viktigt att inkludera elva centimeter Vid skörd av segmentet för mätningar cell längd (steg 2,5), eftersom kanten av segmentet gör ingett alltid helt dränka i etanol och / eller mjölksyra. Därför ger denna extra centimeter clearing av de första tio centimeter i tillväxtzonen. (4) I slutändan är det lämpligt att inspektera resultatet av alla kinematiska parametrar för att bekräfta att de är korrekta. I tabell 3, till exempel, var cellproduktionshastigheten (P) för de torkstressutsatta plantor minskade med 71%, eller, med andra ord är P torka 0,29 av P-reglering. Eftersom produktionscellen beror i genomsnitt celldelningshastigheten (D, -63%) och antalet celler i meristem (N mer, -20%, Figur 3), kan följande användas för att validera utgång: P (0,29) ≈ N mer (0,8) x D (0,37). Detsamma kan sökas LER = P x I matta.
Beroende på tillgängliga resurser, kan protokollet modifieras i vissa steg. (1) ett merVANCERADE alternativ för de dagliga manuella mätningar bladlängd (steg 1,3) är baserad på linjär hastighet förskjutningsomvandlare (LVDT: er) 13. Dess fördel är att det medger mätning vid en mycket högre tidsupplösning, som sträcker sig från minuter till sekunder. (2) Det är viktigt att inkludera hela tillväxtzonen under provtagning. Men miljöförhållanden, genotyp, art och utvecklingsstadiet granskas kan förändra längden på tillväxtzonen. Därför är det lämpligt att göra en första uppskattning av längden på tillväxtzonen som svar på experimentet behandling. Detta protokoll är baserad på den inavlade linjen B73 odlades vid 25 ° C / 18 ° C (dag / natt) på 300-400 μEm -2 s -1 (Photo Aktiv Strålning - PAR). (3) För att visualisera de mitotiska siffror (steg 3,8) utan att använda fluorescens, kan en Fuelgen fläck tillämpas 14. (4) utjämning av data kan också göras i MS Excel i stället för R med hjälp av en femgradig quadratic montering med "REGR" -funktionen 15.
En viktig begränsning med denna teknik är att hela tillväxtzonen måste skördas under steady-state tillväxt. För att säkerställa steady-state tillväxt måste växter helst odlas under kontrollerade odlingsbetingelser, eftersom variationer i ljusintensitet, temperatur, eller fukt påverkar bladet töjningshastigheten 16. Av denna anledning är den kinematiska analysen mindre lämpad för växter som odlas under fältförhållanden. En annan nackdel är att bladen måste framkommit, vilket gör det omöjligt att undersöka blad som fortfarande inneslutna av äldre blad. Slutligen är det protokoll som lämpar sig för monokotyledona arter med stora tillväxtzoner som omfattar åtminstone några centimeter. En kinematisk analys på mindre monokotyledoner (t.ex. Poa, ris), dock är möjligt men behöver några ändringar i provberedningen 17,18.
