Summary
A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.
Introduction
En 1998, Fire y Mello informaron de que el ARN de doble cadena (dsRNA) puede inducir la inhibición de la función de genes en Caenorhabditis elegans 1. Esta respuesta desencadenada por dsRNA se denomina ARN de interferencia (RNAi), y se informó como el silenciamiento de genes mediada por ARNi ser conservadas en los animales, las plantas y los hongos 2-7. En las plantas y algunos animales, las funciones de RNAi sistémica, lo que significa que el efecto se pueden propagar a otras células / tejidos en los que no se introduce directamente ARN de doble cadena (revisado en 8-10). Los científicos han hecho uso de esta respuesta ARNi celular endógeno mediante el diseño de ARN de doble cadena para apuntar genes de interés, llamando así a la baja la función de genes sin manipular directamente el genoma (revisado en 11-14).
RNAi es una herramienta poderosa para los estudios funcionales debido a las siguientes ventajas. En primer lugar, incluso con un mínimo de información de la secuencia de genes, un gen puede ser objetivo utilizando RNAi. Esto es especialmente importante para studies de organismos modelo que carecen de datos genómicos o transcriptómica. En segundo lugar, en los organismos donde la respuesta RNAi es robusta sistémica, mediada por RNAi desmontables gen se puede realizar en casi cualquier etapa de desarrollo. Esta característica es muy útil para estudiar la función de genes pleiotrópicos. En tercer lugar, en algunos casos, los efectos de RNAi se propagan a las gónadas y la progenie, como que los fenotipos se observan en la descendencia 15,16. Este fenómeno, conocido como parental RNAi (pRNAi), es especialmente ventajoso para los genes que afectan el desarrollo embrionario, tan numerosos descendencia producida por un solo padre inyectado puede examinarse sin manipulación directa de los huevos. Por estas razones, pRNAi es el método de elección. Sin embargo, si pRNAi es ineficaz, por ejemplo, para los genes necesarios para la ovogénesis, entonces embrionario RNAi (eRNAi) debe ser utilizado. En cuarto lugar, RNAi puede ser utilizado para generar el equivalente de una serie alélica en que la cantidad de dsRNA entregado se puede variar en un rango para producir débil para defectos fuertes. una gradación de fenotipos Tal puede ser útil para la comprensión de la función del gen cuando el gen está implicado en un proceso complejo y / o la pérdida completa de la función es letal. En quinto lugar, la entrega de dsRNA es generalmente fácil y factible, especialmente en animales que muestran robustas respuestas RNAi sistémicos. ARN de doble cadena puede ser introducido mediante microinyección 1,5, la alimentación / ingestión 17,18, remojo, 19,20 y virus / bacterias mediada por la entrega 21,22. En sexto lugar, a diferencia de algunos métodos de focalización / edición de genes, no hay necesidad para la detección de organismos portadores de la mutación o para llevar a cabo los cruces genéticos para generar homocigotos utilizando RNAi. Por lo tanto, en comparación con muchas otras técnicas para estudiar la función de genes, RNAi es rápido, barato, y se puede aplicar para pantallas de gran escala 23-25.
La amplia utilidad del ARNi proporciona medios para llevar a cabo estudios funcionales en una amplia gama de organismos, la ampliación de la gama de especies disponibles para el estudio Beyond los sistemas modelo tradicional para el que se han desarrollado herramientas genéticas. Por ejemplo, se requieren estudios que utilizan sistemas que no son modelos para dar una visión de la evolución de los genes y las redes de genes mediante la comparación de las funciones de los ortólogos de especies que representan diferentes modos de desarrollo o exhibir características morfológicas distintas 26-29. Estos tipos de estudios proporcionarán una mejor comprensión de la diversidad biológica, con repercusiones tanto para la investigación básica y aplicada.
Siendo el grupo animal más grande del planeta, los insectos proporcionan una gran oportunidad para explorar los mecanismos de la diversidad subyacente. Además, los insectos son generalmente pequeños, tienen ciclos de vida cortos, alta fecundidad, y son fáciles de criar en el laboratorio. En las últimas dos décadas, el ARNi se ha aplicado con éxito en los insectos que abarca órdenes, incluyendo dípteros (moscas verdaderas) 5, Lepidoptera (mariposas y polillas) 30, coleópteros (escarabajos) 16,31, himenópteros (Sawfmentiras, avispas, hormigas y abejas) 32, hemípteros (chinches), Isoptera (termitas) 34, Blattodea (cucarachas) 35, ortópteros (grillos, saltamontes, langostas y saltamontes) 36 y Phthiraptera (piojos) 37. La aplicación exitosa de RNAi ha proporcionado datos funcionales para el estudio de los patrones en la embriogénesis temprana (eje antero-posterior 32, eje dorso-ventral 28, la segmentación 26,38), la determinación del sexo 39,40, la biosíntesis de quitina / cutícula 41, ecdisona señalización 42, el comportamiento social de 43 años, y más. Métodos de ARNi desarrollados para diferentes especies de insectos pueden ser de beneficio adicional en que es probable que sea útil para el control de plagas (revisado en 44 a 46). RNAi efectos serán de genes específicos, así como específico de la especie, siempre que las regiones no conservadas se eligen para la orientación. Para las especies de insectos beneficiosos como las abejas y gusanos de seda, dirigidos a los genes vitales para la supervivencia devirus o parásitos para controlar la infección pueden proporcionar una nueva estrategia para proteger estas especies 47,48.
