Introduction
Een van de belangrijkste uitdagingen van de gezondheidszorg in de 21e eeuw zijn neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Tau is een microtubule-geassocieerde eiwit dat microtubulusvorming (MT) stimuleert. Tau is eveneens betrokken bij verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zogenaamde tauopathieën, waarvan de bekendste is AD. In deze aandoeningen, is Tau self-aggregaten in gepaarde spiraalvormige filamenten (PHF) en vond gewijzigd op vele residuen door posttranslationele modificaties (PTMs), zoals fosforylering 1. Fosforylering van tau-eiwit is betrokken bij zowel de regulering van de fysiologische functie van MT stabilisatie en pathologische verlies van functie die AD neuronen kenmerkt.
Bovendien Tau eiwit, indien geïntegreerd in PHF's bij zieke neuronen, onveranderlijk hypergefosforyleerd 2. In tegenstelling tot normale Tau dat 2-3 fosfaatgroepen bevat, de hypergefosforyleerde Tau in PHF's bevat 5-9 Phosphate 3 groepen. Hyperfosforylering van Tau overeen zowel met een stijging van stoichiometrie bij sommige sites en fosforylering van extra sites die pathologische plaatsen van fosforylering worden genoemd. Er bestaat echter overlapping tussen AD en normale volwassen patronen van fosforylering, ondanks kwantitatieve verschillen in het niveau 4. Hoe specifiek fosforylering gebeurtenissen invloed functie en disfunctie van Tau blijft grotendeels onbekend. Wij streven ernaar om Tau regelgeving ontcijferen door PTMs op moleculair niveau.
Om het begrip van de moleculaire aspecten van Tau verdiepen, we moeten technische uitdagingen aan te pakken. Ten eerste, Tau is een intrinsiek ongeordend eiwit (IDP) als geïsoleerd in oplossing. Dergelijke eiwitten missen welomschreven driedimensionale structuur onder fysiologische omstandigheden en vereisen specifieke biofysische methoden om hun functie (s) en structurele eigenschappen te bestuderen. Tau is een paradigma voor de groeiende klasse van ontheemden, vaak geassocieerd metaandoeningen zoals neurodegeneratieve ziekten, vandaar toenemend belang om de moleculaire randvoorwaarden die hun functie te begrijpen. Ten tweede karakterisering van Tau fosforylering is een analytische uitdaging, met 80 mogelijke fosforylatieplaatsen plaatsen langs de sequentie van de langste 441 aminozuur Tau isovorm. Een aantal antilichamen ontwikkeld tegen gefosforyleerde epitopen van tau en worden gebruikt voor detectie van pathologische tau in neuronen of hersenweefsel. Fosforylering evenementen kunnen plaatsvinden op ten minste 20 locaties doelwit van-proline gerichte kinases, de meeste van hen in de buurt binnen de Proline-rijke regio. De kwalitatieve (welke sites?) En kwantitatieve (wat stoichiometrie?) Karakterisering is moeilijk, zelfs door de meest recente MS-technieken 5.
NMR-spectroscopie kan worden gebruikt om ontvouwen eiwitten die sterk dynamische systemen samengesteld uit ensembles conformeren zijn onderzoeken. Hoge-resolutie NMR-spectroscopie was toepased zowel structuur en functie van het tau-eiwit te onderzoeken. Bovendien, de complexiteit van Tau fosforylering profiel geleid tot de ontwikkeling van moleculaire technieken en nieuwe analysemethoden via NMR voor het identificeren van fosforylatieplaatsen 6-8. NMR als een analytische methode het identificeren van tau fosforylatieplaatsen op algemene wijze, visualisatie van de single-site modificaties in één experiment en kwantificering van de mate van Fosfaatopname. Dit punt is van essentieel belang, omdat hoewel fosforylering studies op Tau in overvloed in de literatuur, de meeste van hen zijn uitgevoerd met antilichamen, waardoor een grote mate van onzekerheid over de volledige profiel van fosforylering en daarmee de werkelijke impact van individuele fosforylering gebeurtenissen. Recombinant kinasen waaronder PKA, glycogeen-synthase kinase 3β (GSK3ß), Cycline-afhankelijke kinase 2 / cycline A (CDK2 / CycA), Cycline-afhankelijke kinase 5 (CDK5) / p25 activator eiwitten, extracellulaire signaalgereguleerde kinase 2 (ERK2) en microtubule-affiniteit-regulerende kinase (MARK), waarbij fosforylatie activiteit ten opzichte Tau vertonen, kunnen worden bereid in een actieve vorm. Bovendien worden Tau mutanten die het mogelijk maken de gerichte Tau proteïne isovormen met goed gekarakteriseerde fosforylering patronen die de fosforylering van Tau code ontcijferen. NMR spectroscopie wordt vervolgens gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters 6 karakteriseren - 8. Hoewel in vitro fosforylering van Tau is moeilijker dan pseudo-fosforylatie zoals door mutatie van geselecteerde Ser / Thr in glutaminezuur (Glu) residuen, deze aanpak heeft zijn voordelen. Inderdaad, noch de structurele gevolgen noch wisselwerkingsparametingen van fosforylatie altijd worden nagebootst door glutaminezuur. Een voorbeeld is de turn motief waargenomen rond 202 fosfoserine (pSer202) / fosfothreonine 205 (pThr205), die niet is weergegeven door Glu mutaties 9.
