Summary
יש תרגיל לב וכלי דם וחוויות מגרה בסביבה מורכבת יתרונות חיוביים על אמצעים מרובים של פלסטיות עצבית במוח המכרסם. מאמר זה יעסוק ביישום של התערבויות אלה בתור "superintervention" המשלב ריצה גלגל ומורכבות סביבתיות יעסוק המגבלות של התערבויות אלה.
Abstract
התעמלות אירובית (למשל, פועל גלגל (WR) בשימוש נרחב במחקר בבעלי חיים) באופן חיובי משפיע אמצעים רבים של פוטנציאל neuroplastic במוח, כגון שיעורי neurogenesis למבוגרים, אנגיוגנזה, וביטוי של גורמים neurotrophic במכרסמים. התערבות זו גם הוכח כדי להקטין היבטים התנהגותיים neuroanatomical של ההשפעות השליליות של teratogens (כלומר, חשיפה התפתחותי לאלכוהול) ו ניוון מוחיים הקשורים בגיל במכרסמים. מורכבות סביבה (EC) הוכחו לייצר הטבות neuroplastic רבות במבנים הקורטיקלית קורטיקליים וניתנות בשילוב עם ריצה גלגל להגדיל את ההתפשטות והישרדות של תאים חדשים בהיפוקמפוס המבוגר. השילוב של שתי ההתערבויות הללו מספק חזק "superintervention" (WR-EC) כי ניתן ליישם במגוון במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירולוגיות. אנו נדון יישום WR / EC ו המהוות אותהterventions לשימוש התערבות טיפולית חזקה יותר בחולדות באמצעות במודל חיה של חשיפה טרום לידתית אלכוהול אצל בני אדם. כמו כן נדונו בו אלמנטים של הנהלים הם הכרחיים עבור ההתערבויות ואלו עשויים להשתנות בהתאם לשאלה או המתקנים של הנסיין.
Introduction
גידול בסביבות שונות כבר זמן רב ידוע כדי לגרום לשינויים במדדים שונים של בריאות נוירולוגיות. מחקרים רבים בודקים את ההשפעות המיטיבות של גידול בסביבה מורכבת (EC) החל מחקר פורץ דרך על ידי דיאמונד רוזנצוויג (למשל, 1, 2) ו Greenough (למשל, 3, 4). EC הוכח יש השפעות חיוביות להכחיש על שינויים סינפטיים וסלולר במוח 5, 6, 7. EC יכול להשפיע על ריבוי אזור המוח כולל ההיפוקמפוס 8, 9 ו בקליפת המוח הראייתית 10, 11, הסטריאטום גחון 12, 13, כמו גםכפונקציה neuroimmune המוח-רחב (הנסקרת ב 14). עניין רב במיוחד פתח ממחקרי על ההיפוקמפוס כשזה הודגם כי EC יכול להגדיל את שיעור ההישרדות של תאי גרגיר נולד-מבוגר של gyrus המשוננת באמצעות פלסטיות דנדריטים 9, 13. הנקודה האחרונה אסף עניין רב בשל הגוף הולך וגדל של ספרות המציין כי פעילות אירובית מקדמת neurogenesis למבוגרים הם במוח הבריא הפגום 15, 16, 17, 18. ריצת עגלה (WR) היא קל ליישם בצורה של פעילות לב וכלי דם מהרצון כי הוכח להועיל במודלים של מכרסמים של הפרעות נוירולוגיות או הזדקנות 17, 19, 20. WR משפיע על הביטוי של גורמי גדילה הן במערכת העצבים המרכזית וההיקפית 21, 22, 23.
שילוב (לימים) WR ו- EC לתוך "superintervention" (WR-EC) (כלומר, 12 ימים של WR ואחריו 30 ימים EC) מספקים עלייה חזקה neurogenesis למבוגרים בהיפוקמפוס הישרדות המוגבר של התאים התרבו לאחרונה 8, אפקט כי במודל חיה של FASD אינה מושגת על ידי רכיבים בודדים (ראה להלן). מאז הן רכיבים של WR-EC להשפיע על מגוון רחב של מבנים בתוך המוח 13 (WR הנסקרת ב 22, EC הנסקרת ב 24), יישום התערבות זו ניתן ליישם בקלות במודלים של מכרסמים של שני הדגמים הופעת החיים התפתחותיים מאוחרים יותר של נוירולוגיות ירידת ערך (למשל, חשיפת אלכוהול בילוד, הזדקנות, מתח בתחילת חיים).
