Lévitation magnétique Couplé avec imagerie portable et d'analyse pour le diagnostic de la maladie

Introduction

Ici, nous présentons une plate-forme technologique et une technique qui utilise la lévitation magnétique couplée à l'imagerie et l'analyse automatisé pour analyser la répartition de la densité des cellules d'un patient comme un indicateur de la maladie. Cette approche polyvalente pour l'analyse cytométrique basé sur la densité peut finalement être appliquée à une gamme de diagnostics de la maladie. Toutefois, afin d'être compatible avec les tests de point de soins et d'utilisation dans les pays en développement, la technique doit satisfaire aux exigences de faible coût, la portabilité et la facilité d'utilisation. Le dispositif et les consommables doivent être obtenus facilement à un faible coût. La préparation de l'échantillon doit être simple, l'analyse doit être automatisé avec des exigences minimales pour l'entrée ou l'interprétation utilisateur, et les résultats doivent être retournés rapidement. En outre, l'appareil doit être compact et portable pour être utile dans les milieux cliniques, ainsi que les pays en développement. Ainsi, nous avons développé un dispositif et un procédé pour utiliser sustentation magnétique au point-of-care compatible technollogie par couplage automatisé d'imagerie et d'analyse d'images pour retourner des résultats en ce qui concerne la distribution de densité d'une population de cellules d'un patient.

technologies de point de soins offrent un avantage notable par rapport aux procédures cliniques en cours d'essais en laboratoire. La technologie actuellement disponible est trop cher pour être détenue par un clinicien ou trop complexe pour être effectué par le personnel médical. Bon nombre de ces procédures nécessitent des protocoles de main-d'œuvre qui doivent être effectuées par un technicien qualifié. Pour ces raisons, les échantillons de patients tels que le sang ou l'urine sont généralement recueillies dans le bureau du médecin puis transféré à un laboratoire d'essai centralisé à distance pour les essais cliniques, ce qui peut prendre plusieurs jours pour le médecin de recevoir les résultats de l'essai. Cela peut entraîner des retards ou des complications au cours du traitement dans certains cas, rend ce test très coûteux et inefficace (entraînant un fardeau financier pour les contribuables d'assurance), et fait encore beaucoupdiagnostics inaccessibles dans les milieux à faibles ressources et les pays en développement.

Ici, nous présentons une technique de lévitation magnétique couplée à l' imagerie automatisée et d' analyse à la fois un dispositif d'imagerie embarqué et le traitement (Figure 1) et un dispositif de smartphone compatible (Figure 2). Ces dispositifs à base de lévitation magnétique constituent une plate-forme technologique largement applicable qui a le potentiel d'être appliquée à toute une gamme de différentes applications de diagnostic médical. Les fonctions magnétiques d'approche de sustentation basé sur un équilibre entre deux forces: une force magnétique et une force de flottabilité ^{1, 2, 3.} Lorsqu'une particule en suspension dans un milieu paramagnétique et inséré dans un champ magnétique généré par deux aimants avec des pôles analogues se faisant face, une force magnétique agit sur la particule dans la direction vers la ligne médiane entre les deux magn ets. La force de poussée est provoqué par la densité relative de la particule par rapport au milieu de suspension et vers le haut dans le cas de particules moins denses que le milieu et vers le bas dans le cas des particules plus denses que le milieu environnant. Sur la base de ces deux forces, les particules atteignent une position d'équilibre de sustentation dans le domaine qui équilibre ces deux forces; cette position est directement liée à la densité de la particule, avec les particules plus denses en lévitation dans le champ plus faible que les particules les moins denses. Un module d'imagerie, soit un appareil photo intégré smartphone ^{4, 5, 6} ou composants optiques indépendants équipés d'une lentille grossissante ^{7, 8,} sont utilisés pour visualiser les positions des particules. Traitement d'image, soit par le biais d' une application smartphone ^{4, 5,}= "référence externe"> 6 ou une unité de traitement intégrée ^{7, 8,} puis traite les images capturées pour quantifier la répartition spatiale et, par conséquent, la répartition de la densité de la population. Afin d'analyser des échantillons plus importants (tels que ceux avec seulement quelques particules d'intérêt par millilitre, le débit peut être intégré directement dans le dispositif de telles particules sont léviter et analysées lors de leur passage à travers la région d'imagerie (Figure 2).

