Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Muismodel voor Pancreas transplantatie met behulp van een gemodificeerde manchet techniek

Published: December 16, 2017 doi: 10.3791/54998
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3, 1, 1,4, 1
1Center of Operative Medicine, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Medical University Innsbruck, 2Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Medical University Innsbruck, 4Department of Cardiac Surgery, Medical University Innsbruck, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Onder buik solide orgaantransplantatie zijn alvleesklier transplantaties gevoelig voor het ontwikkelen van ernstige ischemie reperfusie letsel-geassocieerde transplantaat schade, leidt uiteindelijk tot vroege prothese verlies. Dit protocol beschrijft een model van lymfkliertest pancreas transplantatie met behulp van een niet-hechtdraad manchet techniek, bij uitstek geschikt voor het analyseren van deze vroege, schadelijke schadevergoeding.

Abstract

Muismodellen hebben verschillende voordelen in transplantatie-onderzoek, met inbegrip van eenvoudige bediening, een scala aan genetisch welomschreven stammen en de beschikbaarheid van de breedste waaier van moleculaire sondes en reagentia in vivo evenals om in te voeren vitro studies. Gebaseerd op onze ervaring met diverse lymfkliertest transplantatie modellen, ontwikkeld wij een heterotopic pancreas transplantatie model in muizen met de bedoeling te analyseren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ernstige ischemie reperfusie letsel-geassocieerde vroege transplantaat schade. In tegenstelling tot eerder beschrijven beschreven technieken met behulp van de hechtdraad technieken, hierin we een nieuwe procedure met behulp van een niet-hechtdraad manchet-techniek.

In de afgelopen jaren, we hebben uitgevoerd meer dan 300 alvleesklier transplantaties in muizen met een algehele slagingspercentage van > 90%, een slagingspercentage nooit voordien beschreef in muis pancreas transplantatie. De ruggengraat van deze niet-hechtdraad manchet techniek voor graft revascularisatie bestaat uit twee hoofdstappen: (I) trekken van het ontvangende vaartuig over een polyethyleen/polyamide manchet en vaststelling van het met een ligatuur van ze, en (II) het donor-schip te plaatsen over de everted ontvangende vaartuig en de vaststelling van het met een tweede ze ligatuur. De resulterende continuïteit van het endotheel laag resulteert in minder thrombogenic laesies met hoge bij tarieven en, ten slotte, hoge slagingspercentages.

In dit model, wordt arteriële anastomose bereikt door het trekken van de abdominale aorta van de donor prothese over de everted gemeenschappelijke halsslagader van het ontvangende dier. Veneuze drainage van de prothese wordt bereikt door de portal ader van de prothese trekken over de everted externe halsslagader van de ontvanger. Dit manuscript biedt details en cruciale stappen van het orgel herstel en orgel implantatie procedures, waardoor onderzoekers met microchirurgische vaardigheden voor het uitvoeren van de transplantatie met succes in hun laboratoria.

Introduction

Gelijktijdige nier-pancreas transplantatie (SPK) vertegenwoordigt de huidige standaard van zorg voor patiënten die lijden aan diabetes mellitus en einde fase nierziekte. Succesvolle transplantatie resulteert in langdurige insuline onafhankelijkheid stabilisatie of zelfs regressie van diabetische microangiopathie en een betere levenskwaliteit1gekoppeld. Echter, in tegenstelling tot andere gemeenschappelijke solide orgaantransplantaties, zoals nier- en lever transplantatie, alvleesklier transplantaties zijn vatbaarder voor ischemie-reperfusie letsel (IRI). Gemelde gevallen van maximaal 35% in gevaar brengen niet alleen graft, maar zelfs patiënt, overleven2,3.

Oxidatieve stress, microcirculatory stoornissen, verhoogd expressie van pro-ontsteking cytokinen en celadhesie-moleculen als gevolg ten slotte in endotheel activering en verlies van de integriteit, zijn al toegeschreven aan deze niet-allogene transplantaat schade 4. tot nu toe de exacte moleculaire mechanismen van IRI zijn grotendeels onbekend en kan variëren van orgaan naar orgaan.