NT "> שילוב של WR-EC בתקופות המבוגרות מתבגר מוקדם (כלומר, ימים לאחר לידה 30 - 72) יכולים לשפר כמה מן ההשפעות השליליות של מודל עכברוש של פרעות ספקטרום אלכוהול עובריות (FASDs) 8 אוסף של מחקרים. מכרסמים הפגינו שחשף לאלכוהול מיום הלידה (PD) 4 עד 9 התצוגה גירעונות משמעותיים צעדים neuroanatomical כגון מורכבות הדנדריטים 25, פיתוח המוח הקטן 26, 27 והיענות neuroimmune 28 כמו גם גילויי למידה לקוי וזיכרון 29, 30, 31 . אפילו כמות מופחתת של חשיפת אלכוהול בתוך חלון זמן זה (כלומר, פ"ד 7 עד 9) יכולה להוביל גירעונות למידה וזיכרון בחולדות מתבגרות ומבוגר 32 בעוד כמה מבנים כבר לא רואים sigליקוי neuroanatomical תופעה משמעותי, 27. רבי גירעונות אלה - בנוסף ליקויי התנהגותי במשימות ההיפוקמפוס תלויה - כבר מתנו בעקבות חשיפה הפרדיגמה WR-EC זה 8, 33 או WR לבד 25, 31. למרות WR לבד כבר התערבות בשימוש נרחב, השילוב של WR-EC טרם נוצל בספרות למרות יכולתה לקיים את היתרונות יחסית לטווח קצר של WR 8. מאמר זה יעסוק ביישום של התערבות WR-EC בגיל ההתבגרות. למרות פרדיגמה זו משמשת בהקשר של חשיפה אלכוהול לאחר הלידה המוקדמת, זה יכול להיות מוצג בפני במודלים של מכרסמים שונים כדי להעריך את הפוטנציאל של המוח עבור פלסטיות עצבית במודלים של הפרעות במוח.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: הפרוטוקול הבא אושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת השימוש (IACUC) מאונ' דלאוור.
1. חשיפה התפתחותית (או דגם של חשיפת אתנול Binge דמוית)
- ביום PD3, לקבוע את מינו של כל חיה ו צולב לטפח כל חיות במידת צורך כדי לשמור על גודל המלטה (8 חיות) והפצת מין (4 זכרים: 4 נקבות) עולה בקנה אחד בתוך כל המלטה.
הערה: חשוב לשמור על גודל המלטה והפצת מין עקבי ככל האפשר, כדי למנוע בלבול הניסיון. למרות בפרוטוקול זה משתמש 8 גורים (4 זכרים ו -4 נקבות) בכל המלטה, בגדלי המלטה אלטרנטיביים או הפצות מין עשויים להיות תפורות לצרכי תכנון הניסוי. - תת עורי להזריק כמות קטנה של בדיו שחור לידיו לזהות חיות בתוך כל המלטה.
- פסיאודו אקראי להקצות המלטות כניסוי (המכיל 50% אלכוהול חשוף (AE) ו -50% שליטה מחובר לצינורות-דמה (SI) הגורים) או לינוק מלא (SC) (בעלי חיים שאינם עוברים כל אינטובציה, גזיר זנב, או פרוטוקולי פרידת PD 4 - 9 למעט במשקל יומי חבטות אוזן).
- כדי לשמור על גודל קבוצה עקבי, להקצות כפליים המלטות ניסוי כפי המלטות SC.
- לשקול כל חיה ואז להחזיר אותו בכלוב בבית שלה. בעלי חיים במשקל אמור להתרחש מדי יום במהלך תקופת אינטובציה (PD 4 - 9).
- הסר את האפריון כולו מן הסכר.
- מניח גורים על משטח לוהט.
- רשום את המשקל של כל גור פרט.
- ביום PD4, לאחר שקילת כל חיה לחשב את כמות אלכוהול הכרחי עבור סכום כולל של 5.25 גר '/ ק"ג / ליום כל חיה (מבוסס על משקל הגור משלב 1.4) 8.
- נהל אלכוהול 11.9% אתנול-ב-חלב תחליף (כרך / כרך).
- החל בשעה 9 בבוקר, להסיר גורים של המלטה אחד מהאם בכל פעם.
- לנהל את אתנול-ב-חלב לכל גור AE
- Sham-לצנרר כל גור 8 SI.
- חזור על שלבים 1.5. דרך 1.8. עבור כל המלטה ניסיונית.
- שעות לאחר המנה הראשונה, לחזור על תהליך המינון (שלבי 1.5 דרך 1.8) עבור מנת אלכוהול שנייה.
- אחת וחצי שעות לאחר מנת האלכוהול השנייה (הנקודה שבה שיא תוכן אלכוהול בדם יומי מושגת), לאסוף ודם צנטריפוגות מן גורי AE ו SI באמצעות זנב גזיר לניתוח תוכן אלכוהול בדם בעתיד 35.
- אסוף 60 μL של דם.
- מניחים דם בתוך שפופרת microcentrifuge 1 מ"ל. דם צנטריפוגה ב 1.5 XG במשך 25 דקות.
- בזהירות לאסוף את בסרום supernatant מהצינור צנטריפוגות ולשמור לניתוח תוכן אלכוהול בדם בעתיד.
- חזור על תהליך המינון (שלבי 1.5 דרך 1.8) באמצעות חלב במקום אתנול-ב-חלב כדי למנוע גירעונות תזונתיים מחוסר יכולת סיעוד ב AEגורים.
- בצע סך של 2 מנות חלב משלימות 2 שעות זה מזה על PD 4.
- חזור על שלבים 1.4 דרך 1.12 (למעט צעד 1.11) על PD 5 - 9.
- בעקבות מינון חלב המשלימה הסופי על PD9, אוזן אגרוף כל הגורים לזיהוי בכלוב EC.
- לתאם אגרוף באוזן עם מידה מסוימת של מספר המלטה או מזהה (למשל, המלטות אי-זוגיות בתוך עוקבה תקבלנה האוזן השמאלית שלהם אגרוף בעוד חי המלטות זוגיות תקבלנה אוזני זכותם אגרוף). זה יעשה את זה קל יותר לזהות חיות בכלוב EC צריכים בעלים חיים רבים מן ההמלטות שונות יש אותו דפוס pawmark.