Dermestes maculatus (D. maculatus), nombre común ocultar escarabajo, se distribuye en todo el mundo a excepción de la Antártida. Como un insecto holometabolous, el ciclo de vida de D. maculatus incluye embrionario, larvas, pupas y adultos etapas (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus se utiliza en museos para esqueletizar animales muertos y entomólogos forenses se puede utilizar para estimar el tiempo de la muerte 49,50. D. maculatus se alimenta de productos de origen animal, incluyendo canales, carne seca, queso y las pupas / capullos de otros insectos y por lo tanto causa daño a los hogares, los alimentos almacenados, y la seda, el queso, la carne y las industrias de 51,52. La aplicación de RNAi en este escarabajo podría proporcionar una forma eficiente y respetuosa con el medio ambiente para reducir al mínimo su impacto económico. Nuestro laboratorio ha utilizado D. maculatus como un nuevo mOdel insectos para estudiar la segmentación 53. Además de ser susceptible a la cría de laboratorio, D. maculatus es de interés para la investigación básica, ya que es un desarrollador intermedio de gérmenes, por lo que es una especie útil para estudiar la transición entre el desarrollo a corto y largo germen.
Figura 1: Ciclo de vida de D. maculatus. Las fotografías de D. maculatus en diferentes etapas de la vida, como se indica. El ciclo de vida de huevo a adulto dura tres semanas a 30 ° C, pero ya a temperaturas más bajas. (A, F), los embriones recién puestos son de color blanco a amarillo claro y ovalados, de aproximadamente 1,5 mm de longitud. Embriogénesis toma ~ 55 horas a 30 ° C. (B, C y G) Las larvas tienen rayas pigmentadas oscuras y están cubiertas de pelos. Las larvas pasan por varios estadios en función del entorno y su duración puede extenderse hasta más de 1 cm. (D, H) (E, I) Poco después de la eclosión, pigmentación oscura aparece sobre el cuerpo del escarabajo adulto. Los adultos pueden vivir hasta varios meses y una hembra puede poner cientos de embriones durante su vida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Anteriormente, hemos demostrado que el ARNi es eficaz en el derribo de genes en función de D. maculatus 53. Aquí nuestra experiencia crianza de colonias D. maculatus en el laboratorio es compartido junto con los protocolos de paso a paso, tanto para los padres embrionario y ARNi puesta en marcha, la inyección, la atención post-inyección, y el análisis fenotípico. Los métodos de derribo y análisis de genes mediada por dsRNA introducidos aquí no sólo proporcionar información detallada para abordar cuestiones de D. maculatus, sino que también tienen importancia potencial for la aplicación de RNAi en otros no modelo escarabajo / especies de insectos.
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Protocol
1. Cría de D. maculatus
NOTA: Una colonia de reproducción de D. maculatus se creó en el laboratorio de los autores utilizando los adultos y las larvas adquirido comercialmente. La identidad de la especie se verifica por medio de códigos de barras de ADN 53.
- Para configurar una nueva jaula en el laboratorio, extender una capa delgada de virutas de madera en una jaula de insectos de tamaño mediano (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Coloque un ~ 10 x 6 x 3 cm 3 trozo de espuma de poliestireno en la jaula para que las larvas para ocultar la fase de pupa. Añadir 20 - 50 (escarabajos adultos o larvas tarde). Los escarabajos se esconden en las virutas de madera.
- Añadir la comida para gatos en húmedo en una placa Petri o un barco de pesaje. Cubrir la jaula con tela de malla y colocar la jaula en una incubadora.
- Para el mantenimiento de una colonia de cría en el laboratorio, ajustar la temperatura entre 25 y 30 ° C. D. maculatus crece más rápido a temperaturas más altas, pero esto también promueve el crecimiento de hongos y ácaros. Para mantener un sanartu colonia, use 25 - 28 ° C durante regulares Stock mantenimiento y 30 ° C durante la rápida expansión de la colonia. El ciclo de vida dura aproximadamente tres semanas a cuatro meses dependiendo de factores ambientales 50 (Figura 2).
Figura 2: D. maculatus colonia de laboratorio. Se muestra la fotografía de una jaula de insectos típica D. maculatus. virutas de madera se extienden a dejar que los escarabajos se esconden. La comida para gatos se añade en una pequeña placa de Petri o recipiente pesado. Espuma de poliestireno se coloca en la jaula como un refugio para las larvas de último instar a convertirse en crisálidas. La jaula se muestra aquí es 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 y alberga unos pocos cientos de larvas, pupas y adultos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Pastocinco huevos en la jaula para madurar. Para expandir la colonia, establecer nuevas jaulas con los huevos recogidos (como se describe en la Sección 2), larvas o adultos, como el anterior. D. maculatus ponen huevos a lo largo de la jaula, especialmente cerca de la fuente de alimento.
- Vuelva a colocar la comida para gatos mojada alrededor de dos veces a la semana.
NOTA: Debido al olor desagradable de comida para gatos mojada, las fuentes alternativas de alimentos también fueron probados (ver Discusión).
2. Colección de Embriones
- Para configurar una colección, separar al menos 50 machos y 50 hembras de la colonia. Los adultos jóvenes son los mejores. Colocar en una jaula de tamaño mini (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) y sin virutas de madera adultos. Añadir la comida para gatos en un recipiente pesado.