in vitro fosforylering door recombinant ERK2 kinase wordt gepresenteerd. ERK2 wordt geactiveerd door fosforylering door mitogeen geactiveerde proteïne kinase / ERK kinase (MEK) 10-12. Naast de bereiding van gemodificeerde, isotopisch gemerkte Tau-eiwit, is de NMR strategie voor de identificatie van de PTMs beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Productie van 15 N, 13 C-Tau (figuur 1)
- Transformeer pET15b-Tau recombinant T7 expressieplasmide 13,14 in BL21 (DE3) competent Escherichia coli bacteriële cellen 15.
Opmerking: het cDNA dat codeert voor de langste (441 aminozuurresiduen) Tau isovorm gekloneerd tussen Ncol en Xhol restrictieplaatsen in het plasmide pET15b.- Meng voorzichtig 50 pl competente BL21 (DE3) cellen, vormen 1-5 x 10 7 koloniën per ug plasmide DNA met 100 ng plasmide DNA in een 1,5 ml plastic buis.
LET OP: Codon-gebruik geoptimaliseerd bacteriestammen voor eukaryotische cDNA expressie niet essentieel zijn voor het menselijk Tau te produceren. - Plaats het celmengsel op ijs gedurende 30 min en vervolgens heat shock gedurende 10 seconden bij 42 ° C. Plaats de buis opnieuw op ijs gedurende 5 min en voeg 1 ml kamertemperatuur LB (Luria-Bertani) medium. Incubeer de bacteriële suspensie bij 37 ° C gedurende 30 minuten onder voorzichtigagitatie.
- Meng voorzichtig 50 pl competente BL21 (DE3) cellen, vormen 1-5 x 10 7 koloniën per ug plasmide DNA met 100 ng plasmide DNA in een 1,5 ml plastic buis.
- Verspreid met een entoog 100 gl celsuspensie gelijkmatig op een agarplaat van LB-medium met 100 ug / ml ampicilline antibioticum.
- Incubeer de selectieplaat 15 uur bij 37 ° C.
- Houd de selectieplaat bij 4 ° C tot verder gaat met de kweekstap, gedurende maximaal 2 weken ongeveer.
OPMERKING: een glycerol stock van bacteriecultuur (50% glycerol), bewaard bij -80 ° C, kan worden bereid aan de kweek op een later stadium. - Voeg 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamine complement, 1 ml 100 mg / ml ampicilline tot 1 liter autoclaaf M9 zouten (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2PO 4 , 0,5 g NaCl).
OPMERKING: Een wit precipitaat wordt bij toevoeging van CaCl2 oplossing van de M9 zouten die snel verdwijnt vormen. - Oplosbaar 300 mg 15 N, C-13 compleet medium, 1 g 15NH4Cl en 2 g 13 C 6-glucose in 10 ml van M9 medium. Filter-steriliseren van de isotoop oplossing met behulp van een 0,2 pm filter, direct in het M9 medium.
- Schorsen met een entoog een kolonie van pET15b-Tau getransformeerde bacteriën uit de selectieplaat in 20 ml LB medium aangevuld met 100 ug / ml ampicilline.
- Incubeer het geënte medium bij 37 ° C gedurende 6 uur.
- Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) aan 1 ml van een tienvoudige verdunning bacteriekweek in een plastic cuvet spectrometer.
Opmerking: Troebelheid van de bacteriecultuur overeenkomt met OD600 van 3,0-4,0 aangeeft dat verzadiging groeifase bereikt. - Voeg 20 ml van de verzadigde LB cultuur 1 liter M9 kweekmedium gesupplementeerd met ampicilline (100 ug / ml eindconcentratie), in 2 L Erlenmeyer kolf plastic war.
- Plaats de kolf in een programmeerbare incubator ingesteld op 10 °C en 50 rpm. Programmeer de incubator vroeg schakelen naar 200 rpm en 37 ° C in de ochtend van de volgende dag.
- Meten OD 600 op 1 ml bacteriekweek in een plastic cuvet spectrometer. Voeg 400 ul van 1 M IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside 1) voorraadoplossing (bewaard bij -20 ° C) bij OD 600 bereikt een waarde van ongeveer 1,0 voor de expressie van recombinant tau-eiwit te induceren.
- Verdere incubatie bij 37 ° C gedurende nog eens 3 uur. Verzamelen van de bacteriecellen door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 20 min.
- Bevries de bacteriële pellet bij -20 ° C. Blijf ingevroren tot zuivering, gedurende langere tijd indien nodig.
2. Zuivering van 15 N, 13 C-Tau (figuur 2)
- Autoclaaf kation-uitwisseling (CEX) zuivering buffers bij 121 ° C onder 15 psi gedurende 20 min. Buffers opslag bij 4 ° C.