Ondanks grote vooruitgang is geboekt met behulp van in vitro modellen, is de ontwikkeling van diermodellen cruciaal voor het verdiepen van de kennis van moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij graft IRI-geassocieerde veranderingen na transplantatie van de alvleesklier. Verschillende pancreas transplantatie modellen zijn ontwikkeld in knaagdieren5,6, maar slechts een wordt gemeld in muizen7. De achilleshiel van deze veeleisende microchirurgische procedure is het laag overlevingspercentage van 46%. Muismodellen vormt echter het beste model voor transplantatie-onderzoek, omdat het breedste scala aan hulpmiddelen voor moleculaire analyse kan worden toegepast op hen. Op basis van uitgebreide microchirurgische ervaring in muizen met verschillende orgel transplantaties8,9,10, ontwikkeld wij een nieuwe, zeer reproduceerbaar techniek voor heterotopic, cervicale alvleesklier transplantatie in muizen met > 90% slagingspercentage met behulp van een niet-hechtdraad manchet-techniek. Met deze techniek, anastomoses-gerelateerde complicaties worden verlaagd tot een minimum, en een hoog slagingspercentage kan worden bereikt ten opzichte van de hechtdraad model11. Tot nu toe is slechts één muismodel met soortgelijke slagingspercentages beschreven door Liu et al.12. Er zijn echter geen studies gepubliceerd met behulp van dit model tot nu toe.

Protocol

Om te voorkomen van alloimmune reacties, en strikt onderzoeken ischemie-reperfusie transplantaat schade-gerelateerde schade, moet een syngeneic paar van donor en ontvanger worden gebruikt. In dit protocol, mannelijke C57BL6 (H2b) 10-12-weken oude muizen met een gewicht van 26 tot en met 28 g werden gebruikt als grootte-matched donor-ontvanger-paren. Alle dieren gehuisvest waren in een barrière pathogen gratis faciliteit en menselijke zorg in overeenstemming met de "opdrachtgevers of laboratorium Animal Care" geformuleerd door de nationale maatschappij voor medisch onderzoek en de "gids voor de zorg en gebruik van proefdieren" ontvangen opgesteld door de National Academy of Sciences en gepubliceerd door de National Institutes of Health (NIH publicatie nr. 86-23, herzien 1985). Het Oostenrijkse Ministerie van onderwijs, wetenschap en cultuur goedgekeurd de experimenten beschreven in dit manuscript (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011).