Figure 1: Magnetic Levitation Plate - forme autonome. (A) Dispositif de lévitation magnétique comprenant un module compact focalisation magnétique, les composants d'imagerie (une diode électroluminescente (DEL), une lentille optique, et un détecteur de la caméra), et une unité de traitement avec un écran d'affichage. (B) l' intensité du champ magnétique dans le cross-section de la zone entre les aimants lorsque l'échantillon est inséré. La force du champ est la plus grande à la surface des aimants et se rapproche de zéro à la ligne médiane entre elles. (C) des particules, telles que des cellules, dans les expériences de champ magnétique de plusieurs forces: une force magnétique (F _m) vers la ligne médiane entre les composants magnétiques, avec la grandeur variant en fonction de la position de la particule; une force de gravitation (F _g) qui dépend de la densité des particules par rapport à celle du milieu de suspension, et une force d'entraînement (F _D) résistant à la requête de la particule. Reproduit avec permission, de Yenilmez, et al. ⁸ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figueure 2: Plate-forme Levitation Smartphone compatible Flow-assistée magnétique. (A - c) Avant (a), côté (b), et à l' arrière (c) des vues de dispositif magnétique à lévitation (d) Les composants du dispositif comprennent: 1) module de sustentation magnétique, y compris des aimants permanents, une lentille grossissante, et un diffuseur de LED et de la lumière, 2) cas smartphone, 3) l'électronique, y compris un microcontrôleur, le pilote de la pompe, et le récepteur Bluetooth, 4) porte micro-pompe, 5) orifice réglable, 6) porte-tube de déchets, 7) support de batterie, 8 ) porte-échantillon, 9) support à double usage et de la couverture. (E) d' écoulement schématique, montrant le pompage de l'échantillon à travers le champ magnétique. (F) La section du module de sustentation magnétique, montrant comment les particules de différentes densités seront alignées comme ils sont pompés à travers le champ; moins des particules denses, telles que des particules 1, vont équilibrer à une meilleure sustentation hauteur than particules plus denses, comme les particules 2. Reproduit avec permission, de Amin, et al. ¹ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les exigences minimales pour l'utilisation d'un échantillon pour l'analyse de la distribution de densité de ce système comprennent la possibilité d'obtenir une suspension de cellules ou de particules supérieures à environ 5 um et inférieure à environ 250 um (pour l'imagerie et le traitement d'image) et sa compatibilité avec le mélange dans une solution d'une solution paramagnétique tel que le gadobutrol utilisée ici. Pour le diagnostic des maladies, des applications compatibles comprennent ceux dans lesquels: (i) des cellules d'intérêt ont intrinsèquement une densité modifiée quand ils portent une maladie par rapport aux témoins sains, (ii) un changement de densité peut être induite dans la cellule par addition d'un réactif ou d'un traitement alternatif pour un courtTemps de cubation, ou (iii) différents types de cellules sont identifiées dans un échantillon unique et par nature (ou par l' intermédiaire d' un traitement) ont des densités caractéristiques uniques.

La drépanocytose est une maladie génétique provoquant une forme mutée de l' hémoglobine, HbS, à produire des globules rouges d'une personne (hématies), ce qui peut entraîner des événements vaso-occlusifs intermittents et une anémie hémolytique chronique ^9. Il est diagnostiqué en utilisant soit l'hémoglobine isoélectrofocalisation, chromatographie liquide à haute performance (CLHP) fractionnement ou électrophorèse de l'hémoglobine qui sont très précis mais doit être effectué dans un laboratoire d'essais cliniques parce qu'ils sont incompatibles avec les paramètres de point de soins. La solubilité et les tests à base de papier pour la drépanocytose ont été proposées, mais nécessitent généralement l'interprétation subjective de l'utilisateur et des tests de confirmation. Ici, nous utilisons une approche basée sur la densité pour identifier hématies falciformes, qui atteignent une densité supérieure à RBCs de personnes sans maladie drépanocytaire. Le mécanisme implique la polymérisation de la forme mutée de l' hémoglobine, HbS, ce qui provoque la déshydratation chez RBC falciformes hématies de la maladie des cellules dans des conditions désoxygéné ^{10, 11, 12, 13.}