- Antes de iniciar la recopilación, comprobar la jaula cuidadosamente en busca de embriones presentes y eliminarlos. Poner una bola de algodón se extendía en la jaula, y dejar la jaula en un 30 ° C incubadora. Después de que la ventana de tiempo adecuado, la bola de algodón estará listo para la recogida de embriones.
- Doblezun pedazo de papel de construcción negro (tamaño A4) por la mitad para crear un pliegue, y luego se desarrollan.
- Retire la bola de algodón se extendía desde la jaula. Retire los adultos de la bola de algodón y ponerlos de nuevo en la jaula.
- Mientras aprieta la bola de algodón estirada con mucha suavidad, destrozarlo lentamente en filamentos finos de algodón para permitir que los huevos caen sobre el papel negro.
NOTA: D. maculatus embriones son frágiles y difíciles de ver en el algodón. Ellos se pueden triturar fácilmente si la celebración de la bola de algodón con demasiada firmeza.
3. Preparación de dsRNA
- Preparación de plantilla de ADN para ARN de doble cadena Síntesis
- Ejecutar 4-6 50 l reacciones de PCR usando los cebadores que contienen las secuencias del promotor T7 en ambos extremos 5 'para amplificar la plantilla de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Se purifica el producto de PCR utilizando un kit comercial de purificación de PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración final ideal de plantilla de ADN es ≥100 ng / l.
- Inyección de tampón de preparación de
- Preparar 100 ml de tampón de inyección (0,1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM de KCl). Ajustar el pH a 6,8 con NaOH 5 M.
- almacenar alícuotas a -20 ° C.
- Síntesis dsRNA
- Configurar una reacción en un tubo de 0,2 ml PCR en hielo y llevar a cabo una reacción de transcripción in vitro con T7 polimerasa, siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando ~ 500 ng de molde por reacción.
- Incubar el tubo a 37 ° C durante la noche.
- Digerir el molde de ADN con DNasa, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Calentar el tubo a 94 ° C y mantener a 94 ° C durante 3 min.
- Para recocer el dsRNA, enfriar lentamente el tubo por 1 ° C / min hasta que llega a 45 ° C después de 1 hr.
NOTA: Los pasos 3.3.2 a través de 3.3.5 se puede realizar en un termociclador. - Al etanol precipitado de ARN de doble cadena, añadir 280 lde RNasa libre de agua a 20 l de reacción para ajustar a un volumen final de 300 microlitros. Añadir 30 l de NaOAc 3 M (pH 5,2) y 650 l de etanol. Coloque el tubo en el congelador a -20ºC durante la noche.
- Después de centrifugar a 15.682 xg durante 30 min a 4 ° C, se lava el sedimento de ARN de doble cadena con 70% de etanol. pellet seco y se disuelven en 20 l de tampón de inyección.
- Medir la concentración de la dsRNA utilizando un espectrofotómetro a una 260. La concentración ideal es 3 - 5 de mg / l. Comprobación de la calidad mediante la ejecución de 5 l de una dilución 1:25 de dsRNA en un gel de agarosa al 1% a 90 V durante 30 min. Una sola banda del tamaño esperado será fácilmente visible.
- Almacenar el ARN de doble cadena a -20 ° C o menos.
NOTA: Para cada experimento knockdown RNAi, incluye un control de dsRNA, que no se esperaría que un impacto en el proceso que está siendo estudiado. gfp dsRNA es un excelente control de la mayoría de los experimentos. Preparar e inyectar los ARN de doble cadena de control de lado a lado con el EXPERIMENTAL ARN de doble cadena.
4. Montaje de Microinyector y Micromanipulador
NOTA: Consulte la Figura 3.
- Conectar nitrógeno u otro suministro de aire a la entrada de presión de un instrumento de bomba neumática. Si una bomba neumática no está disponible, aplique presión con una jeringa de 50 ml conectada a un tubo fino.
- Conectar un interruptor de pie para el conector remoto de la bomba para controlar el flujo de la presión de expulsión.
- Fijar un soporte capilar de vidrio al puerto de presión de expulsión de la bomba con el tubo.
- Fije el soporte capilar en un micromanipulador cerca de un microscopio de disección.
5. embrionarias RNAi
NOTA: La figura 4 muestra un diagrama de flujo de D. maculatus embrionario RNAi.
- Preparación eRNAi
- Preparar un embrión recogida de Petri tapa de la placa (90 mm de diámetro). Coloque un pedazo de papel de filtro negro de csobre el interior de la tapa. Ponga un portaobjetos de microscopio estándar en el papel negro.
- Diluir dsRNA a la concentración apropiada con tampón de inyección. Utilice 2 - 3 mg / l para los experimentos iniciales. Siempre mantenga dsRNA en hielo antes de la inyección.
- Añadir el colorante de alimento a las 1:40 de dilución para el ARN de doble cadena y la pipeta suavemente varias veces para mezclar bien.