- Ontdooi de bacteriële cel pellet en resuspendeer in 45 ml grondigopvraging CEX A buffer (50 mM NaPi pH 6,5, 1 mM EDTA) aangevuld met vers proteaseremmer cocktail 1x (1 tablet) en DNAsel (2000 eenheden).
- Breek de bacteriële cellen met een hoge druk homogenisator bij 20.000 psi. 3-4 passes nodig. Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 40 minuten om onoplosbare materialen te verwijderen.
- Verwarm de bacteriële cel extract gedurende 15 minuten bij 75 ° C met een waterbad.
OPMERKING: een witte neerslag wordt waargenomen na een paar minuten. - Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 20 min en houden de supernatant die de warmtestabiele tau-eiwit.
- Bewaar bij -20 ° C tot de volgende zuiveringsstap indien nodig.
- Voer een kation-uitwisselingschromatografie op een sterke CEX harsrijke als 5 ml bed kolom met een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) (zie figuur 3A).
- Stel debiet tot 2,5 ml / min.
- Equilibreren de kolom in CEX A buffer
- Laad de 60-70 ml heated-extraheren met behulp van een monster Tau pomp, of als alternatief pomp A, afhankelijk van het systeem. Verzamel het doorstroomkanaal voor analyse te controleren of Tau-eiwit efficiënt binden aan de hars (zie 2.8).
- Was de hars met CEX een buffer totdat de absorptie bij 280 nm weer de uitgangswaarden.
- Elueer Tau uit de kolom met een drie-stappen NaCl gradiënt verkregen door een geleidelijke verhoging van CEX B buffer (CEX Een buffer met 1 M NaCl). Programmeer de FPLC als volgt: de eerste stap van de gradiënt tot 25% CEX B buffer in 10 kolomvolumes (CV) met 250 mM NaCl, vervolgens moeten 50% CEX B buffer binnen 5 CV bereikt 500 mM NaCl, en derde stap tot 100% CEX B buffer in 2 CV te bereiken 1 M NaCl. 1,5 ml fracties te verzamelen in de elutiestappen.
- Analyseren 10 ul van de tijdens de elutiestap door SDS-PAGE (12% acrylamide SDS-gel) en Coomassie kleuring (Figuur 3 A) 16 fracties verzameld. Controleer de belasting stap op de column ook door analyzing 10 ul van het doorstroomkanaal.
- Kies de fracties die Tau en bundelen deze fracties voor de volgende stap.
- Voer een buffer uitwisseling over Tau-bevattende samengevoegde fracties (Figuur 3 B).
- Equilibreren een ontzoutingskolom van 53 ml G25 hars gepakt bed (26 x 10 cm) in 50 mM ammoniumbicarbonaat (vluchtige buffer) met een FPLC systeem.
- Set debiet tot 5 ml / min. Injecteer de Tau monster op de kolom via een 5 ml injectie lus. Verzamel fracties overeenkomend met de absorptiepiek bij 280 nm.
- Herhaal de injectie 3-4 keer, afhankelijk van het volume van de oorspronkelijke CEX zwembad.
- Bereken de hoeveelheid gezuiverd tau-eiwit door het piekoppervlak van het chromatogram bij 280 nm (1 mg Tau komt overeen met 140 ml mAU *).
OPMERKING: De extinctiecoëfficiënt van Tau-eiwit bij 280 nm M -1 7550 cm -1. Tau geen Trp residuen bevatten. - Pool alle Tau fracties.
- Aliquot het monster in buisjes die het equivalent van 1 tot 5 mg Tau. Kies deze buizen zodat het volume van de oplossing klein is vergeleken met het volume van de buis (bijvoorbeeld 5 ml oplossing in een 50 ml buisje).
- Punch gaten in de buis caps met behulp van een naald. Freeze Tau monsters bij -80 ° C.
- Lyophilize Tau monsters. Gelyofiliseerde Tau eiwit bij -20 ° C gedurende langere tijd worden bewaard.
3. In vitro fosforylering van 15 N-Tau
- Los 5 mg gelyofiliseerd Tau in 500 gl fosforylering buffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
- Voeg 2,5 mM ATP (25 gl 100 mM voorraadoplossing bewaard bij -20 ° C), 1 mM DTT (1 ui 1 M voorraadoplossing bewaard bij -20 ° C), 1 mM EGTA (2 pi van een 0,5 M voorraad oplossing), 1x proteaseremmer cocktail (25 pl van een 40x voorraad verkregen door het oplossen 1 tablet in 1 ml buffer fosforylering) en 181; M geactiveerd His-ERK2 (250 pl in instandhoudingsbuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl en 10% glycerol, bewaard bij -80 ° C) in een totaal monstervolume van 1 ml.
OPMERKING: De geactiveerde His-ERK2 kunnen interne 5,8 worden bereid door fosforylering van MEK-kinase. - Incubeer 3 uur bij 37 ° C.
- Verwarm het monster bij 75 ° C gedurende 15 min ERK kinase inactiveren.
- Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 15 min. Verzamelen en te bewaren supernatant.