Cette approche basée sur la densité peut également être appliquée pour séparer les cellules de différents types sur la base de la densité: globules blancs (WBC) et hématies ^7. WBCs sont généralement responsables de la lutte contre les infections dans le corps. WBC cytométrie peut être utilisée pour quantifier le nombre de ces cellules dans le sang et sert d'outil de diagnostic utile. WBC compte supérieur à la normale (généralement considérée comme supérieure à 11.000 cellules par ul) peuvent indiquer une infection, troubles du système immunitaire, ou la leucémie. WBC compte dessous de la normale (environ 3500 cellules par ul) peuvent être causés par des maladies auto-immunes ou conditions qui endommagent la moelle osseuse. Contrairement aux technologies alternatives, le processus présenté ici ne repose pas sur la lyse des globules rouges ou des taches afin d'identifier WBCs. Ce test à base de cellules tire profit des densités intrinsèques particulières des deux types de cellules pour effectuer la séparation, car la densité de population de WBC a été rapportée comme étant inférieure à celle de la population de RBC , tel que calculé précédemment en utilisant un gradient de densité de centrifugation ^{2, 3.}

Par rapport aux essais altérant des sites distants, ce test est rapide, simple , la préparation des échantillons (figure 3), la séparation des cellules dans le dispositif dans les 10 - 15 min, et l' imagerie et l' analyse automatisée qui exige moins de 1 min. De cette façon, le dispositif peut revenir rapidement des résultats pour mieux informer les décisions médicales, permettre un traitement à administrer immédiatement pour soulager la douleur physique et psychologique, et de réduire le risque de complications associATED avec un retard dans les soins médicaux. Cette technique peut être effectuée sur place, soit dans les milieux cliniques en raison de préparation simple de l'échantillon et de l'imagerie automatisée et l'analyse qui renvoie un résultat avec l'entrée minimale de l'utilisateur ou de l'interprétation. En raison de l'utilisation d'une approche simple en utilisant des aimants permanents pour l'analyse de l'échantillon et l'utilisation soit d'un smartphone ou des composants électriques simples pour l'imagerie et de traitement d'image, le dispositif ainsi que les coûts par test sont minimes par rapport à certaines procédures de tests sophistiqués.

Protocol

Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des échantillons de sang humain ont été effectués selon les règles institutionnelles. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel. Un consentement éclairé a été donné par tous les participants.

Préparation 1. Exemple de drépanocytose Diagnostic ^{5, 8}

1. Préparer une solution à 50 mM de gadobutrol dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
2. Dissoudre le métabisulfite de sodium 10 mM dans la solution de gadolinium.
   NOTE: métabisulfite de sodium est toxique par inhalation et irrite la peau et les tissus fortement. Il est un acide corrosif lorsqu'il est mélangé avec de l'eau. Il peut se décomposer pour émettre des fumées toxiques d'oxyde de soufre et de sodium lorsqu'il est chauffé à une température élevée.
3. Obtenir un échantillon de sang soit par fingerstick ou venipuncture.
   1. Prélever le sang en utilisant un dispositif autopiqueur avec un chiffon propre, lancette jetable. appression de plis à proximité du site percé et essuyer la goutte de sang formé de trois à quatre fois avant la collecte de sang à l'aide d'une pipette; prendre soin de ne pas «lait» le doigt en pressant le tissu, car cela va entraîner la contamination de l'échantillon avec le liquide tissulaire.
   2. Sinon, prélever du sang en utilisant des procédures de ponction veineuse standards ^14.
      NOTE: Si les échantillons seront conservés pendant plus de quelques heures, recueillir le sang dans un vacutainer avec un anticoagulant tel que l'EDTA.
4. Ajouter moins de 1 pi de sang pour 100 ul de la solution de métabisulfite de sodium gadolinium.

2. Préparation de l' échantillon pour WBC cytométrie ⁷

1. Obtenir un échantillon de sang soit par fingerstick ou venipuncture, comme dans la section 1.
2. Facultatif: Lyse hématies avec un tampon de lyse RBC. 5 ul de sang dans 500 pi de tampon de lyse RBC et incuber à température ambiante pendant 3 - 5 min.
   REMARQUE:cela peut être fait pour confirmer la gamme de sustentation d'une population isolée de WBCs. Toutefois, il est inutile d'effectuer cette étape, puisque les résultats présentés ici démontrent que les globules rouges en lévitation dans une position nettement inférieure à celle des globules blancs.
3. Diluer sang total 1: 1000 en mM Gd 25 dans HBSS
   REMARQUE: si la lyse cellulaire a été réalisée, diluer l'échantillon lysé 9: 1 échantillon lysé: 250 mM Gd pour obtenir un échantillon contenant mM Gd 25.