- Recogida de embriones para Inyección
NOTA: A 25 ° C, núcleos de embriones de 6 - 8 horas después de la puesta de huevos (AEL) migran hacia el óvulo periferia 53. Un blastodermo celular se estableció dentro de 8 - 10 h 53 AEL. Para asegurarse de embriones antes de la etapa de blastodermo celular se utilizan para la inyección, 0 - se recomiendan embriones AEL 3 hr 53 para su uso. recogida de embriones, la preparación y la inyección suelen realizarse en menos de 2 horas si los capilares de vidrio están en buena forma. Por lo tanto, todo el proceso puede ser completado dentro de 5 AEL hr.- Recoger los embriones como se describe en los pasos 2.2-2.5.
- Toque en el papel de construcción negro para transferir embriones en la recogida de Petri tapa de la placa.
- Pegue cinta de doble cara a lo largo del borde de la diapositiva.
- El uso de un cepillo de pintura, alinear los embriones en la cinta perpendicular al borde deslizante con el anterior o extremo posterior en el borde. Tenga en cuenta que los extremos anterior y posterior de los embriones tempranos no son fácilmente distinguibles, por tanto, en la mitad se inyectará promedio en el extremo posterior, que es ideal.
- Carga del ARN de doble cadena en el capilar de vidrio
- Tomar hasta 2 - 4 l de ARN de doble cadena en una punta de pipeta de 20 l microloader.
- Inserte la punta en un capilar de vidrio pre-sacado (en adelante, la aguja) y suavemente la pipeta la solución de ARN de doble cadena en el capilar. Preparar las agujas de capilares de vidrio comerciales utilizando un extractor de micropipeta. Un ejemplo de una aguja de tirado ideal se muestra en la Figura 5. pueden necesitar ser optimizado af La longitud y conicidad de agujasensayos de inyección ter.
- Fijar el capilar de vidrio en el soporte capilar de vidrio.
- Montar el soporte capilar en el micromanipulador.
- La inyección de dsRNA en embriones
- transferir con cuidado el portaobjetos con embriones en la etapa del microscopio de disección.
- Mueva el control a llevar un embrión hasta el centro de la microscopio de campo y el enfoque.
- Coloque la punta del capilar con el micromanipulador mientras se mira en el microscopio de disección. Llevar la punta cerca del final de la primera embrión en la fila.
- Encienda el nitrógeno u otro suministro de aire.
- Ajuste el selector de entrada del solenoide de vacío.
- Ajuste el regulador de presión de expulsión a 10 - 15 psi. Ajustar la presión en función del aparato.
- Abrir el capilar si es necesario. Una vez que la punta está abierta, la solución de color dsRNA se llene la punta.
- Mueva la punta capilar hacia adelante para perforar el correombryo. Si el ajuste de presión es ideal, no fluido embrionario fluirá en el capilar.
- Paso el interruptor de pedal para expulsar solución dsRNA en el embrión hasta que se expulse una cantidad apropiada de solución. La figura 5 muestra ejemplos de morfología del embrión tras la inyección de cantidades apropiadas e inapropiadas de solución.
- Mantenga la punta capilar en el interior del embrión durante ~ 2 segundos, y luego retirarla.
- Mueva el capilar a la siguiente embrión y repita los pasos 5.4.8 - 5.4.10 hasta que se inyectan todos los embriones. Cambiar capilar de vidrio si se obstruye o se rompe.
- La recuperación después de la inyección-e Incubación
- Después de la inyección, colocar la placa en una placa de Petri.
- Añadir una bola de algodón húmedo para la placa de Petri. No deje que la bola de algodón toque la diapositiva.
- Cubrir la placa de Petri y se envuelve con una película de sellado. Etiquetar el plato con el nombre del ARN de doble cadena, concentración, fecha, hora y número de inyectarembriones.
- Coloque la placa de Petri en una incubadora a 30 ° hasta que la escotilla de embriones.
6. RNAi parental
- Las pupas para aislar pRNAi
- Recoger las pupas de la colonia.
- Ordenar pupas hembra bajo el microscopio masculinos y (véase la Figura 6). Mantenga en dos placas de Petri separadas en una incubadora a 30 ° para asegurar que no se produce apareamiento antes de la inyección.
- Comprobar todos los días para los adultos eclosed. La pupación tiene generalmente 5 - 7 días a 30 ° C.
- Transferencia eclosed machos y hembras (ver Figura 6) a dos platos separados de Petri y se les dan de comer comida para gatos cada dos días hasta que estén listos para la inyección.
- Proceder a la inyección una vez que hay suficientes hembras y machos en edad apropiada. Las hembras de 4 a 8 días después de la eclosión son los mejores. Para un análisis típico, 8 - 12 se utilizan hembras. Se necesita un número igual de machos para aparearse 54.
- Preparar dsRNA en hielo (5.1.2 y 5.1.3).
- Conecte una aguja de calibre 32 a una jeringa de 10 microlitros.
- Anestesiar a las hembras en fase de CO2.
- Cargar solución dsRNA en la jeringa sin ocupar cualquier aire.
- Mantenga un lado ventral femenina con una mano y sostener la jeringa con la otra.
- penetrar suavemente la segmacoria (membrana) entre esternitas 2 y 3 con la punta de la aguja. La Figura 7 muestra una hembra durante la inyección. Si la aguja no penetra en el tejido fácilmente, ángulo de la aguja hacia arriba y presione hacia abajo lentamente. Inserto de aproximadamente 2 mm de la aguja en el cuerpo.
- Compruebe la escala de la jeringa mientras empuja lentamente el émbolo inyectando ~ 2 l por hembra.