1. de alvleesklier aanbestedingen

  1. Anesthetize het donordier met een injectie intraperitoneaal (i.p.) xylazine (5 mg/kg lichaamsgewicht) en ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) met behulp van een naald 27-gauge (G).
  2. Scheren van het haar in de abdominale regio met behulp van een elektrisch scheerapparaat, en monteren van de muis op de operatieve veld in een liggende positie met strengen van tape.
  3. Schrob de operatieve veld driemaal met chloorhexidine gedrenkte gauzes.
  4. Een middellijn abdominale incisie uitvoeren met de bilaterale subcostal extensie met behulp van schaar. Zachtjes exteriorize de ingewanden naar links met steriele katoen stokken, en wikkel ze in een bevochtigde gaas. Til de xyphoid cranially met een mosquito klem te zorgen voor maximale blootstelling van de buikholte voor de volgende stappen.
  5. Met behulp van een 19 G naald, injecteren 400 µL van een steriele 1:4 heparine-natrium chloride oplossing voor heparinisation in de vena cava (IVC), inferior. Na het verwijderen van de naald, euthanaseren het dier door de exsanguination transecting van de aorta.
  6. Ontleden van de abdominale aorta tussen de oorsprong van de superieure mesenterische slagader en de recht nier slagader door zachtjes scheiden met behulp van de vezelig weefsel gebogen uiteinde pincet. Het ondermijnen van de aorta en bind het met een 8/0 zijde ligatuur.
  7. Het hepatoduodenal ligament, die tussen de postpyloric van de twaalfvingerige darm en de lever Hilus loopt identificeren. Verdeel de gal duct onder de ingang van de cystic buis na distale ligatuur, en zachtjes ontleden en transect de portal vein zo distally mogelijk om voldoende lengte voor het uitvoeren van de anastomosis in de ontvanger.
  8. Met behulp van gebogen uiteinde pincet, bot ontleden de abdominale aorta vanaf de vorige ligatuur (zie stap 1.6). Ondermijnen het periaortic weefsel met pincet gebogen uiteinde, binden met een 8/0 zijde ligatuur en het transect met een schaar.
    1. Met behulp van bipolaire pincet, coaguleren van alle takken van de lumbale en de aorta transect met een schaar zo dicht mogelijk bij het middenrif, teneinde voldoende lengte voor vaartuig wapendrager. Transect eindelijk de reeds gebonden aorta boven de linker nier slagader.
  9. Perfuse de alvleesklier met een spuit van de 19 G met 5 mL van histidine-tryptofaan-ketoglutarate perfusie oplossing van 4 ° C op een antegrade wijze via de abdominale aorta, totdat er een duidelijke afvalwater afkomstig van de ader van de portal. Toepassing van lage druk om te voorkomen dat de vorming van oedeem.
    Opmerking: Voer stappen 1.5 aan 1.9 op een snelle en gestandaardiseerde manier om te voorkomen dat vooringenomenheid door warme ischemische verslechtering van de herstelde prothese.
  10. Vervang de ingewanden in de peritoneale holte met behulp van steriele katoen stokken.
  11. Het gebruik van pincet gebogen uiteinde, naast de alvleesklier stapsgewijze vanaf de postpyloric twaalfvingerige darm en vooruit zich beweegt tot het bereiken van het ligament van Treitz. Voor deze stappen, avasculaire bindweefsel gebieden tussen de alvleesklier en de duodenale muur te herkennen.
    1. Bot ontleden deze gebieden met behulp van gebogen uiteinde pincet om te isoleren van de "passerelle" schepen tussen de alvleesklier en de twaalfvingerige darm. Passeren van een ligatuur 8/0 zijde rond elke geïsoleerde vasculaire structuur en binden.
    2. Ten slotte transect de vasculaire structuur met een schaar naar de duodenale muur. Op dezelfde manier, gebruik een 8/0 zijde Sutuur (geologie) te scheiden van de alvleesklier van de maag, het mesenterium en de transverse colon.
      Opmerking: Tijdens deze procedure, de choledocho-ductus pancreaticus is afgebonden.
  12. Bepaal het gastrosplenic ligament loopt van de milt naar de maag, en de korte maag takken, door opheffing van de maag cranially en snijden met schaar. Laat de milt gekoppeld aan de herstelde prothese.
    Opmerking: Om te minimaliseren graft opwarmen, bevloeiing van de alvleesklier continu gebruik maakt van een 10 mL injectiespuit met een naald 19 G met de oplossing van de koude histidine-tryptofaan-ketoglutarate perfusie opgeslagen op ijs.
  13. Tenslotte, verwijderen van de alvleesklier van de donor-site (figuur 1B) door het grijpen van de milt met een tang, en breng dit in de ontvanger.
    1. Als alternatief, om te leiden tot ernstige ischemie-reperfusie letsel, opslaan u de prothese in steriele, 4 ° C perfusie oplossing voor 16 h voordat het implanteren van het in de ontvangende dier.

2. ontvangende voorbereiding

  1. Anesthetize de geadresseerden dier met een i.p. injectie van xylazine (5 mg/kg lichaamsgewicht) en ketamine (100 mg/kg lichaamsgewicht) met behulp van een naald 27 G.
  2. De juiste laterale cervicale regio met behulp van een elektrisch scheerapparaat te scheren, en plaatst u de muisaanwijzer op de operatieve veld in een liggende positie. De muis gebruiken strengen van tape vast te stellen. Vermijd overstrekking van de voorste ledematen Voorkom afbreuk te doen aan de ademhaling.
  3. Schrob de operatieve veld drie keer met chloorhexidine gedrenkte gauzes.
  4. Het maken van een juiste paramedian, licht schuine huid incisie van de jugular incisie aan de juiste onderkaak hoek.
  5. Onverbloemd identificeren en mobiliseren van de laterale takken van het recht externe halsslagader. Hen met een bipolaire Tang coaguleren en transect hen met een schaar.
  6. Til de juiste kwab van de submandibulaire speekselklier cranially, identificeren van de vasculaire stam en uitbranden met behulp van bipolaire pincet. Verwijder de kwab door transecting van de cauterized stam met een schaar.
  7. In analogie met stap 2.5, identificeren alle mediale takken van de externe halsslagader en toeschroeien hen met een bipolaire Tang transect hen met een schaar.
De externe halsslagader ondermijnen met gebogen uiteinde pincet zo cranially mogelijk en het afbinden met twee 8/0 zijde ligaturen, genoeg ruimte tussen de ligaturen verlaat.
  • Transect de externe halsslagader tussen de twee eerder geplaatste ligaturen met rechte schaar.
  • Passeren van de proximale einde van de externe halsslagader via de polyethyleen manchet (inwendige diameter van 0,75 mm, buitendiameter van 0.94 mm) en het handvat van de manchet vast met een klem veneuze microhemostat.
  • Verwijder de band aan het eind van het vaartuig stomp en evert van het schip over de manchet. Het herstellen van de everted ader op de manchet met een cirkelvormige 8/0 - zijde ligatuur (figuur 1A).
  • Proximally en distally toeschroeien het oppervlakkige deel van de juiste sternocleidomastoideus spier, het transect met een schaar, en verwijderen.
  • Zachtjes mobiliseren de gemeenschappelijke halsslagader, ondermijnen het hieronder de bifurcatie en afbinden het tweemaal, om ervoor te zorgen niet te binden de carotis bifurcatie. Snijd het schip tussen de banden.
  • Vergelijkbaar met de stap van 2.9, passeren de proximale einde van de gemeenschappelijke halsslagader via de polyamide manchet (binnendiameter van 0,57 mm, buitendiameter van 0.6 mm) en repareren met een arteriële microvasculaire klem.
  • Verwijder de ligatuur aan het einde van de vasculaire stomp, en zachtjes verbreden de lumen met behulp van vaartuig dilatators. Evert van het schip over de arteriële manchet, en repareren met een 8/0 zijde ligatuur (figuur 1A).

