שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד Published: November 26, 2016 doi: 10.3791/54892

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Xiao Sun¹, Ellie S. Heckscher^1,2

¹Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, ²Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

הזחל תסיסנית היא מערכת מודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות. פרסום זה מתאר את השימוש של ערוצי agarose ליניארי לעורר התקפים מתמשכים של זחילה ושיטות ליניארי לכמת את הדינמיקה של מבנים הזחל במהלך התנהגות זחילה חוזרת.

Abstract

זחילה הזחל תסיסנית מתגלה כמודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות הסנסורית. עם זאת, התנהגות סריקה זחל על משטחים שטוחים פתוחים היא מורכבת, כולל: נעצר, מסתובב, ואת המתפתל. מורכבות זו ברפרטואר של התנועה מעכבת ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך מחזור צעד לזחול יחיד. כדי להתגבר על מכשול זה, ערוצי agarose ליניארי נעשו מגבילי התנהגות זחל ישר, מתמשך, זחילה קצבית. באופן עקרוני, כי ערוצי agarose ואת גוף זחל תסיסנית הם ברורים אופטי, התנועה של מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון-מקודדים גנטיים ניתן לנטר ללא פגע, זחלים-לנוע בחופשיות. בעבר, הזחלים הונחו ערוצים ליניאריים וזחילה ברמת האורגניזם השלם, לפלח שריר נותחו ^1. בעתיד, זחלי זחילה בתעלות יכולים לשמש הדמית סידן לפקח נוירופעילות סופית. יתר על כן, שיטות אלה יכולים לשמש עם זחלים של כל גנוטיפ ועם כל ערוץ מעוצב חוקר. כך הפרוטוקול המובא להלן הוא ישים נרחבת ללימודים באמצעות זחל תסיסנית כמודל להבין שליטה מוטורית.

Introduction

המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד זחילת זחל תסיסנית בפירוט. ניסויים על תנועה שחקו תפקיד חשוב בפיתוח ובדיקת תאוריות על שליטה מוטורית ^2. באופן מסורתי תנועת נחקרת בעלי חיים ימיים (למשל, עלוקה, צמד, ראשן) ^3. האופי החוזר והנשנה של תנועה אצל בעלי חיים אלה אפשר לחקר rhythmogenesis, לניתוח של אירועי biophysical נהיגת תנועה, ולצורך מעקב את דפוסי הירי העצביים שמלווים תנועה.

שימוש זחלים תסיסנית ללימודים של תנועה מציג שילוב ייחודי של יתרונות על פני מערכות מודל אחרות: גנטיקה קלילה, פיתוח היטב מאופיין, גוף ברור אופטי ב instars הראשון והשני, וכן שחזור מיקרוסקופי אלקטרוני שידור מתמשכים של כל מערכת העצבים ^4-6. עם זאת, זחל תסיסנית לוקותנועה על משטחים שטוחים פתוחים מעט מורכבת כולל הפסקות, מסתובבת, המתפתל זוחל ^7. פרסום זה מציג שיטה להשתמש בערוצי agarose ליניארי להנחות התנהגות של תנועת זחל תסיסנית כך זחלים מבצעים מתמשכים, ישר, התנהגות סריקה קצבית.