- Después de la inyección, mantenga la aguja todavía durante al menos 5 segundos antes de sacarla del abdomen de la hembra.
- Transferencia de las hembras inyectadas a una placa de Petri (diámetro 90 mm) y se alimentan con comida para gatos.
- Etiquetar la placa de Petri con el nombre de ARN de doble cadena, cantidad inyectada, la fecha y el número de hembras.
- La recuperación después de la inyección, y el apareamiento
- Incubar la placa de Petri en un incubador a 30 °.
- Después de 24 horas, la transferencia de las hembras inyecta a una mini jaula.
- Añadir a la jaula de un número igual de machos jóvenes no inyectados, y la etiqueta de la jaula.
- Añadir un barco de pesada con comida para gatos en la jaula.
- Deja la jaula en una incubadora a 30 ° para permitir el apareamiento. Después de 24 horas, las mujeres deben comenzar a poner huevos y embriones pueden ser recogidos diariamente o en intervalos de tiempo requeridos.
7. El análisis fenotípico después de RNAi
NOTA: A 30 ° C, se tarda ~ 55 horas para los huevos eclosionan a 50.
- Análisis de Viabilidad eRNAi
- Calcular tasa de eclosión comparando el número de larvas incubadas a la nu total dember de los embriones inyectados. Asegúrese de incluir una inyección de control negativo como embriones pueden ser dañados o muertos por el procedimiento de inyección. tasas de eclosión típicos varían de 30% - 60%. Cuidado con las larvas nacidas comer huevos sin eclosionar.
- Análisis de Viabilidad pRNAi
NOTA: Si viabilidad hembra se ve afectada por el gen blanco de RNAi, las hembras inyectados con dsRNA específico pero no control negativo dsRNA comenzarán a morir. Si se ve afectada la producción de huevos o la puesta de huevos, las hembras exhibirán esterilidad parcial o completa. Puntuación supervivencia de las hembras en comparación con los controles negativos o comparar número total de huevos puestos por hembras experimentales y de control (7.2.3).- Configurar recogida de embriones siguiente paso 2.2.
- Después de 24 horas, recoger embriones siguientes pasos 2.4 - 2.5.
- Contar el número total de los embriones.
- La transferencia de los embriones a un plato de Petri 90 mm. Etiquetar la placa de Petri con el gen blanco, fecha de recolección, y el número de embriones. Incubar los embriones en una incubadora a 30 ° hasta que eclosionan. Ya que los piensos larvas incubadas con embriones no eclosionados, compruebe la placa de Petri con frecuencia y por separado larvas nacidas a partir de embriones no eclosionados con unas pinzas (ver Discusión).
- Contar el número de embriones eclosionados y calcular la tasa de eclosión.
- El examen de los defectos de la cutícula de las larvas tramado
- Recoger las larvas incubadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- En una campana de extracción, añadir 1 ml de solución de fijación.
- Deje el tubo de microcentrífuga a 4 ° C al menos durante la noche para permitir que la solución penetre en el tejido de las larvas.
- Para visualizar, eliminar la mayor cantidad de fijación del tubo como sea posible.
- larvas de enjuague al menos tres veces con PBST.
- Transferencia de las larvas a una placa de vidrio de múltiples pocillos con PBST usando una punta de pipeta P-1000 con el extremo cortado para ensancharlo.
- Bajo un microscopio de disección, estirar las larvas utilizando pinzas para examinar los defectos. yot es crítica para estirarse larvas para examinar los defectos de su contrato como cuerpos en fijador.
- El examen de los defectos de la cutícula en eclosionar las larvas
Nota: Este procedimiento es útil para el examen de fenotipos embrionarias tempranas, sobre todo para los embriones que no sobreviven a la eclosión.- Para pRNAi, añadir PBST en la placa de Petri (7.2.4) y la transferencia de embriones eclosionados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml usando una punta de pipeta P-1000 con el extremo cortado. Para eRNAi, añadir PBST en la placa de Petri (5.5.4), cepillo de embriones no eclosionados del portaobjetos de microscopio y transferirlas a un tubo de microcentrífuga.
- Fijar los embriones con solución de fijación y enjuague con PBST para la visualización siguiendo los pasos 7.3.2 - 7.3.6.
- Con unas pinzas, diseccionar embriones fuera de la cáscara de los huevos bajo un microscopio de disección en PBST.
- La transferencia de los embriones de nuevo a 1,5 ml tubo de microcentrífuga (~ 200 l de embriones en cada tubo).
- Eliminar la mayor cantidad de solUtion como sea posible.
- Añadir 1 ml de 90% de ácido láctico / 10% EtOH. Deje el tubo de centrífuga en una incubadora a 60 ° al menos durante la noche.
NOTA: Los embriones se puede dejar en 60 ° C durante varios días. - Para montar los embriones, una pipeta de ellos en un portaobjetos de microscopio utilizando una punta de pipeta P-1000 con el extremo cortado.
- posicionar manualmente los embriones con fórceps para una orientación ideal.
- Cubrir los embriones con un cubre y visualizar bajo el microscopio utilizando DIC.
- El examen de los defectos Celular y Molecular
NOTA: Este procedimiento es útil para la investigación de las causas subyacentes de la cutícula o fenotipos de letalidad que no se acompaña de defectos de la cutícula.- Para pRNAi, embriones separados de las bolas de algodón en la etapa de desarrollo adecuado y las transfieren a una cesta de recogida de embriones. La cesta de recogida puede ser el mismo o similar al utilizado para las colecciones de embrión de Drosophila.