En annan ofta användd metod för att analysera differentiella tillväxt fenotyper är den klassiska tillväxtanalys. Denna analys kvantifierar hela växt relativa tillväxttakter och bestämmer den underliggande fördelningen av foto härledd kol i en ny foto område och till andra delar av anläggningen 19. Den kinematiska analys, dock möjliggör en mer detaljerad förståelse av de bakomliggande cellulära processer som är kopplade till tillväxt fenotyper baserat på kvantifiera celldelning och expansion. Vidare har möjligheten att bestämma längden på varje odlingszonen möjliggör korrelationen av molekylära mätningar utmed bladaxeln till det specifika utvecklingsstadiet som påverkas av behandlingen under studien. Detta är avgörande för tolkning av data. När tidsbegränsat eller budgeten eller när intresserade av specifika utvecklingsstadier, resultatet av denna analys möjliggör fokuserad provtagning, minska antalet prov som behövs för analys. Sammanfattningsvis, kinematisk analys möjliggörär bestämningen av cellulära parametrar som ligger till grund stressreaktioner och genetisk variation i bladtillväxt och kan länka dem till uppströms regulatoriska processer (tabell 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en PhD stipendium från universitetet i Antwerpen till VA; en PhD stipendium från den flamländska Science Foundation (FWO, 11ZI916N) till KS; projektbidrag från FWO (G0D0514N); en samordnad forskningsaktivitet (GOA) forskningsanslag, "A systembiologi strategi från Leaf Morfogenes" från forskningsrådet vid universitetet i Antwerpen, och Interuniversitets sevärdhet polacker (IUAP VII / 29 MARS), "Majs och Arabidopsis rot- och skott tillväxt" från den belgiska federala forskningspolitiska Office (BELSPO) till GTSB Han Åsard, Bulelani L. Sizani och Hamada AbdElgawad bidrog till video .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pots | Any | Any | We use pots with the following measures, but can be different depending on the treatment/study: bottom diameter: 11 cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot. |
| Planting substrate | Any | Any | We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study. |
| Ruler | Any | Any | An extension ruler that covers at least 1.5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants. |
| Seeds | Any | NA | Seeds can be ordered from a breeder. |
| Scalpel | Any | Any | The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
| 15 mL falcon tubes | Any | Any | The 15 mL falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid. |
| Eppendorf tubes | Any | Any | The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution. |
| Gloves | Any | Any | Latex gloves, which protect against corrosive reagents. |
| Acetic acid | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3 |
| Absolute ethanol | Any | Any | CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion |
| Lactic acid >98% | Any | Any | CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1 |
| Sodium chloride (NaCl) | Any | Any | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Any | Any | CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3 |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) | Any | Any | This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Any | Any | Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation. |
| Ice | Any | NA | The DAPI solution has to be kept on ice. |
| Fluorescent microscope | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length. | |
| Microscopic slide | Any | Any | |
| Cover glass | Any | Any | |
| Tweezers | Any | Any | Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements. |
| Image-analysis software | Axiovision (Release 4.8) from Zeiss | NA | The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well. |
| Microscope equipped with DIC | AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other | Any microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths. | |
| R statistical analysis software | R Foundation for Statistical Computing | NA | Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/ |
| R script | NA | NA | We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC. Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquiry with the corresponding author. |
References
- Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Quantitative analyses of cell division in plants. Plant Mol. Biol. 60, 963-979 (2006).
- Silk, W. K., Erickson, R. O.
- Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Chapter 14 (2010).
- Avramova, V., Sprangers, K., Beemster, G. T. S. The Maize Leaf: Another Perspective on Growth Regulation. Trends Plant Sci. 20, 787-797 (2015).
- Rymen, B., et al. Cold nights impair leaf growth and cell cycle progression in maize through transcriptional changes of cell cycle genes. Plant Physiol. 143, 1429-1438 (2007).
- Muller, B., Reymond, M., Tardieu, F. The elongation rate at the base of a maize leaf shows an invariant pattern during both the steady-state elongation and the establishment of the elongation zone. J. Exp. Bot. 52, 1259-1268 (2001).
- Beemster, G. T. S., Masle, J., Williamson, R. E., Farquhar, G. D. Effects of soil resistance to root penetration on leaf expansion in wheat (Triticum aestivum L): Kinematic analysis of leaf elongation. J. Exp. Bot. 47, 1663-1678 (1996).
- Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Spatial and Temporal Aspects of Leaf Growth-Inhibition. Planta. 191, 433-439 (1993).
- Sylvester, A. W., Smith, L. G. Cell Biology of Maize Leaf Development. Handbook of maize: It's Biology. Bennetzen, J. L., Hake, S. C. , Springer. NY. (2009).
- Nelissen, H., et al. A Local Maximum in Gibberellin Levels Regulates Maize Leaf Growth by Spatial Control of Cell Division. Curr. Biol. 22, 1183-1187 (2012).
- Avramova, V., et al. Drought Induces Distinct Growth Response, Protection, and Recovery Mechanisms in the Maize Leaf Growth Zone. Plant Physiol. 169, 1382-1396 (2015).
- Picaud, J. C., et al. Total malondialdehyde (MDA) concentrations as a marker of lipid peroxidation in all-in-one parenteral nutrition admixtures (APA) used in newborn infants. Pediatr. Res. 53, 406 (2003).