גמילה 2.
- ביום PD 23, בבית כל החיות בכלובים של 2 - 3.
- ודא שכל החיות שוכנו באותו הכלוב הן מאותו המין.
- כלול SC אחד, אחד SI, ובעלי חיים אחד AE לכל כלוב במידת האפשר.
- צמצם את מספר כלוב mates הבבית הם מאותו ההמלטה.
- ודא שכל החיות שמסוגלות לגשת מזון ומים.
ריצת גלגל 3.
- ביום PD30, להקצות מחצית כלובים עם חיות כדי WR. בית החיות האלה בכלובים עם גישה חופשית גלגל ריצה נירוסטה המצורפת.
- ודא שיש גלגלים מונה להעריך את המספר הכולל של מהפכות.
- לשקול את כל החיות על PD 30 ו PD 36.
- בדוק את מספר המהפכות של כל גלגל בשעה 9 בבוקר כל יום.
- השאר חיות במצב הדיור שלהם במשך 12 ימים.
4. מורכבות הסביבה
- מכינים את הכלוב EC לפני 9 בבוקר ביום שמתאים PD 42 עבור בחיות מעבדה.
- קבל 30 "x 18" x 36 "כלוב פלדה מגולוון.
הערה: צריך הכלוב מספר רמות, להיות מסוגל לתמוך את המשקל של חולדות מרובות, להתמלא תקןיש מצעים, ומיקומים מרובים לצרף בקבוקי מים ומגשי האוכל. - מניח רומן, אובייקטים צבעוניים בגדלים משתנים וצורות בכלוב.
- מניחים 6 צעצועים גדולים בכלוב EC. ודא כי כל צעצוע הוא מספיק גדול בשביל 3 או יותר חולדות כדי אינטראקציה עם בעת ובעונה אחת.
- מניח 6 צעצועים בינוניים בכלוב EC. ודא כי כל צעצוע הוא מספיק גדול בשביל 3 - 4 חולדות כדי אינטראקציה עם בעת ובעונה אחת.
- מניחים הרבה (לפחות 20) של צעצועים קטנים בכלוב EC.
- משתמש באביזרים של צבעים שונים, צורות, גודל, וכו 'החידושים הם קריטיים להתערבות זו (ראה דיון).
- מניחים שתי מנות של מזון בקצוות מנוגדים של הכלוב.
- מניחים שני בקבוקי מים בקצוות מנוגדים של הכלוב.
- קבל 30 "x 18" x 36 "כלוב פלדה מגולוון.
- בשעה 9 בבוקר על PD 42, לשקול את כל החיות להעביר את החיות WR לכלוב EC. כל כלוב EC אמור להכיל 9 - 12 בעלי חיים.
- יש לוודא שאין חיות לשניהם באותו pawmark ואוזן-משחק מליםדפוסי ch.
- בדקו את כל ימי המזון ומים.
- כל יומיים, להסיר את הצעצועים מהכלוב EC ולהחליף אותם (על פי השלב 4.1.2.).
- כל שלושה ימים, לנקות את הכלוב EC.
- הסר את החיות מן כלוב EC ולשים אותם בכלובים שהייה זמניים של 2 - 3 חיות.
- הסר את כל המצעים מן בתחתית הכלוב.
- חזור אותם הצעצועים לכלוב אלא עצם היום הזה עולה בקנה אחד עם לוח זמני החלפת צעצוע (לפי צעד 4.4.).
- החלף את כל האוכל והמים.
- חלף החולדות לתוך כלוב EC.
רקמות 5. אסוף
הערה: אוסף רקמות (למשל, זלוף עם paraformaldehyde) ואחסון (למשל, מקפיא, הטבעת פרפין) יכולה להתבצע עם מגוון רחב של שיטות. להלן יסביר את התהליך של זלוף עם paraformaldehyde 4% ב 0.1 M פוספט בופר (4% paraformaldehyde ב PBSפתרון) 8.
זהירות: Paraformaldehyde הוא מסרטן ועלול גם לגרום לגירוי עור, תגובה אלרגית בעור, או פגיעה בעין. השתמש הגנת עיניים / עור מתאים.
- לחשוף חולדה אחת בכל פעם כדי isoflurane כדי להרדים את החיה קלה.
- Intraperitoneally להזריק עכברוש עם 2 מ"ל / ק"ג של תערובת קטמין / xylazine (1.5 מ"ל xylazine מעורבב עם 10 מ"ל של קטמין).
הערה: קטמין ו xylazine הן בריכוזים מלאי של 100 מ"ג / מ"ל לפני שילוב עבור תערובת ההזרקה. - לאחר עכברוש הוא כבר לא מגיבים, perfuse החיה עם 0.1 M פוספט בופר (PBS; pH = 7.2) ואחריו paraformaldehyde 4% ב PBS (pH = 7.2).