3. Analyse des échantillons en utilisant la plate - forme magnétique Lévitation ^{4, 5, 6, 7, 8}

1. Démarrez le dispositif de lévitation magnétique:
   1. Pour le dispositif autonome, branchez l'appareil, laissez-le au pouvoir en place, et placer sur une surface plane.
   2. Pour la version smartphone compatible, lancez l'application smartphone et glisser à gauche pour entrer dans l'imagemode de capture, et les placer sur une surface plane.
2. Pour sustentation magnétique statique:
   1. Chargez l'échantillon préparé dans un tube microcapillaire en verre carré en plongeant l'extrémité dans la solution et permettre à l'échantillon pour remplir le capillaire par action capillaire.
   2. Sceller l'extrémité avec un matériau d'étanchéité tubulaire en poussant lentement une extrémité du tube capillaire dans le matériau.
   3. Insérer le capillaire entre les aimants du dispositif de lévitation magnétique , de sorte que seuls 1 cm du tube reste visible (voir Figure 3 s'il vous plaît pour une illustration de la préparation de l' échantillon).
      REMARQUE: Cette étape reste la même pour le dispositif smartphone compatible et autonome.
   4. Attendre 10 min sans perturber l'appareil ou le capillaire.
3. Pour sustentation magnétique assisté débit:
   1. Charger l'échantillon dans le tube d'échantillon.
   2. Raccorder le tuyau d'entrée entre le conteneur d'échantillon et le microcapillary et raccorder le tuyau de sortie entre le microcapillaire et le conteneur de déchets.
   3. Définissez les paramètres d'intensité et de flux LED.
4. Veiller à ce que les cellules sont visibles dans le champ de vision, puis appuyez sur le bouton de capture pour capturer une image (bouton 3 sur le dispositif autonome et le bouton de la caméra sur le bas de l'écran dans l'application smartphone).
   NOTE: Si une clé USB est utilisé pour stocker les images, créez un dossier nommé "images" et insérer la clé USB avant d'allumer l'appareil. Si aucun lecteur est présent, l'appareil stocke les images dans sa mémoire interne et transféré plus tard.
   NOTE: Plusieurs images peuvent être capturées et analysées afin de réduire le risque d'anomalies en déplaçant le capillaire dans ou à l'extérieur d'environ ½ cm entre la capture d'images.
   NOTE: Si le nombre de cellules dans le champ de vision est trop élevée ou trop faible (comme détecté et signalé sur l'interface utilisateur), déplacer le capillaire dans ou hors de l'appareil ou préparer une autre sample.
5. Retirer l'échantillon et jeter l'échantillon selon les règlements institutionnels ou locaux. Capillaires doivent être éliminés comme un dièse.

Figure 3: Préparation des échantillons et de l' interface utilisateur. (A) La procédure de préparation d'échantillon comprend autopiqueur le doigt du sujet, la formation d' une goutte de sang, le transfert de la goutte de sang dans la solution de test d'échantillon, on a agité l'échantillon et le chargement dans un tube capillaire par action capillaire, et à insérer l'échantillon dans la lévitation magnétique dispositif. (B) Ces étapes de préparation des échantillons sont également affichés sur l'écran de l'appareil pour guider la préparation des échantillons. (C) Le dispositif comporte quatre boutons: un bouton pour zoomer sur l'image de l' échantillon afin d'ajuster correctement la mise au point à l' aide du bouton de réglage; un bouton pour obtenir un seul mesure (retard d'un 5 est mis en œuvre afin de permettre à l'utilisateur d'insérer l'échantillon); une mesure time-lapse (6 images sont prises à 5 de les intervalles); et un bouton pour éteindre l'appareil après utilisation. Reproduit avec permission, de Yenilmez, et al. ⁸ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