לימוד התנהגות זחל תסיסנית בערוצי agarose, במקום התנהגות על משטחים פתוחים שטוחים, יש מספר יתרונות. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לבחור זוחל התנהגות במיוחד מתנועות רבות שהן חלק מהרפרטואר ההתנהגותי הזחל. שנית, על ידי התאמת הרוחב של הערוץ אל מול גודל גוף הזחל, מהירות זחילה יכולה להיות מותאמת. שלישית, ערוצי לאפשר הזחל כדי שיוצג מן הגב, הגחון, או צד לרוחב תלוי איך הזחל טעון אוריינטציה בתוך הערוץ. רבגוניות זו באורינטצית זחל מאפשרת לכל מבנה העניין להיות גלוי ללא הרף במהלך סריקה. רביעי,ערוצים ניתנים לשימוש עם מגוון רחב של מיקרוסקופים ויעדים. לדוגמא, ניתן להשתמש בערוצים ליניארית הדמיה ברזולוציה נמוכה על stereoscopes שדה בהיר ו / או הדמיה ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופי confocal-דיסק מסתובב ^1. החמישית, בשיטה זו ניתן להשתמש בשילוב עם optogenetic / מניפולציות עצביות thermogenetic בכל רקע גנטי. לבסוף, כי הן גוף הזחל (ב instars הראשון והשני) וערוצי agarose ברורים אופטי, ערוצים ניתן להשתמש כאשר לומדים את התנועות הדינמיות, או שינויים בעוצמת פלורסנט מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון גנטית בקידוד.

השיטה המתוארת היא מתאימה ללימודי קינמטיקה מפורטים של instar הראשון ושני התנהגות תסיסנית זחל. פרסום זה מנתח את השינויים הדינמיים עוצמת פלורסנט של מערכת העצבים המרכזית במהלך זחילה הזחל קדימה כדי להדגים את השימוש של ערוצים כמבשר neuהדמית סידן רונאל.

Protocol

1. הכנת הזחלים

1. שבוע לפני הקלטת התנהגות, להגדיר צלב (מינימום של 25 בתולות ו -5 גברים). לשמור על כל הצלבים הצאצאים של 25 מעלות צלזיוס.
   הערה: הטמפרטורה של תנאי תרבות ניתן לשנות, אבל קו הזמן המתואר להלן היה צריך להיות מותאם חשבון לשינויים במהירות התפתחותית.
2. 5 ימים לפני ההקלטה, דבר ראשון בבוקר, להציב הצלב לכלוב אוסף עם כובע אגר / מיץ טיפה (0.5-1 מ"ל) של רסק שמרים במרכז הכובע אגר / מיץ.
   1. כדי להפוך כלוב אוסף, חורים לתוך עוז 6. פוליאתילן מרובע בקבוק תסיסנית.
   2. כדי להפוך אגר / כמוסות מיץ, לערבב 18 גרם של אגר עם מיליליטר מי 600 בבקבוק חרוטים. בתוך סוכרוז הבקבוק לערבב 20 גרם נפרד עם מיץ תפוחים 200 מ"ל. מיקרוגל עד מוצקים הם מומסים. מערבבים ומערבבים, המאפשרים לתערובת להתקרר עד 60 ° C. הוסף 20 מ"ל 10% מתיל-p-hydroxybenzoate באתנול 95%, ומערבבים. הוסף ~ 7מ"ל החצי התחתון של צלחת פטרי עגול 10 מ"מ 35 x. אפשר / מיץ אגר לגבש עבור שעה 1 ב RT. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. כדי להפוך להדביק שמרים, מוסיף בחלקים שווים על ידי שמרים ומים יבשים נפח. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. לבדוק את בריאותם של אוספי זחל.
   1. בבוקר, 4 ו -3 ימים לפני ההקלטה, להסיר את הכובע למקם כובע טרי על הכלוב. שנה את הכמוסות באותו הזמן בכל יום כדי להגיע אוסף 24 שעות של ביצי זחל שזה עתה בקע.
   2. לאחר כל כובע המוסר, לבחון את זה כדי לראות כמה ביצי הצלב היא נחת. צפו בין 500-2,000 ביצים. התאם את מספר המבוגרים, אם יש צורך בכך.
      הערה: כמה ביצים צריכות בוקעים רימות, ואת הזחלים שזה עתה בקעו יימצאו הרחק להדביק השמרים.
   3. גיל כל כובע למשך 24 שעות. לבחון מחדש את הכובע כדי לקבוע אם הזחלים הם בריאים.
      הערה: ביצים רוב צריך בקעו רימות, ואת הזחלים צריכים זחל לתוך ye הדבק אס '. סימנים של בריאות לקויה כוללים מספר רב של ביצים שלא נולדו, גופי זחל מתו הרחק להדביק שמרים, וזחלים עם כתמים כהים משמעותיים בבטן, מה שמעיד על תגובה חיסונית. אם הזחלים אינם בריאים, לשנות את הכלוב, להפוך כמוסים טריים / שמרי רסק, ולבדוק את הגנוטיפ.
   4. מחק את הכובעים הישנים.
4. אסוף זחלים להקלטות התנהגותי.
   1. בשני היום 2 ו 1 לפני ההקלטה, להסיר את הכובע ולהחליף עם כובע טרי.
   2. לייבל כל כובע סיר ולשמור על 25 מעלות צלזיוס. זה יהיה לייצר סדרה מבוימת של זחלים להקלטות התנהגותי. הזחלים מן-שזה עתה בקעו (posthatch hr 0-4) באמצעות instar השני (24-48 שעות posthatch) ניתן להשתמש בערוצים. שמור כמוסים להקלטות בימים עוקבים.
   3. מחק את כל הכמוסות לאחר 48 שעות.
   4. במידת הצורך, חזור על שלבי 1.4.1-1.4.3 עד 5 ד נוספים. אחרי זה פחות ביציות מופרות מיוצרים.