    • 3. implantatie

    1. Plaats de prothese in de geadresseerde nek regio met behulp van de milt als een handvat, met het hoofd georiënteerde lateraal, de staart, met inbegrip van de milt mediaal en de vaartuig stompen ventro-caudally. Gebruik katoenen stokken te plaatsen van de prothese goed.
    2. Trek voorzichtig aan de portal ader van de alvleesklier prothese over van het ontvangende dier externe halsslagader, die heeft al eerder everted, en vast op de juiste manchet (zie stap 2.10). Repareren met een cirkelvormige zijde ligatuur van de 8/0.
    3. Trek de stronk van de abdominale aorta van de prothese over de everted gemeenschappelijke halsslagader van het ontvangende dier. Repareren met een ze 8/0 zijde ligatuur (Figuur 1 c).
    4. Identificeren van de milt schepen dichtbij de Hilus van de milt, en hen met een gebogen uiteinde Tang ondermijnen. Bind ze met 8/0 zijde ligaturen en transect de milt schepen om te verwijderen van de milt. Tot slot, het verkorten van de banden.
    5. Eerst de klem op de veneuze manchet met behulp van een klem Tang toepassen, verwijderen. Verwijder de arteriële klem.
      Opmerking: Als de transplantatie is gelukt, de alvleesklier prothese zal worden reperfused onmiddellijk toont een homogene roze kleur en zichtbaar arteriële pulsatie (Figuur 1 d).
    6. Bevochtig de prothese met normothermic zoutoplossing.
    7. Verwijder het handvat van de veneuze manchet met behulp van rechte pincet.
    8. Sluit de chirurgische wond met een lopend 6/0 hechtdraad.

    4. de postoperatieve zorg (eindpunt)

    1. Na de procedure, tot 0,5 mL van normale zout subcutaan van toepassing zijn (SC) voor vervanging van intraoperatieve vochtverlies met behulp van een naald 19 G.
    2. Houd het ontvangende dier op een verwarming pad tot volledig herstel van de anesthesie.
    3. Eenmaal wakker is, keren de ontvangende dier naar de huisvesting faciliteit, waar het kan hebben voedsel en water ad libitum.
    4. Om te voorkomen dat postoperatieve pijn, beheren direct na de operatie (1) Buprenorphin (0,1 mg/kg b.w.) elke 12 h voor de eerste 5 dagen en b.w. van (2) carprofen 4 mg/kg elke 12 h s.c. voor de eerste week.
    5. Om te kunnen inschatten van goede voeding inname, toezicht op gewicht (g) van elke geadresseerde dier elke dag. Een gewichtsverlies van meer dan 10-15% ten opzichte van gewicht op de dag van de operatie, apathie, verlammende, een zeer gebogen rug, evenals chirurgische kant infecties vertegenwoordigen eindpunten.
      1. In dit geval, evenals na het bereiken van klinisch eindpunt, offeren het dier met behulp van terminal Isofluraan inademing.