4. Analyse ^{4, 5, 6, 7, 8} Image

1. Exécutez le logiciel d'analyse d'image inclus dans le dispositif de l'échantillon approprié (distribution de cellules ou d'un type cellulaire séparation).
   Remarque: Pour que le dispositif autonome, l'analyse est effectuée automatiquement et affiché sur l'interface utilisateur graphique. Pour le dispositif de smartphone compatible, pour effectuer l'analyse, aller à la galerie d'unNd sélectionner le fichier vidéo désiré à analyser.
2. Observer et enregistrer la sortie de l'analyse affichée à l'écran.
   NOTE: Pour l'analyse de la répartition des cellules (telles que la faucille diagnostic de la maladie de la cellule), la sortie est la largeur de confinement de la population cellulaire.
   NOTE: Pour le type de cellule de séparation (comme l'identification WBC), la sortie sera une image avec la population WBC identifié. Afin de calculer le nombre de cellules par microlitre, il faut multiplier le nombre moyen de globules blancs par image par un facteur de 2000. Par exemple, si 5 globules blancs ont été observés, cela indiquerait 10000 GB / ul. La plage normale est généralement considérée comme 3.500 - 11.000 WBCs / ul.
3. Répéter l'analyse en déplaçant le tube d'échantillon dans ou hors du dispositif d'environ ½ cm et capturer une autre image devant être analysé comme décrit ci-dessus.
   NOTE: Il est recommandé de répéter l'analyse 5 - 6 fois par échantillon pour éviter les erreurs.

Representative Results

Pour l'analyse de la répartition de la densité cellulaire, ce qui est la technique utilisée pour le diagnostic des maladies de faucille cellulaire, dont le but est d'identifier la largeur de la distribution de la population cellulaire. Les cellules sanguines des patients sans maladie drépanocytaire seront confinés à l'intérieur d'une largeur prévisible. Les cellules provenant de patients atteints de drépanocytose seront distribués dans une région plus large, avec une inclinaison vers le bas dans la distribution de la cellule (voir Figure 4.) Pour toute application particulière, un seuil peut être réglé entre la largeur des échantillons de contrôle de la distribution par rapport à celui de la santé échantillons en tant que coupure entre «sain» et «positif pour la maladie" ^{5, 8.}

Figure 4: Exemple de lévitation magnétique pour l' analyse Density distribution comme indicateur pour la drépanocytose dans les échantillons de sang. Sur la gauche, les globules rouges sont bien confinés à l'intérieur d'une région étroite. Sur la droite, un sous-ensemble de cellules de globules rouges atteignent une plus grande densité et donc une hauteur de sustentation inférieure, ce qui fausse la distribution vers le bas et l'augmentation de la largeur de confinement. Barre d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Analyser la répartition de densité d'un échantillon, un algorithme de calcul est mise en oeuvre dans le dispositif. Tout d'abord, les gradients d'intensité de pixels le long des axes verticaux et horizontaux sont calculés. Les bords de l'aimant et des bords capillaires sont détectés comme des pics dans le profil de gradient de pixels verticaux. La distance entre les bords intérieurs capillaires, en pixels, est connu pour être de 0,7 mm et est donc utilisé comme scaling facteur pour convertir les distances des pixels en millimètres. Le gradient d'intensité de pixel le long de l'axe horizontal est le plus grand dans lequel se trouvent les cellules. Ce profil de gradient est analysé et apte à une courbe de Gauss. La valeur 4 fois l'écart-type de cette courbe est rapportée comme la largeur de confinement.

Les résultats de la figure 5 montrent les largeurs de confinement à la fois pour le contrôle et les échantillons de drépanocytaires. Ici, les échantillons d'une largeur de confinement supérieure (plus de 50 um) seraient considérés comme la drépanocytose positive et ceux en dessous de ce seuil seraient considérés comme négatifs pour la maladie. Il convient de noter que d' autres méthodes d'analyse de la distribution drépanocytaire ont été étudiées et rapportées par Yenilmez et al. ⁸

Figure5: Quantification de la largeur Confinement pour la drépanocytose Diagnostic. Les résultats expérimentaux pour la largeur de confinement du contrôle (n = 48 images sur 4 sujets) et la drépanocytose (n = 93 images de plus de 10 sujets) des globules rouges. Les résultats sont statistiquement significatifs selon un test de Mann-Whitney-Wilcoxon recto-verso (approximation normale, n ₁ = 3, n ₂ = 10, Z = -2,6764, p = 0,0074). Les moustaches représentent les largeurs minimale et maximale de confinement des échantillons testés et les astérisques représentent les valeurs aberrantes. Reproduit avec permission, de Yenilmez, et al. ⁸ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour la séparation des particules, qui peut être utilisé pour identifier les globules blancs dans des échantillons sanguins, l'objectif est d'identifier deux Popul distinctsations. Si les populations ont des densités différentes, elles seront observées dans des régions distinctes dans le champ de vision. Ainsi, les populations homogènes de deux ou plus de particules ayant des densités distinctes peuvent être en lévitation et, après séparation, les populations multiples peuvent être observés dans l'image et détectés en utilisant l'algorithme d'analyse d'image ⁴ (voir figure 6).

Afin d'analyser la séparation des deux types cellulaires différents, un algorithme est mis en oeuvre ce qui distingue les deux populations séparées à l'équilibre. D'une manière similaire à celle décrite pour l'analyse de la maladie de faucille cellulaire, deux gaussiennes sont propres à l'échantillon, au lieu d'une seule courbe. Chaque pic dans les gradients d'intensité de pixel représente une population de cellules différentes. Les courbes de Gauss aptes à ces données donnent à la fois la hauteur de lévitation moyenne (par rapport à la position de l'aimant inférieur) comme la moyenne de la courbe de Gauss etle confinement largeur que l'écart type de la courbe ^7.

Figure 6: Exemple de lévitation magnétique d'une population mixte de microparticules avec Densités Distinct. (A) Courbes d'étalonnage mettant en relation la densité de la microsphère avec la hauteur de lévitation en cinq concentrations différentes Gd allant de 12,5 à 200 mM. La pente est plus grande aux plus faibles concentrations de Gd, offrant ainsi une plus grande résolution ( par exemple la sensibilité à de petites différences de densité). La pente est la plus faible pour des concentrations plus élevées de D.ieu, ce qui démontre la gamme accrue de détection, mais avec une résolution inférieure. (B) de séparation en fonction du temps d'un échantillon homogène de microsphères de deux densités différentes au cours des deux minutes. A l'équilibre (à droite), deux bandes distinctes sont détectées par l'image analealgorithme yse. Reproduit avec permission, de Yenilmez, et al. ⁷ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Afin d'identifier les types cellulaires individuels ayant des densités différentes pour une application donnée, il est conseillé de première léviter un type de cellule à la fois de quantifier la hauteur de lévitation attendu. La figure 7a montre la hauteur de lévitation des globules blancs d'un échantillon de sang dans lequel les globules rouges ont été lysés. Ceci définit la région de confinement de WBCs pour une analyse ultérieure. Les résultats indiquent que les globules rouges des globules blancs inférieur à léviter et, par conséquent, les globules blancs peuvent être distingués des échantillons de sang en fonction de la position de lévitation. Le volume dans un domaine donné de vue est de 0,5 pi. Dans les échantillons qui ont été dilués 1: 1000, le nombre de globules blancs / pi peut être calculé en comptantle nombre de globules blancs dans le champ de vision et en multipliant par un facteur de 2000 ^7.

Figure 7: WBC cytométrie en sang total. (A) Lévitation des globules blancs du sang suivants RBC lyse. Ceci définit la plage dans laquelle WBCs léviter dans le champ magnétique en mM Gd 25. (B) Exemple de comptage WBC (globules blancs marqués par des flèches bleues). Le cadre supérieur incrustation montre WBCs et le cadre inférieur et le cadre inférieur incrustation montre la population RBC. Reproduit avec permission, de Yenilmez, et al. ⁷ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole
Les facteurs critiques dans ce processus comprennent le bon alignement des aimants. Si les aimants deviennent délogée ou séparés plus que la normale dans le dispositif, cela peut affecter les résultats. Pour contrôler ce défaut ou d'autres dans le processus, une particule de densité contrôlée, tels que des microsphères de polystyrène, peut être utilisé périodiquement pour contrôler les changements au fil du temps. En outre, le temps de lévitation est importante pour permettre aux cellules d'atteindre l'équilibre. Pour les globules rouges, 10 min est suffisante pour permettre à toutes les cellules d'atteindre l'équilibre. Cependant, il est important de noter que les petites particules ou les cellules peuvent nécessiter plus de temps pour atteindre l'équilibre. Cela peut être évalué en prenant des images de déchéance de temps à un intervalle de 5 et en traçant la largeur de confinement au fil du temps; l'équilibre peut être déterminé comme étant le point où le changement de largeur confinement est négligeable.

D'autres étapes critiques au sein du protocole comprennent la préparatifs de la solution de gadolinium à la concentration précise que cela influence grandement l'échantillon hauteur de sustentation. Cela peut être fait à l'avance et utilisé à partir d'une solution mère, mais doit être correctement scellé pour éviter l'évaporation de la solution et une augmentation involontaire de la concentration. En outre, il faut prendre soin de maintenir l'état de santé des cellules utilisées. Pour le sang humain établi par fingerstick, il doit être utilisé dans une heure de prise de sang et non autorisé à sécher en stockant dans un récipient hermétique. Pour le sang humain établi par ponction veineuse, les échantillons doivent être conservés à 4 ° C pendant plus d'une semaine avec anticoagulant (acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), un anticoagulant commun, a été utilisé ici). Pour les lignées cellulaires adhérentes, les cellules mortes doivent être soigneusement lavés de la culture avant la trypsine et les cellules doivent être incubés jusqu'à utilisation. La santé des cellules au moment de sustentation est critique parce que la santé des cellules est connu pour affecter la densité et donc sustentation height.

Modifications et dépannage
Nous avons démontré la séparation et l'isolement des cellules de deux densités différentes à des endroits prévisibles dans le champ magnétique. Afin d'étendre cette technique à d' autres applications, les différentes formulations du milieu paramagnétique peuvent être utilisés pour obtenir une plage désirée de détection pour les applications alternatives ^3. La concentration de gadolinium régit la résolution de détection ainsi que la gamme (s'il vous plaît se référer à la figure 6a). Étant donné que des concentrations plus élevées de gadolinium augmentent la puissance de la force magnétique appliquée aux cellules, plus la concentration en gadolinium dans la solution de suspension, plus la différence de hauteur de lévitation sera de toute différence dans la densité cellulaire. Bien que cela limite la résolution, définie comme la capacité à distinguer de petites différences dans la densité des cellules, il augmente la plage de densités qui peut être analyséeré. De même, la diminution de la concentration de gadolinium augmente la résolution, mais diminuer la portée de détection. En outre, la densité du milieu peut être modifiée pour changer les limites de détection vers le haut ou vers le bas. La deuxième force qui contrôle la hauteur de lévitation est la force de flottabilité, qui dépend de la densité relative de la cellule par rapport à celle du milieu de suspension. Ici, une solution de mise en suspension à base d'eau est utilisée, ce qui signifie que les cellules ayant une densité qui est la même que celle de la lévitation moyenne sur la ligne centrale entre les deux aimants avec des cellules les moins denses ou plus denses en lévitation au-dessus ou au-dessous de la ligne centrale, respectivement (avec une gamme contrôlée par une force magnétique tel que décrit précédemment). Parce que la force de flottabilité dépend de la densité relative, augmentant la densité du milieu va décaler la plage de détection à une gamme plus élevée de densités cellulaires. De même, en utilisant un milieu de plus faible densité se déplacera la plage de détection vers une limite inférieure de la densité des cellules. < / P>

Nous avons également étudié la performance du dispositif de focalisation magnétique assisté par écoulement en quantifiant le nombre de particules normalisées sur la largeur du tube capillaire (ie probabilité d'une particule à l' écoulement à une certaine distance sur la largeur du capillaire). des débits plus faibles ont plus confinement des particules, mais aboutissent à un débit de volume inférieur, qui peut être un inconvénient pour la détection d'objets rares dans les échantillons à volume élevé. Cependant, ceci peut être résolu en des passages multiples dans le champ magnétique ou par des aimants plus longs. Séparation entre plusieurs types de cellules peut également être mis à profit dans les études futures pour isoler les particules de différentes densités en misant sur un séparateur microfluidique à l'extrémité du champ magnétique.

Lors de la séparation plusieurs types de cellules, il peut être utile de faire léviter chaque population individuellement afin d'établir la hauteur moyenne et la gamme de chaque type de cellule avant léviter la population homogène.

e_content "> Limites de la technique
Le procédé présenté ici est limitée à la séparation des particules de densités différentes. Afin d'obtenir une identification fiable des multiples types de cellules, il est important qu'ils ont des plages de densité discrètes qui ne se chevauchent pas. En outre, les particules qui peuvent être détectées sont limitées en taille. Ils doivent être en mesure de se déplacer librement dans le tube microcapillaire - 200 um est la limite supérieure recommandée sur le diamètre des particules. En outre, les particules doivent être suffisamment grandes pour être imagé clairement - 5 pm est la limite inférieure recommandée sur le diamètre.

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Cette approche de l'analyse cellulaire est simple, ce qui permet une analyse conviviale sur place. De nombreuses procédures de diagnostic médical doivent être effectuées dans des laboratoires d'essais cliniques et nécessitent des équipements et des procédures effectuées par un specialis de laboratoire formé tests spécialisést. Cependant, ce protocole nécessite un dispositif simple qui est plus accessible aux cliniques de soins de santé. La préparation de l'échantillon est simple et l'analyse est automatisée, ce qui minimise le risque d'erreur de l'utilisateur.

Ce dispositif permettra de tester rapidement, sur place pour une variété de conditions médicales. Le dispositif est, sans étiquette, et portable convivial, le rendant idéal pour le diagnostic de la maladie au point de soins. Par rapport à la norme actuelle de l'essai clinique à distance de laboratoire, cette approche permettra aux médecins de faire rapidement des décisions éclairées en ce qui concerne les soins aux patients et potentiellement prévenir les complications dues à des retards dans les soins. La plate-forme a été conçue avec des composants facilement accessibles et peu coûteux, permettant une utilisation généralisée de cette méthode dans les milieux cliniques et les pays en développement et l'amélioration de l'accessibilité dans le monde entier aux soins de santé.

Applications futures ou les directions après Maîtriser cette technique
Il est important de noter que leessais décrits ici ne sont pas encore validés sur une population de patients à grande échelle. À ce jour, la faucille diagnostic de la maladie de la cellule a été confirmée dans une petite cohorte des patients ^{2, 5} et WBC cytométrie a été démontrée comme une preuve de concept. Les essais cliniques avec ces applications et celles développées dans l'avenir doivent être effectuées afin de valider cette méthode avant l'utilisation clinique, mais les résultats présentés ici sont prometteurs pour une éventuelle utilisation de cette technologie et de la technique pour le diagnostic clinique de point de soins.

En utilisant cette approche pour l'analyse cytométrique basé sur la densité peut finalement être étendue à des applications de diagnostic des maladies supplémentaires. Cette approche de la sustentation magnétique des cellules individuelles pour le diagnostic des maladies telles que décrites ici nécessite l'utilisation d'une seule cellule suspensions des cellules d'un patient et à des cellules qui peuvent être imagées en utilisant le système actuel avec ses limites sur la résolution en raison de l'utilisationd'une caméra de smartphone ou optique à faible coût. De plus, cette technique est applicable aux maladies qui répondent à l'une des conditions suivantes: (i) des cellules d'intérêt doit atteindre une densité modifiée quand ils portent la maladie par rapport aux témoins sains, (ii) un changement de la densité cellulaire doit être inductible par addition d' un réactif (ou tout traitement alternatif disponible), ou (iii) le diagnostic doit consister à identifier les différents types de cellules dans un seul échantillon qui soit intrinsèquement ou par l'intermédiaire d'un traitement ont des densités uniques. Les applications futures à d'autres maladies en utilisant le même dispositif de plate-forme peuvent avoir un impact énorme sur la santé mondiale. Ceux-ci peuvent comprendre la détection de composants biologiques, qui se distinguent par la densité. Certains types de cellules, les cellules qui subissent la mort cellulaire et les cellules malades sont tous révélés avoir des signatures uniques de densité et donc de motifs magnétiques distincts, et peuvent donc être quantifiés et séparés à l'aide de cette plate-forme. Les cellules dans un nombre très faible peuvent aussi be détectée en tirant parti de l'écoulement du fluide dans le dispositif de sustentation magnétique assisté débit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 ml vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201