= "Jove_title"> 2. הכנת ערוצים

1. הכן את PDMS ערוץ ליניארי (polydimethylsiloxane, אלסטומר סיליקון) הליהוק עובש (איור 1 א). PDMS תבניות יציקה זמין ממעבדת Heckscher לפי בקשה.
   1. נקו את עובש הליהוק עם אלכוהול איזופרופיל. אוויר יבש, טיפה יבשה עם מגבוני מעבדה, או להשתמש ואוויר דחוס.
   2. מניחים את התבנית הליהוק לתוך מכסה צלחת 10 ס"מ פטרי או מיכל אחר.
2. כן ויוצק פתרון agarose.
   1. בצע פתרון agarose 3% במים (3 גרם ב 100 מ"ל) על ידי במיקרוגל עד להמסה מלאה.
   2. מצננים 55 ° C, המאפשר בועות לעלות אל פני השטח.
   3. יוצקים את התערובת agarose לתוך צלחת פטרי שמכילה את עובש הליהוק כך העובש פשוט מכוסה. תן סט agarose עד הקרושה.
3. הסר את ערוצי agarose מתבנית הליהוק. חתוך את הקצוות של הדיסק agarose עם סכין גילוח.
   1. שים את הערוץים בצלחת 10 ס"מ פטרי שקוע במים. הם יכולים להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.

3. העמסת זחל לתוך ערוץ להתנהגות שיא

הערה: אם אחסון ערוצים ב 4 ° C, לאפשר ערוצים לבוא RT לפני השימוש להקלטה התנהגותי.