- Hacerla cesta del huevo de un vial de centelleo de plástico de 25 ml con la parte inferior del vial eliminado, y un círculo de corte de la tapa (más o menos 1 cm de diámetro). Coloca un círculo de super fina malla alrededor de 2,5 cm de diámetro dentro de la tapa, y luego atornillar el vial de centelleo de usar y al revés.
- A medida que la malla se puede quitar fácilmente una vez que los embriones se lavan, se sumerja la malla en un tubo de microcentrífuga con agua para recuperar los embriones que se pegan a la malla.
- Para eRNAi, en la etapa apropiada, añadir PBST a la placa de Petri. Cepillarse los embriones fuera del portaobjetos de microscopio y transferirlas a una cesta de recogida de embriones.
NOTA: La fijación, hibridación in situ, tinción de anticuerpos, y los protocolos de tinción nuclear se pueden encontrar en Xiang et al. 2015 53.
- Para pRNAi, embriones separados de las bolas de algodón en la etapa de desarrollo adecuado y las transfieren a una cesta de recogida de embriones. La cesta de recogida puede ser el mismo o similar al utilizado para las colecciones de embrión de Drosophila.
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Representative Results
Laboratorio de los autores ha utilizado la tecnología de ARNi para estudiar la evolución funcional de los genes que regulan la segmentación en los insectos 53,55. Mientras que todos los insectos son segmentados, los genes que regulan este proceso parecen haber divergido durante las radiaciones de insectos 26,38,56-63. Cribados genéticos en Drosophila identificaron un conjunto de nueve pares de reglas de segmentación de los genes que son responsables de la promoción de la formación de los segmentos corporales 64-70. Aquí, el ortólogo de uno de estos genes, emparejado (PRD), se utiliza para documentar la utilidad del ARNi para el estudio de la función de genes en D. maculatus.
eRNAi y pRNAi eran cada efectiva en la demostración de roles para Dmac - prd en la formación del segmento de esta especie. 2 - 3 g / l de ARN de doble cadena diseñado para atacar Dmac - prd (Figuras 8B, 8D y 8F GFP dsRNA, inyectado como control negativo (Figuras 8A, 8C y 8E).
descendencia de control incubado con una banda pigmentada por segmento. Rayas pigmentadas vecinos estaban separados por una brecha no pigmentada (Figura 8A). Después PRD pRNAi, descendencia afectada tramado con rayas pigmentadas vecinos fusionadas, que indican los límites segmentarias eran defectuosos (Figura 8B). Dependiendo de la gravedad fenotípica, una o varias fusiones se detectaron en larvas afectada. Sin embargo, las fusiones aparecían constantemente en las regiones fronterizas entre T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, lo que indica defectos par-regla-como. Fenotipos cutícula después de caída PRD mostraron pérdida de los segmentos abdominales, así como acorta la longitud del cuerpo (Figura 8D). Engrailed (En) la tinción de anticuerpos se realizó para examinar los defectos moleculares en la primeraembriones después de caída PRD. Mientras que los embriones de control mostraron rayas En la expresión con la misma intensidad en todos los segmentos (Figura 8E), se detectó la expresión reducida con baño en franjas alternas en la descendencia de Dmac-PRD dsRNA inyectado hembras (asteriscos en la figura 8F). El patrón de reducción de la expresión En es consistente con el patrón observado en la cutícula defectuoso larvas incubadas afectada. Para obtener resultados más detallados de fenotipos después de caída PRD en D. maculatus, véase Xiang et al. 2015 53.
Figura 3: Inyección aparato. Se muestra la fotografía de microscopio de disección y micromanipulador utilizado para inyectar embriones D. maculatus. suministro de nitrógeno está conectado al puerto de entrada de presión de una bomba neumática. titular capilar de vidrio se conecta a la ejecpuerto de presión de t de la bomba. Interruptor de pedal está conectado a la bomba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: un diagrama de flujo de D. maculatus embrionarias RNAi. (AD) Recogida de embriones para la inyección. Las hembras ponen los embriones (naranja) en las bolas de algodón (círculo gris). embriones separados de bolas de algodón y las dejó caer sobre un trozo de papel de construcción negro. Las barras blancas indican lágrimas en bola de algodón. embriones de transferencia a una tapa de caja de Petri recoger, forradas con papel negro. (E, F) La inyección de dsRNA en embriones. Alinear los embriones en las diapositivas en cinta adhesiva doble e inyectarlos individualmente bajo un microscopio de disección. Se muestra la aguja con colorante alimenticio verde. (GJ) post-inyección de recuperación y incubación. Coloque una bola de algodón húmedo en la placa de Petri para proporcionar la humedad. Cubrir la placa de Petri y se envuelve con una película (azul claro) de sellado. Coloque la placa de Petri en una incubadora y eliminar larvas incubadas para el análisis fenotípico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Bueno contra la mala embrionarias Ejemplos de inyección. Embrión (A) no inyectados. (B) de embriones inyectados con muy poco ARN de doble cadena. (C) de embriones inyectados con cantidad