- סר מוח ולאחסן paraformaldehyde 4% PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- אחרי 2 ימים, העברת הפתרון של סוכרוז 30% נוספים paraformaldehyde 4% PBS ב 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על מנת להעריך את השפעת ההתערבות סופר, אנחנו חייבים להסתכל על ההשפעות של כל אחד מבני היסוד שלה - WR ו- EC - על אמצעים שלנו של עניין. דמויות 1 עד 3 (להלן) הופיעה בפרסום קודם ניצול הפרדיגמה 8 זה. איור 4 הופיע עבודת דוקטור 36. נתונים אלה ממחישים את ההשפעה של WR-EC על neurogenesis למבוגרים בהיפוקמפוס gyrus המשוננת. כל הגרפים להמחיש אמצעי קבוצה, עם ברי שגיאה על שגיאת תקן יחיד מממוצע. איור 1 מדגים עליות שגשוג תאים הבאים חלק WR התערבותנו, המציין כי רכיב WR מסוגל וחסון של הגדלת תרבות תאים של DG של ההיפוקמפוס מתפתח בצורה תקינה, בתחילת החיים הדגישו, ובעלי חיים חשופים אלכוהול. איור 2בא להמחיש את יכולות EC להגדיל הישרדות של תאים שנוצרו בוגרת DG בחיות שנחשפו ללחץ או אלכוהול או neonatally. איור 3 מדגים את הגידול תא להתמיין פנוטיפ עצבי, המציין כי WR-EC יכול להגדיל התפשטות והישרדות של תאי גרגיר מבוגרי יליד המשונן gyrus בחיות שעוברות חשיפה בילוד לאלכוהול או אינטובציה מתח, שסבך את זה בתור טיפולי גירעונות הצלה neurogenesis למבוגרים בהיפוקמפוס. לבסוף, איור 4 מאשרת את השפעת WR-EC על פלסטיות דנדריטים: אורך דנדריטים doublecortin החיובי של תאי הגרגיר 'gyrus המשוננת בחולדות AE הוא כבר לא שונה משליטה. תוכן דם אלכוהול (BAC) על PD 4 היה 321.19 ± 14.03 מ"ג / ד"ל (ממוצע ± SEM), להשוות מחקרים אחרים באמצעות פרדיגמה חשיפה זו 28, 37. מחקרים קודמים הראו כי חיותלחצות קבוצות הטיפול אלה אינם שונים מרחקים לפעול במהלך WR 15.
WR באיור 1. וחסונה מגדילה התפשטות תאים ב בהיפוקמפוס DG. Photomicrographs להמחיש הבדלים התפשטות תאים של DG על PD42 (הפסקת WR) כפי שכותרתו עם Bromo-deoxyuridine (BrdU) אצל בעלי חיים AE הבאים WR (א) ו דיור ציבורי (B). WR וחסונה מגבירה proliferations תא ללא קשר לטיפול בילוד (C). ANOVA דו סטרי חשף השפעה עיקרית של מצב דיור (WR לעומת SH) (F 1,40 = 19.703, p <0.001), אך לא השפעה עיקרית משמעותית של טיפול לאחר לידה (SC vs. SI vs. AE) או אינטראקציה בין שני הגורמים נצפו. השוואות הוק הודעה בוצעו כבדיקות של Tukey. כל הערכים repreנשלח ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM). * P <0.05, #p <0.01. נתון זה שוחזר מאל et המילטון. 2012 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
WR איור 2. ואחריו גירעונות מצילים במטבע הישרדות תא בעקבות חשיפה ילודה אלכוהול או מתח שאם. Photomicrographs להמחיש הבדלים תא שכותרתו עם BrdU בחיות AE מ WR-EC (א) ו תנאי שוכנו חברתיים (B) הוזרקו BrdU על PD41. באירועי חיות שוכנו מציגות ירידה בעקבות חשיפת אלכוהול ביחס לינוק שולטים. בעלי חיים שעברו את שיעורי ההישרדות WR-EC גדל superintervention התצוגה של תאים מתרבים לאחר PD41 בשתי הקבוצות SI ו AE (C). ANOVA דו סטרי חשף ההשפעה העיקרית של מצב הדיור (WR לעומת SH) (F 1,29 = 11.402, p <0.01) ו אינטראקציה מובהקת בין טיפול לאחר הלידה ומצב הדיור (F 1,29 = 3.870, p < 0.05), אך לא השפעה עיקרית משמעותית של טיפול לאחר לידה (SC לעומת SI לעומת AE) נצפתה. ANOVA חד כיווני בתוך חי SH חשף השפעה עיקרית של טיפול לאחר לידה (F 1,19 = 3.727, p <0.05) ואילו ANOVA חד כיווני בתוך חי WREC עולה כי אין הבדלים משמעותיים בין טיפולים לאחר לידה. השוואות הוק הודעה בוצעו כבדיקות של Tukey. כל הערכים מייצגים ממוצע ± SEM. * P <0.05, #p <0.01. נתון זה שוחזר מאל et המילטון. 2012 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של figu זהמִחָדָשׁ.