1. השתמש סכין גילוח נקי לחתוך ערוץ אחד מאלה מוכנים בשלב 2 (איור 2 א).
2. השתמש זוג מלקחיים להציב את מחורץ-בצד למעלה ערוץ על coverslip זכוכית (איור 2 ב). הגודל והעובי של coverslip תלוי בהיקף הספציפי המשמש הדמיה.
3. שימוש במלקחיים בסדר לבחור זחל מן הכובע אגר / המיץ מוכן בשלב 1 ומקום לתוך תעלת החתך (איור 2 ג).
   1. אל תלחצו הזחל. תרימי אותו בעדינות עם קצה של שן מלקחיים. כמו כן ניתן לתפעל זחל עם מכחול עם נקודה בסדר.
      הערה: זה חשוב כמו זחלים הם מאוד sensitive לגעת. אם הם לא מטופלים בזהירות, תגובות nociceptive עלולות להשתלט התנהגותם במהלך השניות הראשונות של הניסוי.
   2. שטפו את הזחלים על ידי השריית אותם בקצרה במים.
   3. לאחר שהניח את הזחל על הערוץ לחתוך, השתמש קצה חוד המלקחיים כדי להקניט את הזחל בעדינות לתוך חורשת הערוץ.
      הערה: עבור מרבית יישומי הרוחב של הזחל ואת הרוחב של הערוץ צריך להתאים. רוחבו הממוצע של הזחלים בשלבים שונים של פיתוח כדלקמן: 0 hr posthatch - 140 מיקרומטר, 24 שעות posthatch - 180 מיקרומטר, 48 שעות posthatch - 320 מיקרומטר, 72 שעות posthatch - 500 מיקרומטר, 96 שעות posthatch - 750 מיקרומטר ^8. ערוצים לבוא הרוחביים הבא: 100, 150, 200, 250, ו -300 מיקרומטר, וכל הערוצים 150 מיקרומטר עמוקים.
   4. השתמשו בקצה שן מלקחיים או מכחול כדי להתאים את המיקום של הזחל בתוך הערוץ. זה יכול להיות מכוון בכל כיוון: גחוןעד, גחון למטה, גחון לצד אחד, בהתאם למבנה מה הוא להיות צלם.
4. בעזרת מלקחיים, להעיף את הערוץ בעדינות על כך הזחל הוא עכשיו על הזכוכית המכסה. מקום אחד או שתי טיפות מים בקצות הערוץ כך שהוא מתמלא מים (2D איור).
   1. הרם בעדינות את צידי התעלה כדי להסיר בועות אוויר.
   2. לשנות את הכיוון של הזחל. לשם כך, בעדינות דחיפה בערוץ אבל לא כוס הכיסוי לגלגל את הזחל. אם זה לא משנה את הכיוון, להסיר את מכסה הזכוכית ולשנות את מיקום זחל. הזחל הוא מוכן להיות צלם.
   3. תמונת הערוץ / coverslip על מיקרוסקופ הפוכה. אם הדמיה על מיקרוסקופ זקוף, פשוט להפוך את הערוץ / coverslip.

4. מאפיין מדוד ענייני הקלטת התנהגות

1. עבור מבנה של עניין (למשל, זנב, CNS), למדוד תכונה של עניין (למשל, עוצמת הקרינה, מיקום) לאורך זמן.
   הערה: מבנים כגון הראש והזנב ניתן להוסיף הערות באופן ידני. לדוגמא, הראש ניתן לזהות כמכיל פי ווים כהים בצורת H, ואת הזנב ניתן לזהות כמכיל spiricles קנה נשימה האחורית. מאמר זה מתמקד חוט העצב. השתמש elav-GAL4 קו GAL4 העצבית לנהוג transgene כטב"מ-MYR-GFP (elav> GFP) ^9,10 כדי fluorescently לתייג את מערכת העצבים המרכזית (CNS). מערכת העצבים המרכזית כוללת שתי האונות במוח הקדמי מחובר חוט העצב, אשר משתרע על האחורי (איור 3).
2. מדוד את עוצמת פיקסל של חוט העצב (f _(NC)) בכל נקודת זמן (t). להלן מתאר גישת ביאור ידנית, אך צעד זה יכול להיות אוטומטי.
   1. בפיג'י (או תוכנה דומה) בתפריט 'לנתח' להשתמש "מדידות הגדר ..." תיבת דו שיח לדווח הערך אפור מרושע slicעמדת דואר.
   2. ידני לצייר תיבה במרכז חוט העצב בפריים הראשון של הסרט (איור 3). צעד זה יכול גם להיות אוטומטי עם אלגוריתמי פילוח תמונה ורישום.
   3. השתמש בפקודה "מדוד" בתפריט 'לנתח' לדווח על עוצמת פיקסל הממוצע באזור עניין התאגרף. זה מייצר חלון "תוצאות".
   4. בפריים הבא, באופן ידני למקם את התיבה בלי שינוי גודל על ידי שימוש במקשי החיצים. השתמש בפקודה "מדוד" שוב. התוצאות מתעדכנות יוצגו בחלון "תוצאות". חזור על שלב זה עבור כל מסגרת של עניין.
   5. שמור את "תוצאות" באמצעות "שמירה בשם ..." הפקודה מתוך תפריט קובץ. התוצאות תיוצאנה כקובץ .xls.