apropiada de dsRNA. (D) de embriones quebrado con desbordante dsRNA causada por la inyección de nuevo. colorante de alimentos se añadió a dsRNA para la visualización. (E) Los ejemplos de tubos capilares tirados usadas como agujas para inyección. Tenga en cuenta la longitud de la punta cónica y fo dos ejemplos de agujas funcionales. Las barras de escala para la EA representan 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Varón y hembra adultos y pupas. (A) Vista ventral de un macho pupa. (A ') Ampliación de la parte posterior del A. (A ") Ilustración de los órganos genitales masculinos pupa. (B) Vista ventral de una pupa femenina. (B') Ampliación de la parte posterior de pupas B. Mujer tiene dos papilas genitales (blanco flechas). (B ") Ilustración de los genitales femeninas pupa. (C) Vista ventral de un macho adulto. (C ') La vista ampliada de la parte posterior de C. Tenga en cuenta que los adultos masculinos han genitales y un tridente comocircular de la estructura en forma de lóbulos en la 4ª sternite (flechas en blanco y negro, respectivamente). (D) Vista ventral de un adulto femenino. (D ') La vista ampliada de la parte posterior de D. Para todos los paneles, barras de escala indican 1 mm. Para más detalles, véase Xiang et al. 2015 53. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Una hembra durante la inyección. Las hembras son anestesiados y colocados ventral hacia arriba. Se muestra una aguja que penetra los segmacoria entre la 2ª y 3ª esternitas para inyectar ARN de doble cadena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Los fenotipos representativos después pRNAi Dmac-PRD. Inyección (A) de control. Vista lateral de un tipo similar a GFP pRNAi crías silvestres tramado con tres segmentos torácicos y abdominales diez segmentos. Cada segmento tiene setas y rayas pigmentadas. (B) Vista lateral de un tramado a la descendencia pRNAi PRD. La brecha entre rayas pigmentadas vecinos etiquetados se ha estrechado o falta por completo. Fenotipo (C) de la cutícula de un embrión salvaje tipo similar de control sin eclosionar. Fenotipo (D) de la cutícula de un descendiente pRNAi PRD no eclosionados con un menor número de segmentos abdominales. (E, F) disecado germband de: (E) de control, GFP pRNAi ha expresado de manera uniforme en todos los segmentos con baño, (F) prd expresión pRNAi, Sp se reduce en segmentos alternos (asteriscos). Para todos panells, barras de escala indican 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si bien se han desarrollado un pequeño número de sistemas de modelos sofisticados (ratones, moscas, gusanos) durante el siglo 20, el siglo 21 ha visto una ola de nuevos sistemas de los animales que se desarrollan en los laboratorios de todo el mundo. Estos nuevos sistemas permiten a los científicos para hacer frente a cuestiones comparativos y evolutivos que no pueden ser palpados utilizando sólo los sistemas modelo "estándar". Este despliegue de nuevos modelos requiere el rápido desarrollo de métodos para el cultivo de laboratorio, la identificación de genes, y los enfoques funcionales en nuevas especies. A continuación, se presentan los procedimientos para la crianza de D. maculatus en el laboratorio y protocolos paso a paso para embrionaria RNAi, los padres RNAi, y el análisis fenotípico de este escarabajo. El objetivo es que estas descripciones animar a otros a usar D. maculatus en sus propios experimentos y hacer uso de los enfoques que aquí se presentan para desarrollar nuevas especies adicionales del modelo.
Mientras D. maculatus lab colonias son increíblemente fácil de mantener, una limitación de la cría de esta especie es el olor desagradable de la comida para gatos mojada dado a los escarabajos como su fuente de alimento. Para evitar esto, los alimentos alternativos, tales como polvo de suero / proteína de soja, queso, alimentos para perros suelo, y leche en polvo, se ensayaron con o sin algodón húmedo para alterar la humedad. comida para perros suelo era la alternativa más eficaz y se puede utilizar para la alimentación de colonias regular. La supervivencia fue excelente (> 90%) de huevo a adulto en jaulas criados con alimentos para perros seco solo en el 80% de humedad relativa, con o sin agregado de algodón húmedo. Sin embargo, que complementa esta dieta con comida para gatos mojada en la recogida de los huevos para aumentar la fecundidad puede ser necesario en la recogida de un gran número de huevos. Si se utiliza la comida para perros, comida vieja debe ser retirado periódicamente, ya que se ha encontrado comida para perros acondicionado para inhibir la puesta de huevos 54. Croquetas para perros alimentos (KR), los resultados preliminares, corcho, madera, papel y otros materiales también pueden ser utilizados como refugios 71.Curiosamente, la biodegradación de espuma de poliestireno utilizando larvas del escarabajo gusano de la harina ha informado 72. Por lo tanto, esto se ha probado para larvas de D. maculatus. Joven D. maculatus larvas sobreviven hasta la edad adulta con la única espuma de poliestireno o materiales que contienen amianto y el algodón húmedo (datos no presentados), pero si se comen y digieren los materiales que queda por determinar.