    Representative Results

    In het afgelopen decennium, hebben we meer dan 300 alvleesklier transplantaties uitgevoerd in muizen. Na vaststelling van het protocol, was er een algehele overleving van > 90%. Postoperatieve bloeden was de belangrijkste oorzaak voor mislukking, gevolgd door graft trombose met latere dodelijke necrotische graft pancreatitis. In beide gevallen eindpunten waren bereikt binnen de 24u en dieren werden geofferd. Er waren niet alle neurologische aandoeningen, de symptomen zoals dysfagie, en chirurgische kant infecties in deze serie.

    Om te onderzoeken de endocriene functie van de getransplanteerde transplantaten, en vandaar de bij van het model te valideren, hyperglycemie was geïnduceerd in ontvangende muizen door voorbehandeling met een enkelvoudige dosis van intraperitoneally toegepaste streptozotocin (312.5 mg/kg lichaamsgewicht) 4 dagen voor de ingreep. Muizen werden beschouwd als hyperglycemic als bloed glucoseniveaus waren > 300 mg/dL. Figuur 2A toont de niveaus van de glucose van het bloed van de verschillende groepen. Muizen ontvangen van transplantaten zonder een langdurige koude ischemie tijd van 16 h normogylcemia binnen de 24u na transplantatie bereikte, en deze metabole toestand over de volledige observatieperiode gehandhaafd. Daarentegen bleef niet-getransplanteerde dieren hyperglycemic. Aangezien we geïnteresseerd in het effect van ischemie-reperfusie transplantaat schade-geassocieerde schade op de endocriene functie waren, wij een derde groep waar transplantaten werden blootgesteld aan 16 h langdurige koude ischemie tijd (CIT) en 45 min van warme ischemie tijd (WIT) toegevoegd. Muizen ontvangen deze protheses haalde niet normoglycemia en moesten worden opgeofferd na 48 h toe te schrijven aan de ontwikkeling van ernstige pancreatitis, waarvan werd aangetoond dat dodelijk in dit model13.

    Dit model is handig voor diverse projecten gericht op het onderzoeken van ischemie reperfusie letsel-geassocieerde vroege transplantaat schade. Verdere onderzoeken opgenomen, o.a. confocale intravital fluorescentie microscopie voor kwantificering van microcirculatory verstoringen uitgevoerd 2 h na transplantatie. Contrast van de transplantaten microvessels werd versterkt door het injecteren van 0.3 mL van een 0,4% fluoresceïne-isothiocyanaat-geëtiketteerden dextran (MW 150 000 bijvangsten) in de penile ader. Figuur 2B weergeeft een regelmatige capillaire patroon van een naïef lymfkliertest alvleesklier en van een getransplanteerde alvleesklier prothese, die niet werd blootgesteld aan langdurige CIT (figuur 2C). In tegenstelling, kunt figuur 2D zo de uitsplitsing van de microcirculatie als gevolg van de alvleesklier prothese aan langdurige CIT. bloot