- Ontzouten het eiwit monster in 50 mM ammonium bicarbonaat toepassing van een kolom van 3,45 ml G25 hars gepakt bed (1,3 x 2,6 cm), die geschikt is voor een 1 ml monster.
- Voer een 12% SDS-PAGE 16 met 2,5 pi van het eiwit monster zowel de integriteit en efficiënte fosforylering (figuur 4) controleren.
- Lyofiliseren de gefosforyleerd tau monster. Bewaar het poeder bij -20 ° C.
4. Overname van NMR Spectra (Figuur 5)
- Oplosbaar 4 mg gevriesdroogd 15 N, 13 C-ERK-gefosforyleerd tau in 400 gl NMR buffer (50 mM NaPi of 50 mM Tris gedeutereerd d11 .CL, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA en 1 mM DTT).
- Voeg 5% D 2 O gebied vergrendeling van de NMR-spectrometer en 1 mM TMSP (3- (trimethylsilyl) propionzuur-2,2,3,3-d4-natriumzout)) als interne referentie NMR signaal. Voeg 10 ul van 40x voorraadoplossing van volledige proteaseremmer cocktail.
- Breng het monster in een 5 mm NMR-buis met een elektronische spuit met een lange naald of Pasteur pipet. Sluit de NMR-buis met de zuiger. Verwijder eventuele luchtbel gevangen tussen zuiger en vloeistof door de zuiger bewegingen.
- Plaats de NMR-buis in een spinner. Pas de verticale positie in de spinner met de juiste dikte van de NMR meetkop gebruikt, zodat de meeste van de monsteroplossing wordt in de NMR-spoel.
- Start de luchtstroom: klik lift in het systeem venster magneet controle. Plaats het spinner met de buis in de luchtstroom aan de bovenkant van de magneet boring. Stop de luchtstroom (klik lift) en laat de buis in plaats binnen de sonde hoofd in de magneet dalen.
- Ingestelde temperatuur tot 25 ° C (298 K).
- Voer semi-automatische afstemming en aanpassing van de sonde hoofd tot overbrenging van het vermogen te optimaliseren. Typ atmm op de opdrachtregel.
- Zet de spectrometer frequentie met behulp van de D 2 O-signaal van het opgenomen op de deuterium kanaal monster. Klik sluis in het systeem venster magneet controle.
- Start de shimming procedure homogeniteit van het magneetveld geoptimaliseerd ter plaatse van het monster. Typ topshim gui op de opdrachtregel om de shim venster te openen. Klik op Start in de shim venster. Controleer de resterende B0 standaard variatie waarde om te controleren of shims optimaal zijn (minder dan 2 Hz is goed).
- Kalibreer de p1 parameter (lengte van een protonradiofrequentiepuls in psec), die nodig zijn om een 90 ° rotatie van proton spins verkrijgen. Doel voor de 360 ° puls met behulp van een 1D spectrum van water protonen (Figuur 6).
- Stel de frequentieverspringing door de o1 parameter (in Hz) het proton waterfrequentie in de 1D spectrum (figuur 6).
- Start acquisitie van een 1D proton spectrum (pulssequentie met Watergate sequentie voor water signaal onderdrukking, bijvoorbeeld zggpw5) om signalen uit de steekproef (Figuur 7) te controleren. Pas het aantal scans de relatieve eiwitconcentratie. Typ zg op de opdrachtregel om de overname te starten.
- Opgezet extra parameters voor de aankoop van een 2D [1 H, 15 N] HSQC spectrum (pulssequentie hsqcetfpf3gpsi figuren 8-9).
- Voor een 15 N, 13 C gelabelde monster, los te koppelen 13 C gedurende de 15N indirecte evolutie.
OPMERKING: Pas het aantal verkrijging gegevenspunten het veld spectrometer evenveel Hz per punt houden en te beperken ontkoppeling tijden: Gebruik 3072 punten 900 MHz en 2048 punten op 600 MHz, in het 1 H-maat. - Optimaliseer extra parameters in de pulssequenties, die overeenkomen met vertragingen, pols lengtes, offset frequenties, vermogensniveaus. Type ased op de opdrachtregel om alle parameters die relevant zijn voor het experiment te geven.
5. Identificatie van fosforylatieplaatsen
- Proces spectra met behulp van het verzamelen en verwerken NMR software.
- Uitvoeren van een Fourier transformatie van de gegevens (figuur 7). Type ft voor een 1D spectrum, XFB voor een 2D-spectrum of ft3d voor een 3D-spectrum, op de opdrachtregel.
- Fase en vindplaats alle spectra (figuur 7C) met de interactieve ramen.
- Identificeer resonanties plaats in de 2D HSQC mogelijk overeenkomen met gefosforyleerd Ser en Thr residuen (Figuur 9, red box).
- Extract vliegtuigen (dwz 2D 1 H- 13C spectra) van3D 1 H- 15 N- 13C spectrum met de 15 N chemische verschuivingen resonanties plaats in het 2D. Gebruik de cursor dimensie 2 (w2) aan de 15 N frequentie overeenkomt met het vlak (w1-w3) zichtbaar worden gemaakt (Figuur 10B) te kiezen.