גירעונות איור 3. WR-EC מצילים ב Neurogenesis בעקבות חשיפת אלכוהול ילודים או מתח שאם. שיתוף לוקליזציה של BrdU (ירוק) הביטוי NeuN (אדום) בתאי גרגיר בהיפוקמפוס. תמונות confocal פלורסנט נרכשו בעקבות הליכים immunohistochemical. BrdU הוזרק על רקמת PD41 נאסף על PD72. שניהם BrdU ו NeuN נצפו DG (A, B). למרות החיות SC לא הראו עלייה משמעותית במספר מתרבים נוירונים, הן חיות AE ו SI הראו עלייה נוירוגנזה (כפי שצוין על ידי תיוג כפול עם BrdU ו NeuN) בעקבות הפרדיגמה WR-EC לעומת בעלי חיים שוכנו חברתית (C) . ANOVA דו סטרי חשף השפעה עיקרית של מצב דיור (WR לעומת SH) (F 1,28 = 20.48, p <0.001), אך לא effe העיקרית משמעותיתct של טיפול לאחר לידה (SC לעומת SI לעומת AE) או אינטראקציה בין שני הגורמים נצפה. השוואות הוק הודעה בוצעו כבדיקות של Tukey. כל הערכים מייצגים ממוצע ± SEM. * P <0.05, #p <0.01. נתון זה שוחזר מאל et המילטון. 2012 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גירעונות מציל איור 4. WR-EC הדנדריטים המורכבים של תאי הגרגיר בהיפוקמפוס DG. Sholl מנתח צומת הדנדריטים להמחיש התופעות להקל עליו של WR-EC על מורכבות הדנדריטים gyrus המשוננת של חולדות בוגרות בעקבות חשיפת אלכוהול בילוד. בתנאי דיור ציבוריים, חיות AE יש מספר מופחת תא גרגיר DG דנדריט בצמתים יחסית לשלוט בעלי חיים (א). דיור WREC מגדיל את מספר צמתים בחיות AE בהשוואה לביקורות שוכנו החברתי (ב). חיות AE שגדלו בפרדיגמה WREC שלנו להציג מספרים דומים של צמתים יחסית לשלוט חיות שוכנו WREC (ג). ANOVAs מידה החוזרת בוצעה על הנתונים בכל גרף. פנל הדגים השפעה עיקרית של טיפול לאחר לידה (F 1,11 = 6.265, p = 0.029). לוח ב 'ממחיש מגמה של השפעה עיקרית בין תנאי דיור (F 1,6 = 4.181, p = 0.087). ג לוח מדגים הבדל משמעותי בין SC וחיות AE בתוך מצב הדיור WREC. כל השוואות פוסט הוק בוצעו כבדיקות של Tukey. כל הערכים מייצגים ממוצע ± SEM. ^ P <0.01, * p <0.05. נתון זה שוחזר מן המילטון, 2012 36."Target =" pg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול לעיל, הראינו התערבות רצויה להציל גירעונות neuroanatomical בעקבות חשיפת אלכוהול בילוד. התערבות זו יכולה לשמש טיפולי במודלים של בעלי חיים אחרים בשל חוסנו של כל אחד ממרכיבי ההתערבות. פעילות לב וכלי דם מרצון בצורה של WR הוכחה להועיל כמה תוצאות התנהגותיות 38, 39 ו להשרות שינויי פלסטיק מעשיים באזורים במוח כגון ההיפוקמפוס (הנסקרת ב 40). מדובר בין השאר בשל הביטוי של גורמי גדילה ומנגנונים נוירו אחרים parenchyma המוח בשני מכרסמים ובני אדם 21, 41. השלמת השפעות אלו, EC יכול לגרום 6 הסלולר מועיל, 11, 42, 43, מבני 2 תרופתי 12, 44 שינוי במכרסמים.
על מנת WR כיעיל מקסימאלי במודל המסוים הזה של תסמונת האדם, קיימת חשיבות ראשונה במעלה לתת לחיות גישה מרצון גלגל ריצה פונקציונלי; גישת גלגל יומית צריכה להימשך במשך פרק הזמן ממושך 45 לפחות 10-12 שעות ליום ועדיף 24 שעות (כמה תופעות לוואי של נסיגה מן גלגל הריצה דווחו). הפרדיגמה WR זה נמשך 12 ימים כדי לאפשר את השילוב של WR ו- EC להשתלב גיל ההתבגרות והבגרות. המשך, הגיל בעת החשיפה, ומודאליות של פעילות גופנית (בין שאר) יכולים להשפיע על היעילות של פעילות גופנית כמו התערבות טיפולית 46, וגורמים קריטיים כגון צריכים להילקח בחשבון כאשר מתכננים ליישם פרוטוקול זה או כל הפרדיגמה WREC אחרת. אחד המרכיבים היסודיים הפרדיגמה EC זהו לאvelty של מספר אובייקטים בסביבה ואינטראקציה חברתית (הנסקרת ב 14, 47). לכן, זה קריטי עבור הפריטים הפרדיגמה הזו להיות מוחלף כל 48 שעות. בהתבסס על צורך הפריטים מרובים, האינטראקציה עם הפריטים והחקר שלהם, והאינטראקציה חברתית, אנו מוצאים כי המספר שלנו של פריטים ייחודיים, תדירות החלפת פריט, ומספר חבריהם לכלוב הוא מספיק כדי לגרום לתוצאות טיפוליות על אמצעי neuroanatomical כי אנו בוחנים. מצאנו כי חשיפה ממושכת במשך 30 ימים הוא מתאים יותר להתגבר גירעונות המושרה על ידי חשיפת אלכוהול בילוד מ אינטראקצית חשיפה מוגבלת בסביבת רומן.