- Basu, P., Pal, A., Lynch, J. P., Brown, K. M. A novel image-analysis technique for kinematic study of growth and curvature. Plant Physiol. 145, 305-316 (2007).
- Vander Weele, C. M., et al. A new algorithm for computational image analysis of deformable motion at high spatial and temporal resolution applied to root growth. Roughly uniform elongation in the meristem and also, after an abrupt acceleration, in the elongation zone. Plant Physiol. 132, 1138-1148 (2003).
- Nelissen, H., Rymen, B., Coppens, F., Dhondt, S., Fiorani, F., Beemster, G. T. S. Plant Organogenesis. DeSmet, I. , Chapter 17 (2013).
- Ben-Haj-Salah, H., Tardieu, F. Temperature Affects Expansion Rate of Maize Leaves without Change in Spatial-Distribution of Cell Length - Analysis of the Coordination between Cell-Division and Cell Expansion. Plant Physiol. 109, 861-870 (1995).
- Fiorani, F., Beemster, G. T. S., Bultynck, L., Lambers, H. Can meristematic activity determine variation in leaf size and elongation rate among four Poa species? A kinematic study. Plant Physiol. 124, 845-855 (2000).
- Pettko-Szandtner, A., et al. Core cell cycle regulatory genes in rice and their expression profiles across the growth zone of the leaf. J. Plant Res. 128, 953-974 (2015).
- Poorter, H., Remkes, C. Leaf-Area Ratio and Net Assimilation Rate of 24 Wild-Species Differing in Relative Growth-Rate. Oecologia. 83, 553-559 (1990).
- Macadam, J. W., Volenec, J. J., Nelson, C. J. Effects of Nitrogen on Mesophyll Cell-Division and Epidermal-Cell Elongation in Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 89, 549-556 (1989).
- Tardieu, F., Granier, C. Quantitative analysis of cell division in leaves: methods, developmental patterns and effects of environmental conditions. Plant Mol. Biol. 43, 555-567 (2000).
- Bernstein, N., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Development of Sorghum Leaves under Conditions of Nacl Stress - Possible Role of Some Mineral Elements in Growth-Inhibition. Planta. 196, 699-705 (1995).
- Erickson, R. O., Sax, K. B. Rates of Cell-Division and Cell Elongation in the Growth of the Primary Root of Zea-Mays. P. Am. Philos. Soc. 100, 499-514 (1956).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Goodwin, R. H., Stepka, W. Growth and differentiation in the root tip of Phleum pratense. Am. J. Bot. 32, 36-46 (1945).
- Hejnowicz, Z. Growth and Cell Division in the Apical Meristem of Wheat Roots. Physiologia Plantarum. 12, 124-138 (1959).
- Gandar, P. W. Growth in Root Apices .1. The Kinematic Description of Growth. Bot. Gaz. 144, 1-10 (1983).
- Baskin, T. I., Cork, A., Williamson, R. E., Gorst, J. R. Stunted-Plant-1, a Gene Required for Expansion in Rapidly Elongating but Not in Dividing Cells and Mediating Root-Growth Responses to Applied Cytokinin. Plant Physiol. 107, 233-243 (1995).
- Sacks, M. M., Silk, W. K., Burman, P. Effect of water stress on cortical cell division rates within the apical meristem of primary roots of maize. Plant Physiol. 114, 519-527 (1997).
- Granier, C., Tardieu, F. Spatial and temporal analyses of expansion and cell cycle in sunflower leaves - A common pattern of development for all zones of a leaf and different leaves of a plant. Plant Physiol. 116, 991-1001 (1998).
- De Veylder, L., et al. Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell. 13, 1653-1667 (2001).
- Kwiatkowska, D. Surface growth at the reproductive shoot apex of Arabidopsis thaliana pin-formed 1 and wild type. J. Exp. Bot. 55, 1021-1032 (2004).
- Kutschmar, A., et al. PSK-alpha promotes root growth in Arabidopsis. New Phytol. 181, 820-831 (2009).
- Vanneste, S., et al. Plant CYCA2s are G2/M regulators that are transcriptionally repressed during differentiation. Embo J. 30, 3430-3441 (2011).
- Eloy, N. B., et al. Functional Analysis of the anaphase-Promoting Complex Subunit 10. Plant J. 68, 553-563 (2011).