5. ניתוח המדידות

1. נרמל כל f _(NC) ערך לערך בין 0 ל -1 (z _(t) </ Em>).
   1. בגיליון אלקטרוני (או תוכנה אחרת), לפתוח את קובץ Results.xls. קובץ זה יהיה שני עמודים מייצגים מספר מסגרת ועוצמת קרינה ממוצעת.
   2. הפוך עמודה חדשה ולהשתמש בנוסחה z _(t) = f _{(NC [t])} -min _{(f [NC])} / מקס _{(f [NC])} -min _{(f [NC])} כדי ליצור ערך הקרינה מנורמל מתאים בכל נקודת זמן.
2. קבע את תקופת צעד עבור כל פסיעה בהקלטה.
   הערה: מחזור פסיעה הוא יחיד של תנועה בגוף כולו חוזרת עבור קדימה (הפוך) זוחל. לפי אמנה, ומתחיל לצעוד קדימה (ומסתיים) עם התנועה קדימה של הזנב, הראש, ואיברים פנימיים אחרים כגון במעיים או CNS ^1.
   1. ידני לבדוק את ההקלטה התנהגותי ולהקליט את פעמי החניכה (i) של כל פסיעה (i _{(מחזור סטרייד [n])).}
      הערה: בדוגמא הבאה, תנועה קדימהשל מערכת העצבים המרכזית כמו תחילתו של מחזור צעד שימש (איור 3).
   2. עבור כל פסיעה לחשב את התקופה: Δ t _{(מחזור סטרייד) =} i _{(מחזור סטרייד [n + 1])} -i _{(מחזור סטרייד [n]).}
3. חישוב אחוז מחזור צעד שחלף עבור כל נקודת זמן של ההקלטה.
   1. תן עמודה נוספת של קובץ הגיליון האלקטרוני מייצג הזמן שחלף מאז תחילת מחזור פסיעה (ג). זמן הגדר מאז התחלת לצעוד יתאפסו על תחילתו של כל פסיעה (ג _{(מחזור סטרייד [n])} = 0). התאם פעמים לאחר תחילת בהתאם.
   2. תן עמודה נוספת של קובץ הגיליון האלקטרוני המייצג שחלף מחזור צעד אחוז (מחזור צעד%) מחלקי פעמים המתואם לפי תקופת צעד ולהתרבות על ידי 100 להמיר אחוז מחזור הפסיעה שעברה:. מחזור צעד% = (ג _{(מחזור סטרייד [n] ))} / (Δ t ₍מחזור סטרייד) * 100).

6. צור פולאר תאם מגרשים לייצג דינמיקה של מבנים של ריבית לאורך מחזור סריקה

1. ב MATLAB, השתמש דיאלוג 'יבוא הנתונים' בכרטיסיית הבית כדי לייבא את Results.xls המעודכנת.
2. ליצור מערך חדש "תטא" ערכי מחזור צעד המכיל אחוז (מחזור צעד%). ( "תטא = var1" איפה var1 מייצג מחזור צעד%).
3. ליצור מערך חדש "רו" מכיל ערכי קרינה מנורמלים (z _(t)). ( "רו = גרסה 2" איפה גרסה 2 מייצג z _(t)).
4. השתמש בפקודת 'polarplot' לחרוש מזימות לתאם קוטביות עם מחזור צעד האחוזים כמו הזווית, ואת הקרינה כמו הרדיוס ( "polarplot (תטא, Rho)").