מטרת פרוטוקול זה היא להציג פרדיגמה WREC כי תעסוק הוא הפעילות האירובית ורכיבי חידוש סביבתיים של התערבות פלסטיק. מסיבה זו, נתייחס השינוי שיכול להתבצע על paradigמ 'אבל היה מזהיר השימוש שינויים שעשויים לשנות את הדרכים שבהן חיות אינטראקציה בתוך הפרדיגמה וכן מסקנות הניסוי שניתן להסיק. שינוי אפשרי אחד יהיה המבוא של הפעלת גלגלי לסביבה EC. בעשותו כן, זה יהיה קשה לקבוע את התרומה היחסית של כל רכיב. זה גם יהיה קשה להבטיח שכל החיות להשתתף בשני רכיבי WR ורכיבי EC של הפרדיגמה דיור של 8 - 10 בעלי חיים יחד נדרשו עבור EC. עם זאת, מאז גישה לטווח ארוכה כדי פעילות גופנית היא קריטית לגבי יעילותן של התערבות זו 45, מחקר נוסף עשוי להתייחס היחס האופטימלי של גישת WR לגשת EC (למרות השיטות בפרוטוקול זה הראו השלכות neuroanatomical והתנהגותיים חזקות 8, 33) . שינויים בפריטים בודדים בשימוש בסביבת EC כשרים, אבל זה critical עבור הפריטים להיות מעניין, מורכב, רומן, מגרה ולעתים קרובות רענון 14.
פרדיגמה זו מכילה מספר מגבלות מולד בידינו, אשר צריכים להילקח בחשבון כאשר מתכננים ליישם את זה "התערבות סופר". מגבלה אחת לרכיב WR של הפרדיגמה היא חוסר היכולת להעריך את המרחק מנוהל על ידי חיות אדם. אחד הפתרונים הברורים ופשוטים יהיה דיור בודד של החיות במהלך רכיב WR. עם זאת, היא צריכה להיות הדגישה כי דיור בודד מקובל כמו מזיק חיות ואפילו יכול ישירות לנטרל את ההשפעות המיטיבות של גלגל ריצה 48. חלופה נוספת (אם כי זמן רב לא מושלם) יהיה להקליט וידאו ההגה ריצה בכל העת כי יש חיות גישה. זה ידרוש מזהה ייחודי עבור כל חיה בכלוב (למשל, ציור צבעים ייחודיים או patterns על הפרווה של כל חיה) 49. טכניקה זו עדיין תהיה כפופה מקעקעת של בעלי חיים רבים ניצול ההגה במקביל. קושי דומה נושאת אל EC שבו הוא הופך להיות קשה מזון להגביל בעלי חיים בודדים (מבלי להגביל את פרק הזמן של צריכת מזון). כדי לצמצם את ההשפעה של זה, הייתי ממליץ דיור EC במשך 30 ימים מלאים ואחריו פרדיגמה הגבלת מזון מיידית. כמויות מורחבות של פסק זמן של EC יכולות לעכב מושרה פלסטיות המתרחשת במהלך הפרדיגמה הזו.
כאמור, את החשיבות של מאמר זה היא לאפשר לאפיון עקבי של הפרדיגמה EC ויישומו לאחר פעילות גופנית לב וכלי דם בצורת WR. פרדיגמות EC הקודמות חשפו חיות לדיור EC ללא חשיפה WR 12, 50, WR בתוך כלוב EC עבור כמות זמן קצרה יותר 51או עם בעלי חיים פחות 52, או החיות נחשפו בסביבת EC עבור כמות זמן ארוכה יותר עם שינוי תכוף פחות של פריטי כלוב 13. סביר להניח כי ההשפעות המועילות של EC דורשות פלסטיות המושרית מ WR בחלון זמן רלוונטי באופן זמני לקבלה להראות תועלת בטווח ארוך. בדרך זו, אנו מאמינים כי צימוד WR ו- EC עבור 12 ו -30 ימים מאפשר בהתאמה עבור התערבות מועילה ותמציתי מקסימאלי.
בשלב זה, השימוש במודל זה הוגבל לתקופות זמן מבוגר מתבגרים מוקדם. בדיקה נוספת על חוסנו של התערבות זו בשלבים שונים, ואת ontogeny תועלת neuroplastic יש לבחון עוד יותר בעתיד. בנוסף, השימוש של גירעונות התפתחותיים שונים הוא מאוד באופנה, כמו זה יסייע בפיתוח התערבויות טיפוליות יעילות עבור אנשים נגועים הפרעות כאלה. ספרות קודמות דהmonstrated תופעות עצמאיות של WR או EC על neurogenesis למבוגרים, למידה וזיכרון, או התנהגויות דמויות חרדה במודל של עכברים גנטי כלשהו לחרדה 53. חוסנו של שתי ההתערבויות הללו ואת אפקט סינרגיסטי של EC כדי לקיים את ההשפעות קצרות הטווח של הטבות WR-induced מוגברת (כלומר, התפשטות תאים בהיפוקמפוס נוירוגנזה) עושה את זה גם צפוי להשתלבות במגוון רחב של שאלות מחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Time-pregnant Long Evans Rats | Envigo (Formerly: Harlan, Inc.) | Average litter size is 8 - 10 pups | |
| Black India Ink | Higgins (Chartpak, Inc.) | 44201 | |
| Syringes and Injection Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | Assorted | For injection of pawmarking ink, administration of milk-alcohol solution |
| Ear Punch | Kent Scientific Corporation | INS750076 | |
| Running Wheels | Wahmann Labs | Wahmann Running Wheel is discontinued. One per cage. | |
| EC Cage | Martin's Cages, Inc. | R-695 | |
| Small EC Toys | Assorted | ||
| Medium EC Toys | Assorted | Should be able to fit 1 - 2 rats inside of/on top of object | |
| Large EC Toys | Assorted | Should be able to fit 3 or more rats inside of/on top of object |
References
- Diamond, M. C., et al. Increases in cortical depth and glia numbers in rats subjected to enriched environment. J Comp Neurol. 128 (1), 117-126 (1966).