    Figure 1
    Figuur 1 : Intraoperatieve afbeeldingen. (A) intraoperatieve weergave van de ontvangende vaartuigen wapendrager voorbereid. De externe halsslagader (1) is everted over de veneuze polyethyleen manchet en vast met een cirkelvormige zijde ligatuur van de 8/0. De gemeenschappelijke halsslagader (2) is in analogie, everted en vaste in de kleinere arteriële polyamide manchet. Schaal bar 1 mm. (B) de alvleesklier graft ex situ. De portal-ader (1) en de stronk van de abdominale aorta (2) die nodig zijn voor vasculaire anastomose. De milt (3) samen met de alvleesklier wordt opgehaald en wordt gebruikt als een handvat. De milt zal worden verwijderd voordat reperfusie van de prothese. Schaal bar 1 cm. (C) intraoperatieve weergave van de anastomoses. De portal-ader (1) is getrokken over de manchet van de everted externe halsslagader (2) en vaste met een cirkelvormige 8/0 zijden stropdas. Ook wordt de aorta stronk van de abdominale aorta (3) getrokken over de manchet van de everted gemeenschappelijke halsslagader (4). Schaal bar 1 mm. (D) intraoperatieve weergave van de perfused alvleesklier prothese na 5 min reperfusie: na verwijdering van de ader, gevolgd door de arteriële klem, een succesvol getransplanteerde alvleesklier graft een homogene roze kleur weergegeven. De milt is verwijderd voordat reperfusie (1: ligaturen milt schip). Schaal bar 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Figure 2
    Figuur 2 : Endocriene functie van de alvleesklier prothese en confocale in vivo fluorescentie microscopie. Figuur 2A toont een lijndiagram met de niveaus van de glucose van het bloed van getransplanteerde Muizen zonder CIT (n = 10, PTX w/o CIT, blauwe lijn), niet-getransplanteerde muizen (n = 11, geen PTX, rode lijn), en muizen ontvangen van transplantaten blootgesteld aan langdurige CIT (PTX + 16 h CIT, n = 10, groene lijn). Alle ontvangers waren eerder verleende hyperglycemic met 312.5 mg/kg b.w. streptozotocin i.p. Terwijl alle ontvangers van transplantaten zonder CIT overleven de volledige observatieperiode (50 dagen) met intact endocriene functie konden, bleef niet-getransplanteerde muizen de hyperglycemic over de volledige observatieperiode. Muizen ontvangen van transplantaten blootgesteld aan 16 h CIT deed niet herstellen van hyperglycemie en moest worden opgeofferd 48 h na de chirurgie van de haartransplantatie, als gevolg van verlies van het gewicht van meer dan 10-15%. Muizen overleven de volledige observatieperiode werden opgeofferd ten dage 50 na een laatste meting van de glycemia. Microcirculatie in getransplanteerde transplantaten werd beoordeeld door confocale intravital fluorescentie microscopie 2 h na transplantatie. Naïef alvleesklier diende als besturingselementen. Figuur 2B bevat een regelmatige capillaire patroon in de alvleesklier naïef. Een regelmatige capillaire gaas is ook gezien in getransplanteerde transplantaten niet onderworpen aan langdurige CIT (figuur 2C). Daarentegen is een uitsplitsing van de microcirculatie in getransplanteerde transplantaten blootgesteld aan langdurige CIT (figuur 2D) waargenomen. Schaal bar 100 µm. gegevens in de grafiek worden uitgedrukt als ± standaardafwijking. PTX: pancreas transplantatie; CIT: koude ischemie tijd; w/o: zonder Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

    Discussion

    IRI-geassocieerde transplantaat schade is inherent aan de solide orgaantransplantatie, en het wordt gekenmerkt door een verstoring van de microcirculatie. Accumulatie van metabolieten van de verscheidene tijdens de ischemische fase, en tijdens het initiëren van inflammatoire cascades stroomt voornamelijk door reactieve zuurstof en stikstof soorten bemiddelde, resulteert in weefselschade tijdens graft reperfusie4. Deze cascade niet alleen op korte termijn, maar ook op lange termijn succes in gevaar kan brengen en, vandaar, aanzienlijk beïnvloedt patiënten overleven14. Tot op heden, vertegenwoordigt gecombineerde niertransplantatie alvleesklier de therapie van keuze voor patiënten met type 1 diabetes met einde fase nierziekte15. Verschillende studies hebben aangetoond dat een succesvolle gecombineerde alvleesklier niertransplantatie niet alleen herstellen en beschermen van graft nierfunctie in diabetische ontvangers, maar ook stabiliseert of zelfs omkeert secundaire complicaties waaronder neuropathie, evenals micro- en macroangiopathy16,17,18.

    Ondanks de voortdurende inspanningen in vermindering, vervanging en verfijning (3 R's) in dierlijke onderzoek is de reproductie van complexe pathofysiologische processen zoals IRI alleen onmogelijk in in vitro -instellingen. Daarom, dierlijke modellen zijn nog steeds beschouwd als de ideale tool voor translationeel onderzoek19,20. Muismodellen zoals hier beschreven hebben verschillende voordelen in vergelijking met rat of ander dier modellen. Het gaat hierbij om de beschikbaarheid van een enorme hoeveelheid genetisch welomschreven ingeteelde muis stammen (zoals transgene en knock-out-stammen), een overvloed van moleculaire analyse-instrumenten, evenals een gemakkelijke en goedkope behandeling van21. Een groot voordeel van het beschreven model ligt in de techniek van niet-hechtdraad manchet. Met behulp van de hierin gepresenteerde techniek, slagingspercentages van > 90% zijn haalbaar, die is dramatisch beter in vergelijking met eerder beschreven modellen22. Met behulp van deze techniek niet-hechtdraad, verminderd wij gemeenschappelijk complicaties zoals trombose, hypovolemische shock en stenose van de anastomoses12aanzienlijk. Een ander voordeel van deze methode bestaat uit de extra abdominale positie van de prothese, die geassocieerd met snelle postoperatieve terugwinning van de ontvanger wordt. Bovendien, maakt de cervicale locatie het uitermate geschikt voor in vivo analyses, zoals live beeldvorming van de prothese door exterioration zonder enige spanning22.