Representative Results

מאמר זה מתאר שיטת מנחת התנהגות זחל תסיסנית באמצעות ערוצי agarose ו למדידת הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור זחילה. זחלי ערוצים ליניאריים לבצע התקפים מתמשכים של זחילה קצבית (איור 3). מכיוון שגם זחלים וערוצי ברורים אופטיים, ניתן להשתמש בערוצים עם זחלים להביע בדיקות ניאון מבוטאות בכל מבנה של עניין. הקלטנו הזחלים להביע GFP בכל נוירונים (elav-Gal4 / +; כטב"מ-MYR-GFP / +) וליווה את השינויים הדינמיים עוצמת הקרינה ב חוט העצב על פני מחזור זחילה. אנו מראים כי CNS נע קדימה בערך באותו הזמן כמו ראש וזנב זחל (איור 4 א-ב). כגל של התכווצות שרירים עובר לאורך ציר הגוף, מערכת העצבים המרכזית נעה פנימה והחוצה של המטוס של המוקד גורמת הקרינה של חוט העצב לשנות (איור 4). כדי לכמת צ'אן GES בעוצמת הקרינה חוט העצב במשך כמה צעדים בחיות כמה ייצגנו את הנתונים על מגרש לתאם קוטבי (איור 4C). התוויית הנתונים על לתאם מגרשי קוטב מראה כי הדינמיקה של קרינת חוט עצב על פני מחזור הצעד כדלקמן דפוס לשחזור.

איור 1: עיצוב של ערוצים ליניאריים מדריך התנהגות תסיסנית הזחל זחילה (א) העיצוב של המכשיר microfluidic המשמש לייצור ערוצי agarose ליניארי מוצג.. הרוחבי של ערוצים שבמכשיר זה נע בין 100-300 מיקרומטר במרווחים של 50 מיקרומטר. העומק הוא 150 מיקרומטר. (ב) הזחל תסיסנית הוא נטען לתוך ערוץ agarose. מבט הגבה מוצג עם קדמי (ראש) לימין. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.4892 / 54892fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. תרשים סכמטי המתאר כיצד טען זחל לתוך ערוץ ראה סעיף פרוטוקול 3 לפרטים נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. זחל תסיסנית שכותרתו fluorescently מניב ביצועים מתמשכים, אומנותי, ליניארי זחילה כאשר הניח לתוך ערוץ Agarose בצד השמאל, סכמטית של זחל להביע GFP בכל נוירונים (elav> GFP) מוצג. תיבה מציגה את האזור שבו עוצמת קרינה של חוט העצב (מזוהה לפימורפולוגיה מוארכת) ניתן למדוד. בשעה הנכונה הוא דוגמא של זחל זוחל דרך ערוץ באחד מרווחים שניים. מבט הגבה מוצג עם עד קדמי. החצים מצביעים על התחלת לצעוד. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: דינמיקה של שינויי קרינת החוט עצב במהלך מחזור הסריקה מוצגת על פולאר תאם מגרשים (א) תרשים של בפסיעה אחת.. אחוזים מתייחסים אחוז מחזור הצעד הושלם. באמצעות תנועות כנס קדימה של הזנב, הראש, ואיברים פנימיים כגון CNS מסמן את תחילתו של צעד (או 0% מכלל מחזור פסיעה). ראוי לציין, כי מערכת העצבים המרכזית (לבן) נע קדימה ואחורה, כמו גם למעלה ולמטה. צד view מוצג עם הקדמי בצד ימין. (ב) רשם גלים מראים את תנועת הראש, הזנב, ואת מערכת העצבים המרכזית. ראוי לציין, כי עוצמת הקרינה של החוט העצב במהלך מחזור הצעד הוא דינמית. (ג) לתאם קוטב עלילה מציגה את השינויים הדינמיים עוצם קרינה מנורמלת של חוט העצב על פני מחזור הפסיעה. כל נקודה מייצגת עוצמת קרינה מנורמלת של זחל אחד בנקודת זמן אחת (n = 3 זחלים, 3 צעדים כל אחד). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מכשיר microfluidic נבנה כדי להפוך את ערוצי agarose ליניארי שיכול להכיל זחלים תסיסנית (איור 1). כאשר זחלים תסיסנית ממוקמים ערוצי agarose הליניאריות האלה הרפרטואר ההתנהגותי שלהם מוגבל זחילה, המאפשרת תצפית מפורטת של הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור הזחילה.

