여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.
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방법 논문
본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 세포 타우 단백질의 응집체는 알츠하이머병 환자의 신경 세포 내부에서 발견됩니다. 이 질병의 발병은 타우(Tau)의 비정상적인 인산화(phosphorylation)를 동반합니다. 질병의 타우 기능 및 기능 장애에 대한 분자 조사 과정에서 핵 자기 공명(NMR) 분광법을 사용하여 타우의 다중 인산화를 식별합니다. 여기에서 NMR 연구를 위한 동위원소 농축과 함께 박테리아에서 Tau의 재조합 생산에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Tau의 열 안정성과 높은 등전점을 활용하는 정제 단계에 대해 설명합니다. 재조합 활성화 ERK2에 의한 Tau의 체외 인산화 프로토콜은 다중 인산화를 생성할 수 있습니다. 단백질 샘플은 이러한 단계에서 데이터를 수집할 준비가 되었습니다. 분광계에서 기록을 시작하기 위한 매개변수 설정은 다음으로 고려됩니다. 마지막으로, NMR 데이터를 기반으로 변형된 Tau의 인산화 부위를 식별하는 전략을 설명합니다. 면역 검출 또는 질량 분석법(MS)과 같은 인산화 부위를 식별하는 데 사용되는 다른 기술과 비교하여 이 방법론의 이점에 대해 설명합니다.
서론
21 세기 의료의 주요 과제 중 하나는 알츠하이머 병 (AD)와 같은 신경 퇴행성 질환이다. 타우 미세 소관 (MT)의 형성을 자극 미세 소관 - 연관된 단백질이다. 타우 동등하게, 여러 가지 신경 퇴행성 질환에서 가장 잘 알려진이 AD로되어있는 소위 퇴행성 신경을 참여하고있다. 이러한 질환에서, 타우 쌍 나선형 필라멘트 (PHFs)에서 자기 집합체와는 같은 인산화 1과 번역 후 수정 (PTMS)에 의해 많은 잔류에 수정 발견된다. 타우 단백질의 인산화는 MT 안정화 및 AD 신경 세포의 특징 기능의 병리학 적 손실의 생리 기능을 모두 조절에 관여한다.
질병 뉴런 PHFs에 통합 될 때 더욱이, 타우 단백질은 언제나 2 hyperphosphorylated된다. 2 ~ 3 인산염 그룹을 포함하는 일반 타우는 달리, PHFs에서 hyperphosphorylated 타우 5-9 phosphat을 포함전자 그룹 3. 타우의 과인산 일부 사이트에서와 인산화의 병적 인 사이트라고 추가 사이트의 인산화에 화학 양론의 증가에 모두 해당한다. 그러나, 중복 레벨 4의 양적 차이에도 불구하고, AD 및 인산화의 정상 성인의 패턴 사이에 존재합니다. 어떻게 특정....
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프로토콜
15 N 1. 생산, 13 C-타우 (그림 1)
- BL21에 pET15b-타우 재조합 T7 발현 플라스미드 (13, 14)을 변환 (DE3) 유능한 대장균 박테리아 세포 15.
주 : 최장 (441 아미노산 잔기) 타우 이성체에 대한 cDNA의 코딩은 플라스미드 pET15b에서을 NcoI 및 XhoI에 제한 부위 사이에 클로닝한다.- 유능한 BL21 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 플라스미드 DNA의 100 NG와 플라스미드 DNA의 μg의 당 1-5 × 10 (7) 식민지를 형성 (DE3) 세포의 부드럽게 50 μl를 섞는다.
참고 : 진핵 cDNA를 발현 코돈 - 사용에 최적화 된 균주는 인간의 타우를 생산하는 것이 필수적되지 않습니다. - 42 ° C에서 10 초 동안 다음 30 분 및 열 충격 얼음에 세포 혼합물을 놓습니다. 다시 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓고 실온 LB (루리아 - 베르 타니) 배지 1 ㎖를 추가합니다. 부드러운 하에서 30 분 동안 37 ℃에서 세균 현탁액을 부화동요.
- 유능한 BL21 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 플라스미드 DNA의 100 NG와 플라스미드 DNA의 μg의 당 1-5 × 10 (7) 식민지를 형성 (DE3) 세포의 부드럽게 50 μl를 섞는다.
- 항생제 암피실린을 100 ㎍ / ml를 함유하....