    Het grootste nadeel van dit model is de occlusie van de ductus pancreaticus, die niet lijken op klinische realiteit. In dit model wordt exocrine drainage beheerd door de choledocho-ductus pancreaticus koppelverkoop. In de lange termijn resulteert dit in een gemarkeerde fibrose en atrofie van de klier zonder leidt tot het enten van pancreatitis22. Als gevolg van deze verslechtering van de exocrine weefsel, dat we zo vroeg waargenomen als op dag 30 na de transplantatie, zijn wij van mening dat dit model niet voor de lange termijn waarneming geschikt is. In tegenstelling, maakt de onberispelijke endocriene functie gylcemic controles van de ontvanger een eenvoudig hulpmiddel voor dagelijkse beoordeling van de functie van het transplantaat13,23,24.

    Deze kenmerken maakt dit een ideaal model voor het analyseren van de vroege graft verwondingen die hoort bij lang behoud periodes of met behoud van de verschillende oplossingen en technieken. Om te bereiken optimale succes met dit model, moeten verschillende essentiële stappen worden beschouwd. De alvleesklier zelf is zeer vatbaar voor manipulatie. Daarom, zachte behandeling met behulp van katoen stokken tijdens het herstel van het orgel en tijdens implantatie minimaliseert mechanische trauma. Direct grijpen van de klier met een tang moet worden vermeden, omdat dit onvermijdelijk leiden ernstige graft schade tot zou. Om dezelfde reden, de milt wordt teruggewonnen samen met de alvleesklier, en wordt gebruikt als een handvat. Dit is ook gevestigd in de klinische praktijk. Een verdere valkuil houdt koude perfusie, die wordt bereikt door perfusie via de aorta stomp met behulp van 4 ° C histidine-tryptofaan-ketoglutarate perfusie oplossing. Hierbij kan een overmatige zwelling van de klier worden vermeden door zachtjes zoogdierlevercellen de prothese. De resterende perfusie oplossing moet worden gebruikt voor het bevochtigen van de prothese, om de temperatuur laag te houden tijdens het herstel van het orgel.

    Met betrekking tot geadresseerde voorbereiding stelt een zorgvuldige dissectie van zowel de externe halsslagader, alsmede de gemeenschappelijke halsslagader de basis voor succesvolle revascularisation. Bepaald, compleet blootstelling van de ader door het verwijderen van niet alleen alle zijrivieren, maar ook de omliggende vetweefsel, is nodig om te voorkomen dat externe compressie en stenose door resterende vetweefsel. De selectie van de juiste manchet diameters is van cruciaal belang. Gebaseerd op gedeelde ervaring, voor muizen met een gewicht van 25 tot en met 28 g, is een inwendige diameter van 0,57 mm voor de arteriële manchet, en tussen 0,75 en 0,8 mm voor de veneuze manchet, passend. Nauwkeurige, schone snijden van de randen van de manchetten is verplicht om te voorkomen dat het scheuren van het vaartuig stomp. Torsie van de vaartuigen, met name van de slagader, wordt best bereikt met behulp van vaartuig dilatators met fijne tips. Als een vuistregel moet het schip kunnen verbreden tot tweemaal het lumen van de manchet. Tijdens het proces van everting van het schip en vaststelling van het op de manchet, is het raadzaam de vasculaire klemmen te stabiliseren door ze te plaatsen onder een klep van huid, zoals dit deze cruciale stap vergemakkelijkt.

    Zoals reeds vermeld, de niet-hechtdraad manchet-techniek vertegenwoordigt een eenvoudige methode voor vasculaire anastomose en kan worden uitgevoerd binnen 5 min. Juiste positionering van de prothese in de geadresseerde nek regio is echter van het grootste belang voor de juiste revascularisatie. Hierbij moet de definitieve juiste positionering van de prothese in de nek regio worden verwacht, zodat een veilige, rechte en spanningsvrije wapendrager van zowel de ader en de slagader. Vaartuigen die te lang moeten vermeden worden, omdat dit tot belemmering van de uitstroom te wijten aan het knikken leiden kan. Om dezelfde reden moet ook de manchet-greep op de veneuze wapendrager worden verwijderd na reperfusie. In geval van gelokaliseerde bloedingen uit de alvleesklier prothese, worden succesvolle hemostase bereikt door te zachtjes comprimeren van de bloedende zijde voor 5 min met behulp van katoen stokken. Dit is de enige succesvolle manier om dit soort complicatie beheren.Cauterisatie, hoewel zeer selectief, resulteerde in graft verlies in bijna alle gevallen, als gevolg van necrotisch pancreatitis.