- Pluk de resonantie frequenties van 'CA' en 'CB' 13C kernen van de 'i' en 'I-1 "residuen (zwakkere set van signalen in vergelijking met die van de i residu) voor elke [1 H, 15 N] resonantie van belang in de HNCACB 3D-spectrum door te klikken op de resonantie, in de pointer mode menu vinden / toevoegen piek, de chemische verschuiving waarde toe te voegen in een piek lijst met bestanden.
- Identificeer het type i residu pSer of PTHR door vergelijking van de chemische verschuivingen in de piek lijst waarden van CA en CB chemische verschuivingen van pSer en PTHR 17.
- Identificeer de aanwezigheid van een Pro-residu op de positie i + 1 door een karakteristiek bijkomend 2 ppm verschuiving of de CA chemische verschuiving waarde 18.
- Vergelijk de chemische verschuivingswaarden van de CA en CB resonanties die overeenkomen met de i-1 residu tot een lijst van chemische verschuivingen voorspeld Tau aminozuurresiduen 19 de aard van het residu identificeren de i-1 positie.
- Pluk de resonantie frequenties van 15 N kernen van de 'i' en 'I-1 "residuen voor elke [1 H, 15 N] resonantie van belang in de HNCANNH spectrum.
- Vergelijk de 15 N chemische verschuivingswaarden de chemische verschuiving toewijzing van het tau-eiwit 20-23.
- Vergelijk de geïdentificeerde dipeptiden met Tau sequentie met de sequentie specifieke opdracht vast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3A toont een grote absorptiepiek bij 280 nm waargenomen tijdens de elutiegradiënt. Deze piek komt overeen met gezuiverd tau-eiwit zoals te zien op de acrylamidegel boven het chromatogram. Figuur 3B toont een goed gescheiden absorptiepiek bij 280 nm en piek geleidbaarheid, zodat ontzouten van het eiwit efficiënt. Figuur 4 toont eiwit gel-shift waargenomen met SDS-PAGE-analyse 16 kenmerkend meerdere proteïne fosforylatie (vergelijk lanen 2 en 3). Figuur 6 toont een reeks proton (1H) 1D spectra met toenemende pulslengten (in psec). Het instellen van de lengte van de puls die 1H rotatie magnetisatie roteert met 90 °, een puls overeenkomt met een 360 ° rotatie wordt toegepast in de praktijk, omdat het gemakkelijker te kalibreren door het minimaliseren van het signaal. Het signaal van water protonen is null wanneer de 360 ° puls lengte voldoende is gedefinieerd. De waarde die overeenkomt met een 36076; rotatie wordt gedeeld door 4. p1 in dit experiment is 10,5 psec. Vergrote regio: De frequentie van het residusignaal wordt gebruikt om de parameter o1p (frequentieverspringing voor 1 H) definiëren. Figuur 7 A. toont een vrije inductie verval (FID), zichtbaar gemaakt om ervoor te zorgen dat een NMR-signaal wordt gedetecteerd. Figuur 7B. 1D toont een 1H spectrum met een onjuiste fase, zoals gezien door resonanties verschijnen asymmetrische pieken. Figuur 7C toont een 1D 1H spectrum met een goede signaal-ruisverhouding, wat aangeeft dat de verwerving fundamentele parameters correct zijn ingesteld en een signaal van het eiwitmonster kan worden gedetecteerd. Figuur 8 toont 2D 1H, 15N HSQC spectra van recombinant 15 N-Tau bij 900 MHz; Figuur 8A met een goede gevoeligheid en resolutie en figuur 8B. met detectie van proteolyse in het monster, zoals gezien door de verschijning van extra peaks in het spectrum (blauwe doos). Figuur 9 toont 2D 1H, 15N HSQC spectra van recombinant 15 N-Tau figuur 9A bij 600 MHz met goede gevoeligheid maar een lagere resolutie in vergelijking met Figuur 8A. Figuur 9B bij 600 MHz, toont het uiterlijk van extra pieken in het spectrum dat overeenkomt met gefosforyleerde residuen (rood kader). Figuur 9C bij 900 MHz, toont pieken in het spectrum dat overeenkomt met gefosforyleerde residuen (rood kader). Resolutie beter dan in figuur 9B. Figuur 10 A toont projecties van de 3D NMR spectrum gebruikt om een succesvolle experiment evalueren. Figuur 10B toont een 1 H- 13 C vliegtuig uit het 1 H- 15 N- 13 C 3D spectrum met goede signaalintensiteit waarmee tot 13 C signalen van beide i en i-1 residuen detecteren.
Figuur 1: Schema van de belangrijkste stappen van de productie van recombinant eiwit en isotopische labeling. Stappen van bacteriën transformatie naar productie van recombinante eiwitten worden beschreven, zoals beschreven in paragraaf 1 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van de belangrijkste stappen van recombinant tau-eiwit zuivering. Een steenworp afstand van bacteriële cellen lysis om recombinant eiwit zuivering worden geschetst zoals beschreven in paragraaf 2 van het protocol. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.
Figuur 3: Vloeistofchromatografie stappen van het protocol. (A) Kationuitwisselingschromatografie fractionering van de verwarmde bacterie-extract. De absorptie bij 280 nm, 260 nm en het geleidingsvermogen corresponderen respectievelijk solide en onderbroken lijnen zwarte en rode stippellijn. 12% SDS-PAGE-analyse van de verzamelde fracties wordt boven het chromatogram getoond. (B) Ontzouten van het tau-eiwit in een buffer geschikt voor vriesdrogen. De hoeveelheid gezuiverd tau-eiwit op basis van de oppervlakte (2260 mAU * ml) is 16 mg van Tau. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: 12% SDS-PAGE analyse van Tau. Laan 1, molecuulgewicht merker; baan 2, 10 ug Tau; laan 3, 10 ug ERK-gefosforyleerd tau. Tau als andere IDP loopt abnormaal werken op SDS-PAGE, op een schijnbaar molecuulgewicht van ongeveer 60 kDa in plaats van de verwachte 46 kDa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schema van de belangrijkste stappen voor NMR monsterbereiding, NMR-spectroscopie data-acquisitie en dataverwerking. Een steenworp afstand van NMR monstervoorbereiding tot en verwerken van gegevens worden beschreven, zoals beschreven in paragraaf 4 van het protocol. Klik hier om een grotere versio bekijkenn van deze figuur.
Figuur 6: Set-up van de p1 parameter voor NMR-data-acquisitie. Deze parameter verschilt tussen de samples en is voornamelijk afhankelijk van de zoutconcentratie. Een standaard 1 H nutatie curve voor 80% H 2 O in D 2 O wordt getoond. Single-scan spectra met een recycle vertraging van 30 seconden werden verzameld en uitgezet horizontaal. De puls (p1) werd gevarieerd van 1 usec tot 55 usec in stappen van 1 psec. In theorie zou het signaal maximaal voor een 90 ° puls en op nul voor een 180 ° puls. In de praktijk straling demping veroorzaakt asymmetrie en fasevervorming problemen die het moeilijk maken om de 90 ° en 180 ° pulsen rechtstreeks bepalen. De tweede nulpunt komt overeen met een 360 ° puls duur. Het vergroot gebied toont een resterende signaal voor een 360 ° puls die wordt gebruikt om de parameter o1p frequentie definiëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: NMR gegevensverwerking. (A) Gratis inductie signaal verval in de tijd domein. 1D proton spectra (B) als gevolg van Fourier-transformatie van de FID uit paneel A in het frequentie-domein, maar met onjuiste fase (PHC0 -206 °). (C) gefaseerde (PHC0 -113 °) en waarnaar wordt verwezen (TMSP signaal bij 0 ppm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
"/>
Figuur 8: 2D 1H, 15N HSQC spectra van recombinant 15 N-Tau op 900 MHz. 3072 en 416 verkrijgen gegevenspunten zijn opgenomen met spectrale breedtes van 14 en 25 ppm in het 1H (F2) en 15 N (F1) afmetingen, respectievelijk. 16 scans werden opgenomen per increment F1, waardoor de duur van het experiment van 4 uur 30 min. (A) Tau goede kwaliteit monster (B) Tau monster afbraak toont zoals blijkt uit het optreden van bijkomende resonanties in een bepaalde regio van het spectrum (hoogkouter 1 H, lage gebied 15 N), hier ingesloten blauw. Dit laatste monster werd bereid zonder proteaseremmers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: 2D 1H, 15N HSQC spectra van recombinant 15 N-Tau. (A) gefosforyleerd Tau, 600 MHz spectrum (B) gefosforyleerd Tau, 600 MHz spectrum en (C) gefosforyleerd Tau, 900 MHz spectrum. Aanvullende resonanties in een bepaalde regio van het spectrum, hier ingesloten rood, waargenomen in gefosforyleerde Tau spectra. De resonanties, die overeenkomen met proton amide (1 H- 15 N) correlaties van pSer en PTHR residuen gemakkelijk gevisualiseerd in de regio rond 8,5-9,5 ppm voor 1H en 117-125 ppm voor 15 N, buiten het grootste deel van de 1 H, 15 N correlaties van de gefosforyleerde Tau spectrum. (A en B) corresponderen met spectra verkregen bij 600 MHz, 2048 en 256 gegevenspunten op spectrale breedtes van 14 en 25 ppm werden in de 1 H (F2) en 15 N (F1) afmetingen, respectievelijk.32 scans werden gebruikt, en de totale duur van de overname bedroeg 2 uur 44 min en (C) bij 900 MHz, 3072 en 416 gegevenspunten op spectrale breedtes van 14 en 25 ppm werden in de 1 H (F2) en 15 N ( F1) afmetingen, respectievelijk. 48 scans werden gebruikt, en de totale duur van de overname bedroeg 6 uur 37 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: 3D 1H, 15N, 13C NMR spectrum projecties en geëxtraheerd 2D vlakken. 2048, 72, 256 en gegevenspunten werden in de 1 H (F3), 15 N (F2) en 13 C (F1) afmetingen, respectievelijk. Spectrale breedtes 14, 25 en 61 ppm, gecentreerd op 4,7, 119 en 41 ppm in het 1H,15 N en 13 C afmetingen resp. Duur van de overname het gebruik van 16 scans is 4 dagen en 6 uur. (A) Cube weergave overeenkomt met de Fourier getransformeerde 3D dataset van een HNCACB spectrum van ERK-gefosforyleerd Tau verkregen bij 600 MHz. De 2D 1H, 15N en de 1 H, 13 C zijn vlakken verkregen door projectie van het 3D data langs de 13 C en 15 N afmeting resp. Gegevensverwerking en vertegenwoordiging werden gedaan met behulp van NMR en verwerken van software. (B) 2D 1H, 13C vliegtuig uit het 3D 1H, 15N, 13C NMR dataset een 15 N chemische verschuiving van 121,8 ppm. Een zoom (rechts) gecentreerd op het 1H-chemische verschuiving van 9,38 ppm 13 toont de CA en CB 13 resonanties van beide residuen i (pThr153) en i-1 (Ala152). De 13 CB resonantie is vanwege een alias naar de breedte van de spectral venster. Grafische weergave en piek picking werden uitgevoerd met NMR-analyse software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben NMR spectroscopie gebruikt om enzymatisch gemodificeerde Tau monsters te karakteriseren. De recombinante expressie en zuivering hier beschreven voor de volledige lengte humaan tau-eiwit kan eveneens worden gebruikt om mutant tau of tau domeinen produceren. Isotopisch verrijkte eiwit is nodig voor NMR-spectroscopie, noodzakelijk recombinante expressie. Identificatie van fosforylatieplaatsen vereist resonantie opdracht en een 15 N, 13 C dubbel gemerkt eiwit. Gezien de kosten van isotopen wordt een goede opbrengst vereist in de recombinante expressie stap. Glucose is de beperkende factor voor de groei van bacteriën in het M9 medium zodat de hoeveelheid 13C-glucose 6 kan worden verhoogd tot 4 g per liter groeimedium om de opbrengst te verbeteren. Toevoeging van compleet medium en MEM vitaminen zijn niet verplicht, maar helpen om de groei te stimuleren en het rendement te verbeteren. Gezien de hoge kosten van een totale gemerkte medium, wordt dit product slechts als groeimedium vullendet. Bacteriële groei is langzaam in M9-medium. In het algemeen, bacterieculturen gebruikt M9 medium aangevuld met 3% compleet medium bereik inductiefase na ongeveer 4 uur incubatie. Een OD600 van 1,6-1,8 wordt gewoonlijk verkregen aan het einde van de kweek. Verwachte opbrengst van recombinant tau-eiwit is ongeveer 15 mg per liter bacteriekweek. Het gebruik van een programmeerbare incubator mogelijk maakt om gemakkelijk plannen eiwitproductie collectie van de bacteriële pellet en analytische controle van eiwitproductie gedurende werkdag uur.
Monsterconcentratie is belangrijk om een goede kwaliteit spectrum te verkrijgen. Een typische Tau monster voldoende voor een 2D spectrum zou 1 mg in 200 pl (bijvoorbeeld 100 uM) Tau-eiwit. Een 3D spectrum worden ten minste 200 pM in 300 pi zijn, op voorwaarde dat een cryogene meetkop wordt gebruikt. Toegang tot een hoogveld spectrometer, zoals de 900 MHz instrument in deze studie betere signaal-ruisen verminderen beperkingen op monsterconcentratie (Figuur 8). Gezien het feit dat Tau is een grote ongeordende eiwit, zijn de NMR-spectra gekenmerkt door grote signaal overlap, en een high-field NMR spectrometer zal ook de beste keuze in termen van resolutie (figuur 8) zijn. Toch is de resonanties overeenkomende met fosforylatieplaatsen zijn in een afzonderlijk gebied van het spectrum en zijn eenvoudig te detecteren zelfs met een 600 MHz spectrometer (Vergelijk figuren 9 B en 9C). Bovendien, vanwege de ongeordende aard, het tau-eiwit is gevoelig voor proteolyse (figuur 8B).
Sterilisatie van buffers wordt geadviseerd om Tau degradatie te beperken. Toevoeging van proteaseremmers op de NMR monster Tau helpt beschermen tegen afbraak tijdens perioden data acquisitie die kan variëren van uren tot dagen, afhankelijk van de pulssequentie. Lage pH (bijvoorbeeld pH beneden 7,0) moet avoid te snel wisselen tussen eiwit protonen en water protonen, wat leidt tot verbreding signaleren. Monster pH moet ook goed worden gecontroleerd om de reproduceerbaarheid van de spectra te waarborgen. Inderdaad, aangezien pKa waarden van pSer en PTHR dicht bij de optimale pH voor NMR-spectroscopie, chemische verschuivingen van gefosforyleerde monster zeer gevoelig voor schommelingen in de pH. Instelling van de pH van de NMR monster kan direct worden uitgevoerd met een pH-meter een pH micro-elektrode, ingericht voor kleine volumes. Tau is een oplosbaar eiwit en niet aggregeert in standaardomstandigheden. Toevoeging van polyanionen zoals heparine sulfaat, en incubatie bij 37 ° C kan aggregatie initiëren Tau monsters. In dit geval, aangezien de vaste aard van de aggregaten meeste resonanties in de overeenkomstige NMR spectrum te verbreden voorbij detectie. Zelfs de gefosforyleerde tau stalen geen aggregaat in het hier beschreven NMR data acquisitie condities.
Vergeleken met antilichaam analyse NMR levert een overall uitzicht op PTMs. Massaspectrometrie kan ook worden gebruikt om de fosforylering patroon van een eiwit monster te identificeren. Isotopische labeling is niet nodig voor deze techniek, en vereist monsterhoeveelheden veel kleiner. Echter, karakterisatie van een eiwit met meerdere fosforyleringen, zoals Tau, blijft een uitdaging. Aangrenzende fosforyleringen zal isobarisch peptiden in bottom-up strategieën van identificatie. Volledige identificatie moet dan MS / MS-sequentiebepaling van de peptiden verkregen door het monster proteolyse. Een voordeel van NMR bestaat uit de intrinsieke kwantitatieve aard van de techniek. De intensiteit van een NMR signaal kan worden gekoppeld aan de hoeveelheid van de aanwezige chemische groep op een specifieke plaats. Zo kunnen we de hoeveelheid chemische modificatie op elke plaats definiëren. Meest recente vooruitgang in MS-toepassingen hebben echter aangetoond dat MS analyse van Tau meerdere fosforylering haalbaar is 24, zelfs in een kwantitatieve manier na een goede normalisatie 25.
Hier presenteerden wij Tau fosforylatie door geactiveerde ERK2, maar de methode kan worden gebruikt voor fosforylering met andere kinasen en 6,7,26 - 28. Kinetische experimenten kunnen worden uitgevoerd, die kunnen helpen om kinase specificiteit definiëren in de richting van een eiwit substraat 28-31. Fosforylering studies zijn niet beperkt tot recombinante kinasen en kinaseactiviteit van cellen of weefsel extracten worden geanalyseerd 6,32,28. Een interessante ontwikkeling is het gebruik van in-cel NMR studie in situ modificaties 33,34. Omgekeerd NMR is ook goed aangepast aan specificiteit fosfatase pakken, zoals werd aangetoond door bestudering van de defosforylering van gefosforyleerde Tau het PP2A fosfatase 35. NMR spectroscopie kan de kwalificatie van kinaseremmers worden toegepast door het vergelijken van het profiel fosforylering van het eiwit substraat in een 2D spectrum in aanwezigheid van de inhibitor verbinding with het spectrum afgegeven vanuit een controleproef 6.
Het belang van het gebruik van NMR spectroscopie, vergeleken met de meer gevoelige MS technieken, ligt in de meest uiteenlopende toepassingen benutten de hier beschreven en niet op de analytische dekt alleen protocol. Het heeft bewezen cruciaal fosforylatieplaatsen te identificeren kunnen specifieke fosforyleringen koppelen aan structurele of functionele veranderingen die hoofdzakelijk werden bestudeerd met NMR. NMR spectroscopie van gefosforyleerd Tau monsters mogelijk maakt de structurele invloed van fosforylatie zowel transiënte lokale secundaire structuren en globale herschikking van de dynamische ensemble van gemodificeerde Tau 36,37 verkennen. Functionele aspecten onder de regulering van beide interactie van Tau met eiwit partners 7,38,39 en aggregatie van Tau fosforylering 8. De gefosforyleerde Tau monster gekarakteriseerd door NMR kan verder worden gebruikt voor fosfo-afhankelijke interacties ontcijferen, voorvoorbeeld 14-3-3 eiwitten 40 en gemanipuleerd eiwit-eiwit interactie remmers 41,42. NMR laat definitie van interactie site (s) op het residugehalte, en de afhankelijkheid van deze interactie op fosforylatie. Bovendien NMR spectroscopie van gefosforyleerd tau is een belangrijke methode voor het karakteriseren proline cis: trans isomerase Pin1, een belangrijke fosfo-afhankelijke enzym betrokken bij regulering Tau 43-45. Bovendien kan fosforylatie analyse met NMR niet alleen worden toegepast op ontheemden maar ook voor globulaire eiwitten 46. Tenslotte kunnen andere soorten Tau PTMs zoals acetyleringen 22,40,41 bestudeerd met NMR. De hier beschreven protocollen zijn van cruciaal belang gebleken om beter inzicht in de functionele en structurele regulering van Tau in fysiologische en pathologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20 °C |
| BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80 °C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100x | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4 °C |
| 1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20 °C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4 °C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80 °C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
References
- Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
- Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
- Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
- Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
- Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
- Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
- Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
- Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
- Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
- Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
- Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
- Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
- Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
- Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
- Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
- Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
- Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
- Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
- Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
- Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
- Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
- Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
- Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
- Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
- Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
- Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
- Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
- Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
- Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
- Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
- Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
- Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
- Milroy, L. -G., Bartel, M., et al.
- Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
- Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
- Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
- Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
- Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
- Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).