- Eloy, N. B., et al. SAMBA, a plant-specific anaphase-promoting complex/cyclosome regulator is involved in early development and A-type cyclin stabilization. P. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 13853-13858 (2012).
- Dhondt, S., et al. SHORT-ROOT and SCARECROW Regulate Leaf Growth in Arabidopsis by Stimulating S-Phase Progression of the Cell Cycle. Plant Physiol. 154, 1183-1195 (2010).
- Baute, J., et al. Correlation analysis of the transcriptome of growing leaves with mature leaf parameters in a maize RIL population. Genome Biol. 16, (2015).
- Andriankaja, M., et al. Exit from Proliferation during Leaf Development in Arabidopsis thaliana: A Not-So-Gradual Process. Dev. Cell. 22, 64-78 (2012).
- Beemster, G. T. S., et al. Genome-wide analysis of gene expression profiles associated with cell cycle transitions in growing organs of Arabidopsis. Plant Physiol. 138, 734-743 (2005).
- Spollen, W. G., et al. Spatial distribution of transcript changes in the maize primary root elongation zone at low water potential. Bmc Plant Biol. 8, (2008).
- Candaele, J., et al. Differential Methylation during Maize Leaf Growth Targets Developmentally Regulated Genes. Plant Physiol. 164, 1350-1364 (2014).
- West, G., Inze, D., Beemster, G. T. S. Cell cycle modulation in the response of the primary root of Arabidopsis to salt stress. Plant Physiol. 135, 1050-1058 (2004).
- Zhang, Z., Voothuluru, P., Yamaguchi, M., Sharp, R. E., Peck, S. C. Developmental distribution of the plasma membrane-enriched proteome in the maize primary root growth zone. Front. Plant Sci. 4, (2013).
- Bonhomme, L., Valot, B., Tardieu, F., Zivy, M. Phosphoproteome Dynamics Upon Changes in Plant Water Status Reveal Early Events Associated With Rapid Growth Adjustment in Maize Leaves. Mol. Cell Proteomics. 11, 957-972 (2012).
- Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Assimilate Partitioning in the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades at High and Low Irradiance. Plant Physiol. 90, 1201-1206 (1989).
- Schnyder, H., Nelson, C. J., Spollen, W. G. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .2. Dry-Matter Partitioning and Carbohydrate-Metabolism in the Elongation Zone and Adjacent Expanded Tissue. Plant Physiol. 86, 1077-1083 (1988).
- Schnyder, H., Nelson, C. J. Growth-Rates and Carbohydrate Fluxes within the Elongation Zone of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 85, 548-553 (1987).
- Vassey, T. L., Shnyder, H. S., Spollen, W. G., Nelson, C. J. Cellular Characterisation and Fructan Profiles in Expanding Tall Fescue. Curr. T. Pl. B. 4, 227-229 (1985).
- Allard, G., Nelson, C. J. Photosynthate Partitioning in Basal Zones of Tall Fescue Leaf Blades. Plant Physiol. 95, 663-668 (1991).
- Spollen, W. G., Nelson, C. J. Response of Fructan to Water-Deficit in Growing Leaves of Tall Fescue. Plant Physiol. 106, 329-336 (1994).
- Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .1. Relationship to Genetically Altered Leaf Elongation Rates. Plant Physiol. 74, 590-594 (1984).
- Volenec, J. J., Nelson, C. J. Carbohydrate-Metabolism in Leaf Meristems of Tall Fescue .2. Relationship to Leaf Elongation Rates Modified by Nitrogen-Fertilization. Plant Physiol. 74, 595-600 (1984).
- Silk, W. K., Walker, R. C., Labavitch, J. Uronide Deposition Rates in the Primary Root of Zea-Mays. Plant Physiol. 74, 721-726 (1984).
- Granier, C., Inze, D., Tardieu, F. Spatial distribution of cell division rate can be deduced from that of p34(cdc2) kinase activity in maize leaves grown at contrasting temperatures and soil water conditions. Plant Physiol. 124, 1393-1402 (2000).