    In samenvatting ontwikkelden we een methode voor het pancreas transplantatie in muizen met behulp van een niet-hechtdraad manchet-techniek, die is technisch en microsurgically haalbaar en heeft uitstekende slagingspercentages. Gezien de progredient fibrose van de alvleesklier te wijten aan de buis occlusie, is dit model geschikt beste voor onderzoeksgebieden gericht op vroege transplantaat schade. Dit manuscript is bedoeld om onderzoekers veilig om dit model in hun laboratoria.

    Disclosures

    De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

    Acknowledgments

    Dit werk werd gesteund door subsidies #2008-1-596 en #UNI-0404/1956 van de "Tiroler Wissenschaftsfonds (TZG)" (https://www.tirol.gv.at/en/), en door subsidie #2013-042018 van de "Förderungsprogramm van de MUI-Start" van de medische Universiteit Innsbruck.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Adventitia Scissors S&T S-00102 Straight
    Dumont # 7 Forceps FST  11271- 30 Curved Tip 0.17 x 0.1 mm
    Yasargil Clip Mini Permanent 7mm Aesculap FE720K
    Micro vessel clip S&T B1 00396 V
    Vessel dilatator S&T D-5a.2, 00125
    Clip applier S & T CAF-4 00072 for venous cuff
    Clip applier Aesculap FE572K  for the arterial cuff
    Polyethylene tube Portex Ltd Inner diameter 0.75 mm for venous cuff
    Polymide tubing Vention Medical  141-0051 Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd)
    Polymide tubing Vention Medical 141-0033 Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff
    Bipolar forceps Micromed 140-100-015
    8/0 silk ligatures Catgut GmbH, Merkuramed 17209008
    Custodiol HTK solution Dr. Franz Köhler Chemie 59997
    Ketamin Graeub aniMedica GmbH 32554
    Xylasol Graeub aniMedica GmbH 50855

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gruessner, A. C. 2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR). Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).
    2. Troppmann, C. Complications after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).
    3. Fernández-Cruz, L., et al. Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation. Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).
    4. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
    5. Konigsrainer, A., Habringer, C., Krausler, R., Margreiter, R. A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring. Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).
    6. Lee, S., Tung, K., Koopmans, H., Chandler, J., Orloff, M. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).
    7. Tori, M., Ito, T., Matsuda, H., Shirakura, R., Nozawa, M. Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation. Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).
    8. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753 (2014).
    9. Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).
    10. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).
    11. Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).
    12. Liu, X. Y., Xue, L., Zheng, X., Yan, S., Zheng, S. S. Pancreas transplantation in the mouse. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).
    13. Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).
    14. Drognitz, O., Obermaier, R., von Dobschuetz, E., Pisarski, P., Neeff, H. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).
    15. White, S., Shaw, J., Sutherland, D. Pancreas transplantation. Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).
    16. Morath, C., et al. Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes. Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).
    17. Perseghin, G., et al. Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study. J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).
    18. Secchi, A., Caldara, R., La Rocca, E., Fiorina, P., Di Carlo, V. Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation. Lancet. 352 (9121), 65 (1998).
    19. Kirk, A. D. Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research. Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).
    20. de Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).
    21. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).
    22. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
    23. Cardini, B., et al. Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation. PLoS One. 9 (11), e112570 (2014).
    24. Maglione, M., et al. Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin. Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).

    Tags

    Geneeskunde kwestie 130 transplantatie microchirurgie muis alvleesklier ischemie-reperfusie letsel manchet techniek
    Muismodel voor Pancreas transplantatie met behulp van een gemodificeerde manchet techniek
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Cardini, B., Oberhuber, R., Hein, S. … More

    Cardini, B., Oberhuber, R., Hein, S. R., Eiter, R., Hermann, M., Kofler, M., Schneeberger, S., Brandacher, G., Maglione, M. Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique. J. Vis. Exp. (130), e54998, doi:10.3791/54998 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter