Introduction
Studio longitudinale del cuore nei piccoli animali contribuisce alla comprensione di una varietà di malattie cardiovascolari correlate umane, come ad esempio difetti cardiaci congeniti legati gene 1,2. Nei decenni passati, vari modelli animali, come ad esempio 3,4 mouse, Xenopus 5,6, 7,8 zebrafish, aviario 9, e Drosophila 10-16, sono stati utilizzati per condurre il cuore umano-sviluppo relativi ricerca. Il modello di topo è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco normale e anormale e fenotipi difetto cardiaco a causa della sua somiglianza con lo 3,4 cuore umano. L'embrione Xenopus è particolarmente utile nello studio di sviluppo del cuore per la sua maneggevolezza e trasparenza parziale 5,6. La trasparenza dell'embrione e larva precoce del modello zebrafish permette una facile l'osservazione ottica di 7,8 sviluppo cardiaco. Il modello di aviaria è un tema comune di studi di cuore di sviluppo because il cuore può essere facilmente accessibile dopo aver rimosso i gusci d'uovo e la somiglianza morfologica dei cuori aviaria per l'uomo 9. Il modello Drosophila ha alcune caratteristiche uniche che lo rendono ideale per l'esecuzione di studi longitudinali del cuore. In primo luogo, il tubo cuore di Drosophila è ~ 200 micron sotto la superficie dorsale, che fornisce la convenienza per l'accesso ottico e l'osservazione del cuore. Inoltre, molti meccanismi molecolari e percorsi genetici sono conservati tra Drosophila e vertebrati. I ortologhi di oltre il 75% dei geni delle malattie umane sono stati trovati in Drosophila, che hanno reso ampiamente usato negli studi di transgenici 11,13. Inoltre, si ha un breve ciclo di vita e bassi costi di manutenzione, ed è stato comunemente utilizzato come modello esemplare per la ricerca biologia dello sviluppo 14-16.
Studi precedenti hanno descritto i protocolli per il controllo delle funzioni cardiache Drosophila come l'haArtbeat. Tuttavia, le procedure di dissezione sono stati richiesti 17,18. L'imaging ottico fornisce un modo efficace per visualizzare sviluppo cardiaco negli animali a causa della sua natura non invasiva. Diverse modalità di imaging ottico sono stati applicati nello svolgimento di studio cardiaco animale, come microscopia a due fotoni 19, microscopia confocale 20,21, foglio di microscopia ottica 22, e tomografia a coerenza ottica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, OCT è in grado di fornire grande profondità di imaging in piccoli cuori animali senza utilizzare mezzi di contrasto, mantenendo un'alta risoluzione e una velocità di imaging altissima, che sono importanti per gli animali vivi di imaging. Inoltre, il basso costo di sviluppare un sistema PTOM gode popolare questa tecnica per imaging ottico di campioni. Ottobre è stato utilizzato con successo per lo studio longitudinale della Drosophila. Utilizzando Office, l'imaging cardiaco morfologica e funzionale, è stata eseguita per studiare le strutture del cuore, il funcruoli zionali di geni e dei meccanismi di difetti cardiovascolari nei modelli mutanti durante lo sviluppo cardiaco. Ad esempio, il declino della funzione cardiaca età-dipendente è stata confermata con l'enzima legati (ACER) gene down-regolato dell'enzima di conversione in Drosophila con 27 ott. Fenotipizzazione di cardiomiopatia correlata gene è stata dimostrata in Drosophila utilizzando ottobre 28-33. La ricerca che utilizza ottobre ha anche rivelato il ruolo funzionale del gene SOX5 umana nel cuore di Drosophila 34. Rispetto Office, OCM utilizza un obiettivo con un'apertura numerica più elevata prestazione migliore risoluzione trasversale. In passato, la disfunzione cardiaca causata da un silenziamento ortologo gene circadiano umano dCry / dClock è stato studiato utilizzando un sistema OCM personalizzata 15,16, così come l'effetto di alto contenuto di grassi-dieta su cardiomiopatie in Drosophila comprendere indotta obesità umana malattie cardiache. 15
Qui, thprotocollo sperimentale e viene riassunta per lo studio longitudinale dei cambiamenti morfologici e funzionali cardiaci in Drosophila in seconda instar (L2), terzo stadio (L3), giorno pupa 1 (PD1), giorno pupa 2 (PD2), pupa giorno 3 (PD3) , pupa giorno 4 (PD4), pupa giorno 5 (PD5) e adulti (Figura 1) utilizzando OCM per facilitare lo studio delle patologie cardiache congenite umane legate. parametri funzionali cardiaci, come risorse umane e CAP sono stati quantitativamente analizzati a diversi stadi di sviluppo per rivelare le caratteristiche di sviluppo cardiaci.
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Protocol
1. Preparazione di OCM sistema per l'imaging ottico di Drosophila 16
- Selezionare uno spettrometro e una fotocamera scansione linea ad alta velocità che offre un frame rate di almeno 80 frame / sec in modo che il sistema di OCM sarà in grado di risolvere il battito cardiaco di Drosophila.
- Utilizzare una sorgente di luce a banda larga per garantire la risoluzione assiale di 2 micron a identificare la struttura cuore di Drosophila.
- Utilizzare un obiettivo 10X per ottenere un'alta risoluzione trasversale.
- Utilizzare uno specchio 45 ° dell'asta per riflettere il fascio luminoso braccio di riferimento e per generare un fascio di luce braccio del campione anulare per estendere la profondità di fuoco nei campioni.
- Sviluppare un programma informatico personalizzato per controllare il sistema OCM e di eseguire misurazioni.
2. Cultura Drosophila
- Standard Fly Food Preparation
- Mettere ~ 5 ml istante formula Drosophila in una fiala di polistirolotubo con l'assistenza di un scivolo carta.
- Versare ~ 8 ml di acqua nella formula per saturare correttamente il cibo.
- Aggiungere integratori diversi per il cibo fly standard per diversi esperimenti. Quando si prepara per All -retinal (ATR) cibo trans per la stimolazione optogenetic esperimento 35, utilizzare una pipetta per estrarre 100 mM ATR e dissolversi in ~ 8 ml di acqua per ottenere la concentrazione ATR di 1 mm negli alimenti. Dopo la miscelazione la soluzione in modo uniforme, versare la soluzione nella formula e mescolate a sufficienza.
- Per preparare un alto contenuto di grassi-dieta per studiare all'obesità disfunzioni cardiache in Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formula con 15 ml di acqua in una tazza e calore per 30 secondi in un forno a microonde. Mettere un po 'di olio extra vergine di cocco in un altro tazza e riscaldare per 90 secondi nel forno a microonde.
- Estrarre 7,5 ml di olio di cocco e mescolare con la formula preparata sufficientemente per rendere il rapporto peso / volume di olio di cocco per alimentare ~ 30/100 e then estratto ~ 2 ml cibo mescolato e messo sul fondo di un tubo.
- Attendere per 1 minuto fino a quando il mezzo è completamente saturo. Compattare il cibo con cura con una superficie piana per ottimizzare le condizioni di vita della Drosophila. Aggiungere 6 - 8 grani di lievito alla formula preparata, e inserire il tubo con un gruppo di cotone.
- Mosca della frutta Croci e cultura
- Prendere un tubo con il cibo volare standard preparato, e rimuovere il cotone collegato. Trasferire accuratamente le mosche adulte (maschio e femmina) al tubo, e collegare il tubo con cotone immediatamente. Controllare il cotone per assicurarsi che non vi sia spazio tra il cotone e la parete del tubo per impedire linea di fuoriuscire dal tubo.
- Tenere le mosche di frutta in incubatore a 25 ° C per incroci. La maggior parte dei geni sono attivi e le proteine cellulari sono sintetizzati a 25 ° C 36-39.
- Prendete il tubo dalla incubatrice dopo 8 trasferimento mano undult vola fuori del tubo per ottenere le uova all'età simile per controllo sperimentale.
- Continuare coltivando le uova nel incubatore a 25 ° C, che è la temperatura standard per lo sviluppo Drosophila con il periodo di sviluppo di 8,5 giorni 40,41.
NOTA: La temperatura influisce il periodo di sviluppo (uovo ad adulto) e il livello di espressione di vari geni.
3. Esecuzione Imaging ottico con OCM
- Mount Fly Larva per l'imaging ottico
NOTA: L'uovo di portelli di Drosophila in 22 - 24 ore a 25 ° C al primo larva instar (L1). La seconda larva instar emerge dopo l'altro 24 ore. La più grande forma larvale è la terza larva instar, che mute dopo circa 24 ore. Caratteristiche strutturali in larve possono essere usati per distinguere i loro diversi stadi di sviluppo. La dimensione delle boccale tra primo stadio e il secondo instar è diversa. La boccaganci del primo larva instar sono molto piccole e sembrano due coppie di piccole macchie nere, mentre i ganci bocca del secondo larva instar sono più grandi e la struttura è chiara. Gli spiracoli sono di solito utilizzati per identificare il secondo e il terzo instar stadio. La seconda larva instar ha bastonato spiracoli anteriori, mentre, per il terzo stadio, i spiracoli anteriori sono ramificati. Un anello arancio scuro inizierà ad apparire sulla punta delle spiracoli posteriori della terza larva instar.- Applicare un pezzo di nastro biadesivo per un vetrino da microscopio pulito. Espellere le bolle d'aria sotto il nastro per evitare le riflessioni causate da bolle d'aria durante l'imaging.
- Prendete uno dei tubi con le mosche in coltura fuori dal termostato nella fase larvale.
- Identificare la larva nei media, rimuoverlo dal supporto con una spazzola morbida e posto su un panno pulito. Rimuovere qualsiasi cibo attaccato alla larva con una spazzola morbida umida e asciugare sul tessuto.
- Spostare il cleaned volare a un tessuto sotto la lente obiettivo di un ampio campo di microscopio.
- Regolare il fuoco del microscopio per trovare una visione chiara della mosca. Identificare il giusto stadio di sviluppo della larva per le sue caratteristiche strutturali con il microscopio.
- Posizionare il volo usando la spazzola morbida. Assicurarsi che il corpo è dritto con il lato dorsale rivolta verso l'alto per preparare per il montaggio sul vetrino dal lato dorsale. Eseguire questo passaggio sotto il microscopio.
- Assicurarsi che la larva è completamente asciutto prima di montare sul nastro. Altrimenti, la larva non aderisce al nastro.
- Attaccare il lato dorsale della mosca posizionata per il doppio nastro laterale sul vetrino con una pressione moderata. Si noti che la troppa pressione può uccidere la mosca e troppo poca forza porterà a volare il movimento durante l'imaging.
- Imaging ottico di Drosophila a stadi larvali (L2 e L3) con OCM
NOTA: Una vasta lume del tubo cuore può essere found situato nei segmenti tra A5 ad A8 nelle fasi larvali (Figura 1). Le immagini OCM M-mode trasversali (2D + tempo) sono stati acquisiti al segmento A7 del tubo cuore per ogni larva per facilitare la sistolica e diastolica analisi.- Posizionare la larva montato sulla fase del campione regolabile del sistema OCM lungo la direzione y trasverso con il lato dorsale verso l'alto sotto la lente obiettivo. Un piccolo foro nella fase del campione è necessaria per posizionare la larva per evitare il contatto con il piano fase.
- Regolare la fase del campione per spostare il tubo cuore del frutto mosca al piano focale del fascio di imaging. Per trovare facilmente il segmento A7, trovare la regione posteriore del tubo di cuore con la croce in tempo reale le immagini sezionali OCM nel software di acquisizione delle immagini. Quindi spostare il palco in avanti fino a quando il segmento A7 è visibile.
- Impostare i parametri del software di acquisizione immagini a 100 A-scan per B-scan (telaio), 100 B-scan, e il scannetensione r per coprire ~ 0,28 mm nella direzione x trasverso, e 0 V nella direzione y-trasversale. Fare clic sul pulsante "start" nel software per l'acquisizione dei dati sul rumore di fondo per la sottrazione del fondo, bloccando il percorso del fascio campione con un panno scuro.
NOTA: 3 100 telai possono essere utilizzati per la sottrazione del fondo. - Impostare parametri del software di acquisizione dati a 128 A-scan per B-scan, 4096 B-scan, e la tensione scanner per coprire ~ 0,28 millimetri nella direzione x trasverso, e 0 V nella direzione y-trasversale. Fare clic sul pulsante "start" nel software per l'acquisizione delle immagini M-mode trasversali in tutto il segmento A7 del tubo cuore volare su una regione che copre 0,28 x 0,57 millimetri 2 per circa 30 sec.
- Bloccare il fascio di imaging con un panno scuro durante il processo di salvataggio dei dati al fine di evitare l'esposizione prolungata del cuore volare verso la luce di imaging.
- Ripetere la misurazione per 5 volte per ottenere la misurazione affidabile del cuore divertimentoction.
- Impostare i parametri del software di acquisizione immagini a 400 A-scan per B-scan, 800 B-scan, e la tensione scanner per coprire ~ 1,7 millimetri nella direzione x trasverso, e ~ 4 mm in direzione y trasversale. Spostare lo stadio in entrambe le direzioni per garantire l'intero mosca della frutta può essere ripreso. Fare clic sul pulsante "start" nel software di acquisire una serie di dati per ottenere immagini della mosca della frutta in 3 dimensioni. Nota: la struttura mosca 3D può essere resa utilizzando il software Amira 3D
- Utilizzare una spazzola morbida bagnata per inumidire la mosca misurato e rimuovere delicatamente dal vetrino. Spostare in un tubo separato per lo sviluppo continuo. Etichettare la provetta per studio longitudinale attraverso le fasi successive di sviluppo.
- Immagine Drosophila nelle fasi di pupa
Nota: Tutti i moscerini della frutta sono stati portati fuori per l'imaging dal PD1 a PD5. Come mostrato nello schema larva in Figura 1b, un'ampia lumen rimane in A5 ad A8 segmenti di thTubo cuore e fino PD1. Da PD2, una camera conica inizia a svilupparsi tra A1 ai segmenti A4. Per acquisire immagini coerenti e facilitare l'analisi del cuore, immagini di modo M trasversali sono stati ottenuti dal segmento A7 a PD1 e dal segmento A1 dopo PD2, come indicato nella Figura 1b.- Immagine Drosophila a PD1
NOTA: Drosophila avrà un puparium bianco per una finestra temporale breve (0-1 ore) durante PD1. Questa finestra temporale è l'ideale per l'esecuzione di imaging ottico di pupa presto perché l'elevata trasparenza porta ad una maggiore penetrazione della luce per imaging OCM.- Come i moscerini della frutta si trovano sulla parete del tubo quando diventano pupa, rimuovere la pupa da singoli tubi per l'imaging a PD1 con una spazzola morbida bagnata, e pulire la pupa con la spazzola se c'è cibo bloccato al corpo.
- Montare la mosca della frutta su un piccolo vetrino direttamente con il pennello bagnato e mantenere il lato dorsale verso l'alto (Figura 1a
- Rimuovere l'acqua in eccesso dal lato del corpo mosca.
- Mettere il vetrino sul palco campione del dispositivo OCM, mantenendo la mosca della frutta in cima. Trova chiara immagine in tempo reale del segmento A7 del cuore mosca utilizzando la stessa strategia descritta nella misurazione larva.
- Impostare gli stessi parametri del software di acquisizione dei dati, come nella sezione 3.2, e l'immagine dei battiti cardiaci al segmento A7 di acquisire M-mode trasversale e immagini 3D.
- Dopo l'imaging, usare una pinzetta per posizionare il vetrino con pupa di nuovo nel tubo per la cultura in continuo.
- Immagine Drosophila a PD2 alle fasi PD5
NOTA: Poiché il campione diventa sempre più opaco durante le fasi pupa, la profondità di penetrazione del sistema di imaging sarà ridotto.- Utilizzare una pinzetta per rimuovere con attenzione il vetro slide montato con la mosca al PD2 dal tubo per l'imaging. Al PD2, il guscio campione diventa giallastra e il corpo diventa meno trasparente rispetto al PD1 (Figura 1).
- Mettere il vetrino sul palco campione del sistema di OCM.
- Regolare la fase del campione per spostare la mosca nel piano focale dell'imaging fascio del sistema OCM. Trova l'estremità anteriore del tubo cuore immagine OCM della sezione trasversale in tempo reale con. Spostare ~ 50 micron nella direzione posteriori per trovare il segmento A1 del tubo cuore.
NOTA: A questo punto dello sviluppo del cuore (PD2), la camera conica sarà molto piccolo e non può essere battuto. - Raccogliere trasversali set di dati M-mode dal segmento A1 nonché i dati 3D utilizzando lo stesso metodo di precedenti fasi di sviluppo.
- Mettere la slitta di nuovo al tubo con attenzione per la cultura in continuo.
NOTA: A PD3, il colore del campione nel guscio è più scura di quella alla PD2 fase. A PD4 fase, strisce nere can essere osservato all'interno del guscio dei campioni. Alcune mosche si svilupperà in adulti da questa fase del giorno successivo, mentre altri si evolveranno in PD5. A PD5 fase, strisce nere sono ancora più ovviamente visto nei moscerini della frutta. Queste mosche diventeranno adulti nel giorno seguente.
- Immagine Drosophila a PD1
- Immagine Drosophila allo stadio adulto
NOTA: Nella fase adulta, mosche femminili e maschili si distinguono per le dimensioni del corpo e il colore del basso addome. gli adulti di sesso femminile hanno dimensioni più grandi, mentre i maschi sono più piccoli e di colore scuro nel basso addome.- Prendete il tubo fuori dal termostato quando il moscerino della frutta si sviluppa in un adulto, e trasferire l'adulto volare ad una ~ 45 ml fiala vuota.
- Immergere l'estremità assorbente (~ 1 cm di lunghezza, ~ 3 mm di diametro) di una bacchetta in anestesia, mettere la bacchetta nella fiala, e inserire il tubo con un gruppo di cotone per mantenere fine anestetico appena sotto il cotone collegato e Anesthetize la mosca per 3 min. La durata dell'anestesia dipende dalla dimensione della mosca, e può variare da 2.5 a 3.5 min (per esempio: maschile per 2,5 min e femmina per 3 o 3,5 min).
- Preparare un vetrino con un pezzo di nastro biadesivo.
- Spostare la mosca anestetizzato sul vetrino con il lato dorsale verso l'alto utilizzando la spazzola morbida.
- Separare le ali con una pinzetta e bastone le ali sul nastro al microscopio per risolvere al volo ed esporre la regione del cuore per l'imaging.
- Immagine fly dal segmento A1 del cuore fly (Figura 1). Alla fine dell'esperimento, la mosca può essere sacrificato.
4. Imaging Analisi 16
- Sviluppare programmi MATLAB per convertire i file binari 2D e 3D raccolti con il software di acquisizione delle immagini in file di immagine.
- Utilizzare ImageJ per identificare la regione tubo cuore nelle immagini M-mode trasversali e un algoritmo di bacchetta magica per creatEA maschera della regione del cuore per ogni immagine M-mode trasversale. Segmento la regione mascherato e utilizzare un algoritmo di picco di accertamento per identificare le posizioni sistolica e diastolica. Calcolare il tempo cambia dipendenti diametro cuore dalle immagini M-mode trasversali.
- In base al tempo acquisito diametri cardiaci dipendenti, calcolare i parametri cardiaci, quali HR, periodo di attività cardiaca (PAC), fine diametro diastole (EDD), fine diametro sistole (ESD), fine zona diastole (EDA), e terminare zona sistole ( ESA). Calcolare la frazione di accorciamento (FS) con
- Utilizzare ImageJ per analizzare le immagini 3D OCM di visualizzare lo sviluppo strutturale del cuore mosca.
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Representative Results
L'imaging cardiaco longitudinale è stato condotto utilizzando i moscerini della frutta con il 24B-GAL4 / + ceppo a temperatura ambiente con OCM. Le misurazioni sono state effettuate a L2, L3, e ad 8 intervalli hr da PD1 a PD4, e il giorno adulto 1 (AD1) per seguire il processo metamorfosi (Tabella 1). Larva, pupa presto, tardi pupa e adulto mosche sono stati montati sui vetrini come mostrato nella figura 1A. Le caratteristiche del segmento del cuore per le mosche larvali e adulte sono stati mostrati nelle rappresentazioni schematiche in Figura 1B.
In questo studio di sviluppo, 4.096 fotogrammi sono stati acquisiti in 32 secondi con il nostro sistema OCM personalizzato per tracciare il battito del cuore di un moscerino della frutta. Per migliorare la precisione di misura, cinque misurazioni ripetute sono state prese per ogni campione in ogni fase dello sviluppo. dati 3D possono essere ottenuti anche per osservare i cambiamenti della struttura del cuore durante la metamorfosi.
Trasversale M-mode e le immagini 3D sono stati c reated con programmi personalizzati e Matlab ImageJ. En immagini dei volti e sezioni assiali sono stati costruiti dai dati acquisiti per visualizzare il processo di rimodellamento del cuore durante Drosophila metamorfosi (Figura 2). Per quantificare la funzione cardiaca dei moscerini della frutta, la regione del cuore è stata segmentata automaticamente utilizzando un programma Matlab personalizzato da tutti i 4096 fotogrammi. La frequenza cardiaca fly (HR) può essere quantificato dalle immagini OCM M-mode trasversale (Figura 3a). Durante le fasi pupa, il cuore smette di battere Drosophila occasionalmente 16. Abbiamo introdotto un nuovo parametro funzionale cardiaca, periodo attivo cardiaca (PAC) quantificare il rapporto del periodo con un battito cardiaco al tempo totale di imaging (Figura 3b). EDD, ESD, EDA, ESA, e FS sono stati utilizzati anche per quantificare i cambiamenti della camera cardiaca nelle dimensioni sia assiali e trasversali durante lo sviluppo di Drosophila. 16
content "> A stadi larvali, il tubo cuore comincia a posteriori addominale regione A8 con un lume più ampio (A5 - A8 in Figura 1B) e termina al segmento anteriore dorsale A1 con un diametro più stretto (T3 / A1 - A5 nella figura 1B ). la camera cardiaca era situato medialmente e dorsalmente e cresciuto grande durante L2 (figura 2 a, b) e L3 (figura 2 c, d). Dopo aver inserito PD1, è stato osservato il tubo cuore esecuzione assialmente sopra la parte superiore di un aria in movimento bolla (figura 2 e, f) Circa il 10 -. 13 ore più tardi, la bolla è scomparso dopo la formazione puparium e le grandi lume divenne estroflesso Dal momento che il tubo di cuore anteriore è stato ventralmente trova, il tubo di cuore tutto era invisibile tranne la regione posteriore in. . immagini OCM ~ 12 ore dopo la formazione puparium tardi durante PD2, della camera cardiaca gradualmente allineate lungo l'addome dorsale, e la parte posteriore (A6 - A8) del cuore è stato eliminato (figura 2 g, h) 42,43. Una camera conica ha iniziato a sviluppare ~ A1 - A4 segmento durante PD2 e cresciuto in dimensioni fino allo stadio adulto (Figura 2 I - m).Oltre a osservare i cambiamenti strutturali, molti cambiamenti funzionali sono stati trovati anche durante rimodellamento cardiaco. Le immagini M-mode mostrato nella Figura 3 dimostrano che il battito cardiaco rallentato in modo significativo dalla fase larvale allo stadio di pupa, e quindi notevolmente aumentato da pupa ad adulto. Sono state osservate variazioni significative risorse umane durante il ciclo di vita (figura 4a). Inoltre, il periodo di attività cardiaca (PAC) è stato analizzato per tutti i campioni misurati da L2 a AD1 (Figura 4b). Come mostrato in figura 4, HR tiene a ~ 277 battiti al minuto (bpm) per L2 e L3. Entrando fasi pupa vi è una marcata diminuzione HR e CAP. HR è ridotta a 86 ± 11 bpm all'inizio del PD1, e continua a diminuire a 26 ± 8 bpm dall'eND di PD1 finalmente venire ad un arresto completo all'inizio del PD2. Una scoperta interessante è il lungo periodo di inattività cardiaca osservato intorno PD2 stadio (~ 24 ore - 48 ore dopo la formazione puparium), indicato come cardiaca diastalsis sviluppo 16. Alla fine del PD2, lento battito intermittente riprende (HR 17 bpm ± 6 con CAP 5 ± 2). Nel corso PD3 e PD4, HR e aumento della PAC fino a raggiungere 392 ± 32 bpm e 95 ± 3% al primo giorno della fase adulta (5 giorni dopo l'inizio della fase di pupa).
Figura 1. Montaggio di Drosophila in diverse fasi e rappresentazione schematica della Metamorfosi Cuore. (a) Montaggio di larvale, pupa e adulto WT (24B-GAL4 / +) vola su vetrini. (b) Rappresentazione schematica della metamorfosi cuore. frecce rosse sul larva e adulte schematic indicare le posizioni di imaging OCM M-mode, fino PD1 24 ore e per i successivi punti di tempo, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Drosophila Cuore morfologici modifiche. En viso e assiali immagini OCM sezione di un Drosophila WT ottenuto in (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 e (k, m) adulti stadi. Immagini di modo M del cuore Drosophila sono stati ottenuti dal segmento A7 fino PD1 e dal segmento A1 per le fasi successive. Le barre di scala in en face e assiali immagini sezionali denotano 200 micron e 500 micron, respectively. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Drosophila Cuore modifiche funzionali. (a) le immagini M-mode a diversi stadi di sviluppo che mostrano i cambiamenti delle risorse umane attraverso il ciclo di vita. (b) Esempi che dimostrano periodo di attività cardiaca (PAC) di calcolo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Analisi quantitativa della Funzionale parametro cardiacos in WT vola a diversi stadi di sviluppo, tra cui L2, L3, Fasi pupe a 8 intervalli hr, e AD1. (a) HR. (b) della PAC. La barra di errore di ciascun gruppo rappresenta la deviazione standard. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| stadio di sviluppo | |||||||||||||||||
| L2 | L3 | PD1 | PD2 | PD3 | PD4 | AD1 | |||||||||||
| 8 ore | 16 ore | 24 ore | 32 hr | 40 hr | 48 ore | 56 hr | 64 hr | 72 ore | 80 hr | 88 hr | |||||||
| esemplare Numero | 21 | 17 | 13 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 18 | 17 | 18 | 9 | 25 | |||
Tabella 1. Numero di WT moscerini della frutta misurato vari stadi di sviluppo del Cardiac Developmental studio.
Video 1. Monitoraggio del battito cardiaco Lungo temporale Dimension e corrispondente Camera Cuore Cambia il diametro lungo la direzione z (direzione assiale) in una WT volano a L2. Il cuore batteva veloce rispetto ad un tasso costante. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare). p>
Video 2. Monitoraggio del battito cardiaco lungo temporale Dimension e corrispondente Camera Cuore Cambia il diametro lungo la direzione z (direzione assiale) in una WT volano a PD1. L'HR ha iniziato a diminuire. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Video 3. Monitoraggio del battito cardiaco lungo temporale Dimension e corrispondente Camera Cuore Cambia il diametro lungo la direzione z (direzione assiale) in una WT volano a PD2. Il cuore ha smesso di battere completamente nel tempo. L'oscillazione dei tracciati z diametro era dovuto al rumore imaging. target = "_ blank"> Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Video 4. Monitoraggio del battito cardiaco lungo temporale Dimension e corrispondente Camera Cuore Cambia il diametro lungo la direzione z (direzione assiale) in una WT volano a PD4. Dopo PD2, HR e PAC iniziato ad aumentare. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
Video 5. Monitoraggio del battito cardiaco lungo temporale Dimension e corrispondente Camera Cuore Cambia il diametro lungo la direzione z (direzione assiale) in una WT Fly a AD1. L'HR è il più alto tra tutte le fasi e PAC è stata quasi del 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere questo video. (tasto destro del mouse per scaricare).
Video 6. rendering 3D strutturale di una mosca larvale. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
La tachicardia di Drosophila, con un HR massima intorno a 400 bpm nelle fasi larvali e adulte, richiede alta velocità di imaging per risolvere i diastole e sistole del cuore (non meno di 80 fotogrammi / sec sulla base di esperienze). Grazie allo spessore piccole dimensioni camera cardiaca e micron scala parete cardiaca (5 - 10 micron), una risoluzione spaziale elevata (migliore di 2 micron) è richiesto per risolvere le strutture tubo cuore. In questo studio, ad alta risoluzione e sistema OCM velocità altissima stato sviluppato, in cui sono stati utilizzati uno spettrometro con trasmissione 600 linee / mm reticolo e una fotocamera a scansione lineare 2.048 pixel. Un tasso A-scansione 20 kHz è fornito dalla fotocamera linea di scansione. Il frame rate di 128 fotogrammi / sec è abbastanza veloce per catturare il battito cardiaco di Drosophila a più stadi di sviluppo, tra cui L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 e adulti. La sorgente luminosa è una sorgente di luce ad ampio banda supercontinuo con una lunghezza d'onda centrale e larghezza di banda pari a ~ 800 nm e ~220 nm, rispettivamente, e ha ottenuto una risoluzione assiale del ~ 1.3 micron di tessuto. Un obiettivo 10X è stato utilizzato nel braccio del campione di realizzare risoluzione trasversale ~ 3.9 micron. Poiché il tubo cuore di Drosophila è di circa 200 micron sotto la superficie dorsale, è richiesta una profondità di imaging di centinaia di metri micron. Uno specchio stelo 45 ° può essere utilizzato per generare un fascio campione anulare ed estendere la profondità di fuoco nel campione 44. La sensibilità e 3 dB roll-off sono stati determinati per essere 96 dB e 600 micron, rispettivamente, con la potenza del braccio campione di ~ 9 mW. Un programma informatico personalizzato è stato usato per controllare il sistema OCM e condurre le misurazioni. Le immagini strutturali cardiache e parametri funzionali ottenuti dimostrano la possibilità di utilizzare OCM per caratterizzare quantitativamente la morfologia cuore e la funzione di Drosophila in tutto il suo ciclo di vita.
Attualmente, parecchie altre tecniche sono utilizzati anche per una piccola immagineanimale di struttura del cuore o di una funzione, come ad esempio la tomografia computerizzata (CT), la risonanza magnetica (MRI) e ultrasuoni. OCM fornisce risoluzioni spaziali e temporali superiori a queste tecniche, che consente la visualizzazione di strutture sottili e dinamiche veloci nei cuori degli animali. La microscopia confocale è un'altra tecnica di imaging ampiamente utilizzato, ma la sua penetrazione bassa di imaging e requisizione di mezzi di contrasto per immagini limitare le sue applicazioni di animali vivi. Comparativamente, OCM consente ad alta velocità e l'imaging senza etichetta per la visualizzazione rapida dinamica cardiaca non invasivo nei piccoli animali. Tuttavia, vi sono ancora limiti di OCM. Ad esempio, la profondità delle immagini fornite dalla OCM è limitata dalla dispersione della luce da diverse centinaia di micron a circa 1 mm di tessuto mentre ultrasuoni ha profondità di penetrazione fino a 10 cm. Rispetto alla microscopia confocale, OCM ha una velocità più elevata e una migliore profondità delle immagini, ma con risoluzione inferiore e scarso contrasto molecolare. Inoltre, il nostro sistema OCM attuale è based sui sistemi di rilevazione spettrale-dominio. Maggiore velocità di imaging basata su spazzato source OCM 45 può fornire immagini più distinti di dinamiche rapide, come il battito del cuore.
Per eseguire lo studio longitudinale del battito cardiaco in Drosophila con OCM, ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Le mosche devono essere maneggiati con molta delicatezza in tutte le fasi dell'esperimento. Gestione larva dovrebbe essere particolarmente delicata dal momento che è facile danneggiare la larva, che potrebbero influenzare la struttura e la funzione del cuore nelle seguenti fasi di sviluppo. Le mosche devono essere posizionati sul vetro di copertura e la fase di imaging molto preciso. Scarsamente mosche posizionati renderà difficile acquisire immagini di qualità e può causare valori distorta dei parametri strutturali e funzionali del cuore. Inoltre, il trasferimento adulto aria da una provetta all'altra e collegare il batuffolo di cotone dovrebbe essere molto veloce per impedirne la fuga dal tubo.
Diversi studi suCuore sviluppo Drosophila può essere eseguita modificando il protocollo. La temperatura alla quale le mosche sono coltivate può essere aumentata o diminuita da 25 ° C a modificare il livello di espressione del gene cardiaco e modificare il periodo di sviluppo mosca. Con l'aggiunta di alcuni ingredienti come olio di cocco o ATR al cibo standard, lo sviluppo cuore può essere modificata. Studi specifici possono essere condotti in wild type o mosche transgeniche. Studiando frutta cuore sviluppo mosca longitudinalmente, diversi intervalli di tempo possono essere utilizzati per eseguire le misurazioni OCM, per esempio, un intervallo 8 ore potrebbe essere utilizzato durante le fasi pupa. A causa della limitata sensibilità del nostro sistema OCM, un sacco di rumore speckle uniforme si trova nelle immagini M-mode trasversali, che possono rendere difficile identificare correttamente i segnali di contrazione del cuore con i programmi Matlab e diminuire l'efficienza di analisi dei dati. La sensibilità può essere aumentata migliorando l'allineamento del sistema OCM. algoritmi di filtraggio ottimizzatisono raccomandati per rimuovere una porzione delle macchie.
Il protocollo descritto è stato applicato per studiare il silenzio della ortologhi circadiani umani, dCry e dClock indotte difetti cardiaci in Drosophila. HR Diminuzione sono stati osservati in diversi stadi di sviluppo, tra cui larva, pupa e adulto 15,16. Il ruolo dei geni circadiani nello sviluppo del cuore è stato rivelato, il che può spiegare l'associazione tra disturbi cardiovascolari e modelli di attività correlate ritmo circadiano. Alto contenuto di grassi-dieta (HFD) Patologie cardiache indotte sono stati studiati anche attraverso l'analisi di cuore cambiamenti funzionali di moscerini della frutta alimentati con HFD 15. Questi studi hanno dimostrato non solo Drosophila come un potente strumento per lo studio dello sviluppo della struttura e della funzione cardiaca, ma anche il significato di studio longitudinale cardiaca nella comprensione congenite e postnatali malattie umane. La piattaforma OCM consentirà una vasta gamma di studi futuri In gene correlato malattie cardiache umane.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| Microscope | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
| Labview software | National Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M | Scotch | ||
| Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
| Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
| Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
References
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