- Rosenzweig, M. R., Bennett, E. L., Hebert, M., Morimoto, H. Social grouping cannot account for cerebral effects of enriched environments. Brain Res. 153 (3), 563-576 (1978).
- Greenough, W. T.
- Volkmar, F. R., Greenough, W. T. Rearing complexity affects branching of dendrites in the visual cortex of the rat. Science. 176 (4042), 1445-1447 (1972).
- Greenough, W. T., Volkmar, F. R., Juraska, J. M. Effects of rearing complexity on dendritic branching in frontolateral and temporal cortex of the rat. Exp Neurol. 41 (2), 371-378 (1973).
- Sampedro-Piquero, P., Zancada-Menendez, C., Begega, A. Housing condition-related changes involved in reversal learning and its c-Fos associated activity in the prefrontal cortex. Neuroscience. 307, 14-25 (2015).
- Sirevaag, A. M., Greenough, W. T. Differential rearing effects on rat visual cortex synapses. III. Neuronal and glial nuclei, boutons, dendrites, and capillaries. Brain Res. 424 (2), 320-332 (1987).
- Hamilton, G. F., Boschen, K. E., Goodlett, C. R., Greenough, W. T., Klintsova, A. Y. Housing in environmental complexity following wheel running augments survival of newly generated hippocampal neurons in a rat model of binge alcohol exposure during the third trimester equivalent. Alcohol Clin Exp Res. 36 (7), 1196-1204 (2012).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Juraska, J. M., Greenough, W. T., Elliott, C., Mack, K. J., Berkowitz, R. Plasticity in adult rat visual cortex: an examination of several cell populations after differential rearing. Behav Neural Biol. 29 (2), 157-167 (1980).
- Turner, A. M., Greenough, W. T. Differential rearing effects on rat visual cortex synapses. I. Synaptic and neuronal density and synapses per neuron. Brain Res. 329 (1-2), 195-203 (1985).
- Brenes, J. C., Rodriguez, O., Fornaguera, J. Differential effect of environment enrichment and social isolation on depressive-like behavior, spontaneous activity and serotonin and norepinephrine concentration in prefrontal cortex and ventral striatum. Pharmacol Biochem Behav. 89 (1), 85-93 (2008).
- Kolb, B., Gorny, G., Soderpalm, A. H., Robinson, T. E. Environmental complexity has different effects on the structure of neurons in the prefrontal cortex versus the parietal cortex or nucleus accumbens. Synapse. 48 (3), 149-153 (2003).
- Singhal, G., Jaehne, E. J., Corrigan, F., Baune, B. T. Cellular and molecular mechanisms of immunomodulation in the brain through environmental enrichment. Front Cell Neurosci. 8, 97 (2014).
- Helfer, J. L., Goodlett, C. R., Greenough, W. T., Klintsova, A. Y. The effects of exercise on adolescent hippocampal neurogenesis in a rat model of binge alcohol exposure during the brain growth spurt. Brain Res. 1294, 1-11 (2009).
- van Praag, H., et al.
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Vivar, C., Peterson, B. D., van Praag, H. Running rewires the neuronal network of adult-born dentate granule cells. Neuroimage. 1 (131), 29-41 (2015).
- Mustroph, M. L., et al. Increased adult hippocampal neurogenesis is not necessary for wheel running to abolish conditioned place preference for cocaine in mice. Eur J Neurosci. 41 (2), 216-226 (2015).
- Patten, A. R., et al. Long-term exercise is needed to enhance synaptic plasticity in the hippocampus. Learn Mem. 20 (11), 642-647 (2013).
- Carro, E., Nunez, A., Busiguina, S., Torres-Aleman, I. Circulating insulin-like growth factor I mediates effects of exercise on the brain. J Neurosci. 20 (8), 2926-2933 (2000).
- Cotman, C. W., Berchtold, N. C. Exercise: a behavioral intervention to enhance brain health and plasticity. Trends Neurosci. 25 (6), 295-301 (2002).
- Praag, H., Fleshner, M., Schwartz, M. W., Mattson, M. P. Exercise, energy intake, glucose homeostasis, and the brain. J Neurosci. 34 (46), 15139-15149 (2014).
- van Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H.
- Hamilton, G. F., Criss, K. J., Klintsova, A. Y. Voluntary exercise partially reverses neonatal alcohol-induced deficits in mPFC layer II/III dendritic morphology of male adolescent rats. Synapse. 69 (8), 405-415 (2015).
- Goodlett, C. R., Thomas, J. D., West, J. R. Long-term deficits in cerebellar growth and rotarod performance of rats following "binge-like" alcohol exposure during the neonatal brain growth spurt. Neurotoxicol Teratol. 13 (1), 69-74 (1991).
- Goodlett, C. R., Lundahl, K. R. Temporal determinants of neonatal alcohol-induced cerebellar damage and motor performance deficits. Pharmacol Biochem Behav. 55 (4), 531-540 (1996).
- Boschen, K., Ruggiero, M., Klintsova, A. Neonatal binge alcohol exposure increases microglial activation in the developing rat hippocampus. Neuroscience. 324, 355-366 (2016).
- Goodlett, C. R., Peterson, S. D. Sex differences in vulnerability to developmental spatial learning deficits induced by limited binge alcohol exposure in neonatal rats. Neurobiol Learn Mem. 64 (3), 265-275 (1995).
- Murawski, N. J., Klintsova, A. Y., Stanton, M. E. Neonatal alcohol exposure and the hippocampus in developing male rats: effects on behaviorally induced CA1 c-Fos expression, CA1 pyramidal cell number, and contextual fear conditioning. Neuroscience. 206, 89-99 (2012).
- Thomas, J. D., Sather, T. M., Whinery, L. A. Voluntary exercise influences behavioral development in rats exposed to alcohol during the neonatal brain growth spurt. Behav Neurosci. 122 (6), 1264-1273 (2008).
- Hamilton, G. F., et al. Neonatal alcohol exposure disrupts hippocampal neurogenesis and contextual fear conditioning in adult rats. Brain Res. 1412, 88-101 (2011).
- Hamilton, G. F., et al. Exercise and environment as an intervention for neonatal alcohol effects on hippocampal adult neurogenesis and learning. Neuroscience. 265, 274-290 (2014).
- Kelly, S. J., Lawrence, C. R. Alcohol: Methods and Protocols. Nagy, L. E. , (2008).
- Helfer, J. L., et al. Binge-like postnatal alcohol exposure triggers cortical gliogenesis in adolescent rats. J Comp Neurol. 514 (3), 259-271 (2009).
- Hamilton, G. F. Behavioral Interventions to Alleviate the Impact of Neonatal Alcohol Exposure on Cell Morphology in the Rodent Hippocampus and Medial Prefrontal Cortex. Doctor of Philosophy thesis. , University of Delaware. (2012).
- Klintsova, A. Y., et al. Persistent impairment of hippocampal neurogenesis in young adult rats following early postnatal alcohol exposure. Alcohol Clin Exp Res. 31 (12), 2073-2082 (2007).
- Brockett, A. T., LaMarca, E. A., Gould, E. Physical exercise enhances cognitive flexibility as well as astrocytic and synaptic markers in the medial prefrontal cortex. PLoS One. 10 (5), e0124859 (2015).
- Creer, D. J., Romberg, C., Saksida, L. M., van Praag, H., Bussey, T. J. Running enhances spatial pattern separation in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2367-2372 (2010).
- Patten, A. R., et al. The benefits of exercise on structural and functional plasticity in the rodent hippocampus of different disease models. Brain Plast. 1 (1), 97-127 (2015).
- Van der Borght, K., et al. Physical exercise leads to rapid adaptations in hippocampal vasculature: temporal dynamics and relationship to cell proliferation and neurogenesis. Hippocampus. 19 (10), 928-936 (2009).
- Johansson, B. B., Belichenko, P. V. Neuronal plasticity and dendritic spines: effect of environmental enrichment on intact and postischemic rat brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (1), 89-96 (2002).
- Sirevaag, A. M., Greenough, W. T. Differential rearing effects on rat visual cortex synapses. II. Synaptic morphometry. Brain Res. 351 (2), 215-226 (1985).
- Pham, T. M., Winblad, B., Granholm, A. C., Mohammed, A. H. Environmental influences on brain neurotrophins in rats. Pharmacol Biochem Behav. 73 (1), 167-175 (2002).
- Patten, A. R., et al. Long-term exercise is needed to enhance synaptic plasticity in the hippocampus. Learn Mem. 20 (11), 642-647 (2013).
- Patten, A. R., et al. The Benefits of Exercise on Structural and Functional Plasticity in the Rodent Hippocampus of Different Disease Models. Brain Plasticity. 1 (1), 97-127 (2015).
- Abou-Ismail, U. A. Are the effects of enrichment due to the presence of multiple items or a particular item in the cages of laboratory rat? Appl Ani Behav Sci. 134 (1-2), 72-82 (2011).
- Stranahan, A. M., Khalil, D., Gould, E. Social isolation delays the positive effects of running on adult neurogenesis. Nat Neurosci. 9 (4), 526-533 (2006).
- Boschen, K. E., Hamilton, G. F., Delorme, J. E., Klintsova, A. Y. Activity and social behavior in a complex environment in rats neonatally exposed to alcohol. Alcohol. 48 (6), 533-541 (2014).
- Artola, A., et al. Long lasting modulation of the induction of LTD and LTP in rat hippocampal CA1 by behavioural stress and environmental enrichment. Eur J Neurosci. 23 (1), 261-272 (2006).
- Bergami, M., et al. A critical period for experience-dependent remodeling of adult-born neuron connectivity. Neuron. 85 (4), 710-717 (2015).
- Fréchette, M., Rennie, K., Pappas, B. A. Developmental forebrain cholinergic lesion and environmental enrichment: behaviour, CA1 cytoarchitecture and neurogenesis. Brain Res. 1252, 172-182 (2009).
- Rogers, J., et al. Dissociating the therapeutic effects of environmental enrichment and exercise in a mouse model of anxiety with cognitive impairment. Transl Psychiatry. 6, e794 (2016).