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결과
도 3a는 용출 구배 중 관찰 된 280 nm에서 큰 흡수 피크를 나타낸다. 크로마토 그램 상기 아크릴 아마이드 겔에서 볼 때이 피크는 정제 된 타우 단백질에 해당한다. 도 3b는 단백질의 탈염이 효율적으로 보장, 280 nm의 전도도의 피크에서 잘 분리 흡수 피크를 보여줍니다. 도 4는 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 여러 단백질 인산화 (16)의 특성을 관찰 겔 - 시프트 (비교 레인 2 및 3).을 나타낸다 도 6은 (마이크로 초 단위)의 펄스 길이의 증가에 양성자 (H 1)의 1D 스펙트럼의 시리즈를 보여준다. 이 신호를 최소화함으로써 보정 쉽다로 설정하는 펄스가 360 ° 회전에 대응하여 90 ° 일 H 스핀 자화를 회전 할 펄스의 길이는, 실제로 사용된다. 360 ° 펄스 길이가 적절하게 정의 할 때 물 양자의 신호는 null입니다. 360에 대응하는 값(76); 회전 .......
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토론
우리는 효소 변성 타우 샘플의 특성을 NMR 분광 분석을 사용 하였다. 재조합 발현과 전장 사람 타우 단백질 여기 기재된 정제 마찬가지로 돌연변이 또는 타우 타우 도메인을 생성하는데 사용될 수있다. 동위 원소 적으로 농축 된 단백질의 재조합 발현을 필요로, NMR 분광법 필요하다. 인산화 사이트의 식별 공명 할당 및 15 N, 13 C 이중 표지 단백질을 필요로한다. 동위 원소의 가격을 감안할 때, 양호한 수율은 재조합 발현 단계에서 요구된다. 따라서 포도당 (13) C (6) 글루코스의 양이 수율을 향상시키기 위해 성장 배지 리터 당 4 g으로 증가 될 수 M9 배지에서 세균의 성장을위한 제한 인자가된다. 완전 배지 및 MEM 비타민의 추가는 필수는 아니지만 수율 성장을 촉진하고 개선하는 데 도움이됩니다. 완전한 표지 매체의 높은 가격을 감안할 때, 본 제품은 성장 배지로 사용 supplemen티. 세균의 성장은 M9 배지에서 느립니다. 일반적으로.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
NMR 시설은 Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community(FEDER), French Research Ministry 및 University of Sciences and Technologies of Lille의 지원을 받았습니다. TGE RMN THC(FR-3050, 프랑스), FRABio(FR 3688, 프랑스), Lille NMR 및 RPE Health and Biology 핵심 시설의 지원에 감사드립니다. 당사의 연구는 LabEx(Laboratory of Excellence), DISTALZ(알츠하이머병에 대한 학제간 접근 방식을 위한 혁신 전략 개발), EU, ITN, TASPPI 및 ANR BinAlz의 보조금으로 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pET15B 재조합 T7 발현 플라스미드 | Novagen | 69257 | -20 ° C |
| BL21 (DE3) 형질 전환 유능 E. coli< / em> 박테리아 | New England Biolabs | C2527I | -80 ° C |
| 오토클레이브 LB 육수, Lennox | DIFCO | 240210 | 세균 성장 매체 |
| MEM 비타민 보충 100x | Sigma | 58970C | 세균 성장 매체 보충제 |
| 15N, 13C-ISOGRO 완전 중간 분말 | 시그마 | 608297 | 세균 성장 매체 보충제 |
| 15NH4Cl | 시그마 | 299251 | 동위원소 |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | 동위원소 |
| 프로테아제 억제제 정제 | Roche | 5056489001 | 4 °에서 유지; 1ml |
| 의 C 1 정제는 -20 °C로 유지할 수있는 40x 용액입니다. C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | -20 유지 ° C |
| 균질화 기 (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | 용해는 4 °C에서 실현됩니다. C | |
| 피어스&트레이드; 염색되지 않은 단백질 MW 마커 | 피어싱 | 266109 | |
| 활성 인간 MEK1 키나아제, GST 태그 | 시그마 | M8822 | -80 °에 유지; C |
| AKTÄ 순수 크로마토그래피 시스템 | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 |
| HiPrep 26/10 탈염 | GE Healthcare | 17-5087-01 | 단백질 탈염 컬럼 |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | 단백질 탈염 컬럼 |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | 중수소화 NMR 버퍼 |
| 5mm 대칭 마이크로튜브 SHIGEMI D2O(내부 및 외부 파이프 5개 세트) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol 키트-전자 주사기 스타터 키트 | Cortecnet | 2910000 | 피펫팅 |
| Bruker 900MHz AvanceIII, 삼중 공명 극저온 프로브 헤드가 있는 | Bruker | NMR 분광계 데이터 수집을 위한 | |
| 600MHz Avance, 삼중 공명 극저온 프로브헤드가 있는 | Bruker | NMR 분광계 | |
| NMR 실험을 위한 | TopSpin 3.1 | Bruker | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard 및 DG Kneller) | NMR 데이터 분석 소프트웨어 |
참고문헌
- Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y.
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재인쇄 및 허가