הקלטה מוצלחת מתרחשת כאשר זחל לבצע שורה של צעדים קצובים (איור 3). אם זה לא קורה, לבדוק מכשולים כמו בועת אוויר בערוץ, ולבדוק את בריאותו של הזחל. אלמנט חשוב נוסף של הקלטה מוצלחת הוא כי הזחל מכוון בצורה אופטימלית לדמיין מבנים של עניין. אם הזחל הוא לא בכיוון הנכון, או אם הזחל זוחל מתוך התעלה, פשוט להסיר את coverslip ולעלות הזחל. מניסיוננו, ~ 20% של זחלים בתחילה רכובים קלטות התנהגותית מעולות תשואת withouהתאמת t.

בעבר, מדידות נלקחו עמדת מבנים הזחל כגון קרס בפה, מעיים, ואת קטעי בטן במהלך סריקת התנהגות. כדי להמחיש את התנועה של מבנים אלה על פני מחזור צעד הזחילה, מגרש לתאם קוטב נוצרו. במאמר זה, את עוצמת הקרינה של חוט העצב נמדדה ומגרשים לתאם קוטב להשתמש כדי להמחיש את הדינמיקה של קרינה לאורך מחזור הצעד הזוחל (איור 4). ישנם מספר יתרונות המייצגים את הנתונים על מגרשים לתאם קוטב: זה מבטל מהירות זחילה כמשתנה, זה יכול לסכם נתונים מבעלי חיים רבים וצועד רב, וזה מאפשר הדמית שתי מגמות הכוללות וריאצית נתונים ^11. יש לציין, אפשר למדוד את הדינמיקה של כל מבנה fluorescently שכותרתו עניין. באופן עקרוני, ניתוח זה הוא ישים מעקב כל סוג של שינויים דינמיים המתרחש במהלך מחזור זחילה. יש מגוון רחב של יישומים עבור השיטות המתוארות במאמר זה. בעבר, ערוצי agarose ליניארי שמשו להקליט התנהגות זחל על האורגניזם כולו, מגזר שרירים בודדים רמות ^1. נתונים אלה מראים כי זחלים משתמשים במנגנון "הקרבי-pistoning" הוא קדימה הפוך זחילה, והם הניחו מנגנון תוקפת מניע גם קדימה לאחור בזחילה שייקבע ^1. בעתיד, חוקרים יכולים להשתמש בערוצים ללמוד זחילת רקע גנטי שונה. בנוסף, זה צריך להיות אפשרי להשתמש בערוצים לנתח את הפעילות של נוירונים זחל באמצעות הדמית סידן במהלך סריקה. זה אמור להוביל להבנה של אשר עצב משגר בשלב בתנועות מסוימות של מחזור הזחילה. לבסוף, אין שום סיבה שערוצים חייבים לבצע את העיצוב ליניארי מוצג במאמר זה; באמצעות ערוצים עם ממדים שונים ספק לא יעזור לענות variety של שאלה לגבי תנועת זחל תסיסנית ושליטה מוטורית בכללותה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oz square Drosophila bottle	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sucrose	sigma	S9378
apple juice			not from concentrate
Tegosept	Fisher	T2300	methyl-p-hydroxybenzoate
35 x 10 mm round petri dish	Fisher	351008
baker's yeast
PDMS casting mold	FlowJem		can be requested from authors
Isopropyl alcohol	Fisher	A417-1
laboratory wipes	Fisher	06-666-11
canned air	Fisher	18-431
10 cm petri dish	BioPioneer	GS82-1473-001
agarose	Fisher	50-444-176
razor blade	Fisher	12-640
forceps	FST	11241-40
22 x 40 cover glass, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (version 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com