Este informe es el primer protocolo detallado para la realización de estudios genéticos funcionales en D. maculatus. El uso de RNAi aquí representa una expansión de esta técnica a un nuevo sistema modelo. Varias observaciones específicas son dignos de mención con respecto al desmontables experimentos de ARNi en D. maculatus y otras especies no modelo. En primer lugar, para garantizar que el ARNi será eficaz en D. maculatus, la misma cepa de D. maculatus utilizado aquí debe ser empleado. Hay pruebas de que Tribolium castaneum diferentes cepas muestran una variación en el ARNi phenotypes 24,73, y fenotipos mutantes a menudo muestran la dependencia de los antecedentes genéticos en especies modelo 74-76. También, hay evidencia anecdótica para la cepa dependencia en otros protocolos, incluyendo hibridación in situ. En segundo lugar, el momento adecuado de inyección es crítico para el éxito de RNAi en D. maculatus. Algo counterintuitively, el segmacoria se penetra más fácilmente después de la cutícula ha esclerotizado por completo, al menos, dos días después de la eclosión. Por lo tanto, hembras vírgenes 4 - 8 días después de la eclosión deben ser utilizados. las mujeres mayores experimentan una menor fecundidad que las hembras recién eclosed y por lo tanto no son apropiados para la inyección. En tercer lugar, inyectado dsRNA puede empujada por la presión interna del abdomen femenino. Para minimizar la posibilidad de perder una gran cantidad de ARN de doble cadena después de la inyección, mantener la aguja en el abdomen durante ~ 5 segundos después de la inyección y luego retirarla lentamente (6.2.8). Mientras tanto, evitar presionar el abdomen de la hembra durante o pocodespués de la inyección. Para eludir resultados sesgados causados por este problema, inyectar al menos 8 hembras para cada dsRNA de obtener suficiente descendencia (~ 200 embriones al día) para el análisis fenotípico. En cuarto lugar, la alta producción de huevos es importante para proporcionar los datos imparciales para el análisis fenotípico después de la inyección. En promedio, cada hembra D. maculatus produce aproximadamente 35 a 55 embriones diaria. Rendimiento del huevo depende del tamaño de la población, edad de la mujer, la humedad, la disponibilidad de alimentos, la temperatura (datos no mostrados), y otros factores ambientales 54. Por lo general, las hembras ponen más a 30 ° C a 25 ° C. En quinto lugar, los embriones no eclosionados pueden canibalizaron por las larvas eclosionadas. Como las larvas eclosionadas son por lo general de tipo salvaje o de tipo sólo afectó ligeramente, mientras que los embriones no eclosionados son afectados con mayor intensidad, este hábito de larvas de D. maculatus puede causar resultados sesgados en un análisis fenotípico cuantitativa. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente la eliminación de larvas nacidas tan pronto como sea posible.
Nuestro laboratorio se ha centrado en D. maculatus segmentación, aunque muchos aspectos de esta especie, incluyendo la fisiología, ecología y control de plagas, son de gran interés. Para el estudio de la embriogénesis y la segmentación, una serie de rayas de pigmentación oscura en el lado dorsal de las larvas de D. maculatus puede servir como un marcador naturales para el desarrollo anormal. También, setas característica arraigada en las rayas pigmentadas de larvas se puede utilizar como una indicación de segmentos. Estas características morfológicas, junto con el hallazgo de que los embriones afectados leve o moderada pueden sobrevivir hasta la eclosión, son ventajas del modelo D. maculatus para estudiar los mecanismos implicados en el patrón del plan básico del cuerpo.
Por último, la importancia de llevar a cabo experimentos, incluyendo un control negativo altamente controladas como dsRNA de GFP y probando dos regiones objetivo que no se superponen para cada gen es fundamental para evitar interpretaciones erróneas debido a efecct de la inyección en sí misma y fuera de objetivo efectos. Para D. maculatus, 4-6 g (2 l de 2 o 3 mg / l) dsRNA se inyectaron en cada mujer y la dsRNA era 200-250 pb de longitud. Las cantidades y otros detalles del protocolo pueden necesitar ser optimizado si dirigir genes que funcionan más adelante en el desarrollo o en diferentes procesos fisiológicos / metabólicos. Descubrimientos anteriores demostraron que los efectos de ARNi se pueden transmitir a las siguientes generaciones más allá de la generación F1 en C. elegans 15. Una minoría de tramado larvas de D. maculatus con defectos de segmentación debido a la ARNi puede sobrevivir hasta la edad adulta y puede reproducirse. Los experimentos preliminares no pudieron revelar defectos evidentes en la generación F2. Los estudios futuros pueden revelar efectos transgeneracionales de RNAi en esta especie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dermestes maculatus live beetles | Our lab or Carolina Biological Supply | #144168 | Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out |
| Wet cat food | Fancy Feast | Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Dry dog food | Purina Puppy Chow | Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) | Exo Terra | PT2260 | For colony maintenance. Can use larger cage if needed |
| Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) | Exo Terra | PT2250 | For embryo collection |
| Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Cotton ball | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 transcription kit | Fisher | AM1334 | For 40 reactions |
| Pneumatic pump | WPI | PV830 | |
| Capillary holder | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| Black filter paper (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Food coloring (green) | McCormick | ||
| Borosilicate glass capillary | Hilgenberg | 1406119 | |
| Needle puller (micropipette puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope glass slide | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Sealing film (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Model 801 Syringe (10 µl) | Hamilton | 7642-01 | |
| Needle (32-gauge) | Hamilton | 7762-05 | |
| Fixation Solution (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Toxic, needs to be handled in fume hood |
| Forcep (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip | Fisher | E5242956003 | |
| Dissecting microscopy for embryo injection | Leica | M420 | |
| Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC microscopy | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
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