- Voothuluru, P., Sharp, R. E. Apoplastic hydrogen peroxide in the growth zone of the maize primary root under water stress.1. Increased levels are specific to the apical region of growth maintenance. J. Exp. Bot. 64, 1223-1233 (2012).
- Wu, Y. J., Jeong, B. R., Fry, S. C., Boyer, J. S. Change in XET activities, cell wall extensibility and hypocotyl elongation of soybean seedlings at low water potential. Planta. 220, 593-601 (2005).
- Macadam, J. W., Nelson, C. J., Sharp, R. E. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .1. Spatial-Distribution of Ionically Bound Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 872-878 (1992).
- Macadam, J. W., Sharp, R. E., Nelson, C. J. Peroxidase-Activity in the Leaf Elongation Zone of Tall Fescue .2. Spatial-Distribution of Apoplastic Peroxidase-Activity in Genotypes Differing in Length of the Elongation Zone. Plant Physiol. 99, 879-885 (1992).
- Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inze, D. Variation in growth rate between Arabidopsis ecotypes is correlated with cell division and A-type cyclin-dependent kinase activity. Plant Physiol. 129, 854-864 (2002).
- Kavanova, M., Lattanzi, F. A., Schnyder, H. Nitrogen deficiency inhibits leaf blade growth in Lolium perenne by increasing cell cycle duration and decreasing mitotic and post-mitotic growth rates. Plant Cell Environ. 31, 727-737 (2008).
- Macadam, J. W., Nelson, C. J. Secondary cell wall deposition causes radial growth of fibre cells in the maturation zone of elongating tall fescue leaf blades. Ann. Bot-London. 89, 89-96 (2002).
- Schnyder, H., Nelson, C. J. Diurnal Growth of Tall Fescue Leaf Blades .1. Spatial-Distribution of Growth, Deposition of Water, and Assimilate Import in the Elongation Zone. Plant Physiol. 86, 1070-1076 (1988).
- Gastal, F., Nelson, C. J. Nitrogen Use within the Growing Leaf Blade of Tall Fescue. Plant Physiol. 105, 191-197 (1994).
- Vanvolkenburgh, E., Boyer, J. S. Inhibitory Effects of Water Deficit on Maize Leaf Elongation. Plant Physiol. 77, 190-194 (1985).
- Silk, W. K., Hsiao, T. C., Diedenhofen, U., Matson, C. Spatial Distributions of Potassium, Solutes, and Their Deposition Rates in the Growth Zone of the Primary Corn Root. Plant Physiol. 82, 853-858 (1986).
- Meiri, A., Silk, W. K., Lauchli, A. Growth and Deposition of Inorganic Nutrient Elements in Developing Leaves of Zea-Mays L. Plant Physiol. 99, 972-978 (1992).
- Neves-Piestun, B. G., Bernstein, N. Salinity-induced inhibition of leaf elongation in maize is not mediated by changes in cell wall acidification capacity. Plant Physiol. 125, 1419-1428 (2001).
- Bouchabke, O., Tardieu, F., Simonneau, T. Leaf growth and turgor in growing cells of maize (Zea mays L.) respond to evaporative demand under moderate irrigation but not in water-saturated soil. Plant Cell Environ. 29, 1138-1148 (2006).
- Westgate, M. E., Boyer, J. S. Transpiration-Induced and Growth-Induced Water Potentials in Maize. Plant Physiol. 74, 882-889 (1984).
- Horiguchi, G., Gonzalez, N., Beemster, G. T. S., Inze, D., Tsukaya, H. Impact of segmental chromosomal duplications on leaf size in the grandifolia-D mutants of Arabidopsis thaliana. Plant J. 60, 122-133 (2009).
- Fleury, D., et al. The Arabidopsis thaliana homolog of yeast BRE1 has a function in cell cycle regulation during early leaf and root growth. Plant Cell. 19, 417-432 (2007).
- Vlieghe, K., et al. The DP-E2F-like gene DEL1 controls the endocycle in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol. 15, 59-63 (2005).
- Boudolf, V., et al. The plant-specific cyclin-dependent kinase CDKB1;1 and transcription factor E2Fa-DPa control the balance of mitotically dividing and endoreduplicating cells in Arabidopsis. Plant Cell. 16, 2683-2692 (2004).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T. S., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
