Abstract
크로 마틴 면역 침강 (칩)은 후성 유전학 및 특정 단백질 DNA 상호 작용을 분리 유전자 조절의 분야에서 필수적인 도구입니다. 높은 처리량 시퀀싱 (칩 서열)에 결합 된 칩은 일반적으로 염색질 상호 작용 단백질의 게놈 위치를 결정하기 위해 사용된다. 그러나, 칩 서열은 수백 염기쌍 비교적 낮은 매핑 해상도 및 높은 백그라운드 신호에 의해 방해된다. 칩 엑소 방법은 실질적으로 해상도 및 노이즈 모두 개선 한 칩 서열의 정제 된 버전이다. 칩 엑소 방법론의 키 차이는 효과적으로 왼쪽 풋 프린트 라이브러리 준비 워크 플로의 람다 엑소 뉴 클레아 제 소화의 설립 및 단백질 DNA의 가교 사이트의 오른쪽 5 'DNA 테두리입니다. 칩 엑소 라이브러리는 다음 높은 처리량 시퀀싱을 실시한다. 얻어진 데이터는 기능적 조직 O에 고유 초 고해상도 통찰력을 제공하기 위해 활용 될 수있다게놈 바. 여기, 우리는 우리가 최적화 및 포유류 시스템과 차세대 시퀀싱 합성에 의한 플랫폼 간소화 한 칩 - 엑소 방법을 설명합니다.
Introduction
크로 마틴 면역 침강 (칩)을 선택적으로 살아있는 세포에서 특정 단백질과 상호 작용하는 DNA 단편을 위해 농축에 의해 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 강력한 방법이다. 기술은 높은 처리량 시퀀싱 (칩-SEQ) 1 올리고 뉴클레오티드 마이크로 어레이 (칩 - 칩)에 하이브리드에 하나의 궤적 (표준 칩-qPCR에) 검출에서 향상으로 칩 농축 DNA 단편의 검출 방법은 진화했다. 칩-서열이 광범위한 응용 프로그램, 염색질 이질성과 비특이적 DNA 상호 작용을 볼 수 있지만 오탐 (false positive)과 부정확 한 매핑 최고의 데이터 품질을 방해했다. 이러한 제한을 우회하기 위해, 박사 프랭크 퓨는 칩 - 엑소 방법 (2)를 개발했다. 칩 엑소의 두드러진 특징은 효율적으로 위치를 결합 전사 인자를 footprinting에, 엑소 뉴 클레아 '3', 5를 포함하고 있다는 것이다. 결과적으로, 칩 - 엑소 방법은 높은 해상도 detectio의 큰 동적 범위를 달성n 및 낮은 소음.
칩 - 엑소 좀 더 기술적으로 어려운 칩-서열보다 마스터하지만 연구는 다양한 생물학적 시스템 3-8를 사용하여 고유의 초 고해상도 통찰력을 확보하는 것을 목표로, 그것은 널리 채택되고있다. 실제로, 칩 엑소 성공적 박테리아, 효모, 마우스, 래트, 인간 세포 시스템에 적용되어왔다. 원리의 증거로, 칩 - 엑소는 원래 효모 전사의 소수는 2 요인에 대한 정확한 바인딩 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이 기술은 또한 전사 개시전 복합체의 구성을 연구하기 위해 다양한 히스톤 9,10 subnucleosomal의 구조를 해독 효모에 사용 하였다. 최근에, 우리는 인간의 발기인에 이벤트를 바인딩 인접 TFIIB와 폴 II를 해결하기 위해 칩 - 엑소을 활용, 별개의 개시 11 복합체에서 널리 발산 전사가 발생하는 것으로 나타났다.
여기에 제시된 워크 플로우 최적화의있다포유 동물 칩 - 엑소 (그림 1)에 대한 treamlined. 첫째, 생활 차 또는 조직 배양 세포를 공유 가교를 통해 생체 내 단백질 DNA 상호 작용에 보존하는 포름 알데히드로 처리됩니다. 세포 용균 및 염색질은 100 ~ 전단된다 - 500 염기쌍 크기 단편. 칩은 선택적으로 관심있는 단백질에 가교 결합 된 DNA 단편에 대한 풍부. 이 시점에서, 칩은 일반적 서열 라이브러리 본질적 수백 염기쌍 단편의 평균 크기를 검출 해상도를 제한하는 제조된다. 그러나, 칩 엑소 왼쪽 및 람다 엑소 뉴 클레아 제와 단백질의 DNA 가교 부위의 바로 5 'DNA 경계를 트리밍함으로써 이러한 제한을 극복한다. 아래에 설명 된대로 시퀀싱 라이브러리는 다음 엑소 뉴 클레아 제 소화 DNA로 구성되어있다. 얻어진 중첩 5 '테두리 단백질 DNA 상호 작용 (도 1, 스텝 14)의 생체 내 공간을 나타내고, 높은 처리량 시퀀싱에 의해 검출된다. Alt 키무릎이 칩 엑소 방법은 칩-서열보다 더 복잡 대부분의 단계 사이의 전환은 샘플 손실과 실험적인 변동성을 최소화 간단한 비드 세척을 필요로한다. 중요한 것은, 칩 - 엑소는 칩-SEQ, 또한 칩 - 엑소에 성공한다 칩-서열에 성공하는 샘플의 세련된 버전 때문이다.
칩 서열에서 근본적으로 구별되는 데이터 구조의 칩 엑소 결과 단백질 DNA의 상호 작용의 생체 배출량 측정. 공통 칩 서열 발신자가 가장 정확한 피크 호출을 수득 칩 엑소 데이터에 적용될 수 있지만, 우리는 특별히 염두 칩 엑소 데이터의 독특한 구조로 설계 정보학 도구를 추천한다. 이들은 Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla 및 ExoProfiler 12-15을 포함한다.
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Protocol
참고 : 두 번 증류수 H 2 O 또는 분자 수준의 상응하는 모든 버퍼와 반응 믹스하는 것이 좋습니다.
날 0 : 재료 준비 및 세포 수확
1. 버퍼 준비
- 3 (표 1 - - 3) 용해 버퍼 (1)을 준비하고 사용하기 직전에 각 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 완전한 단백질 분해 효소 억제제 재고 (CPI)를 추가합니다. 1 정 1 ml의를 분자 수준의 H 2 O를 용해하여 CPI 재고를 준비
- 칩 버퍼 (- 7 표 4)를 준비합니다. 차단 및 RIPA 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다. 트리스와 칩 용출 버퍼 CPI를 추가하지 마십시오.
어댑터 올리고 뉴클레오티드의 2 어닐링
주 : 특정 뉴클레오티드 서열은 부가 정보 섹션에서 찾을 수있다.
- 어댑터 어닐링 믹스 (- 9 표 8)를 준비합니다. 혼합하는 소용돌이 짧게컨텐츠 수집 튜브에 스핀. 나누어지는 0.5 ml의 튜브에 각각의 믹스 100 ㎕.
- 열 순환기에서 프로그램 (표 10)를 실행하여 올리고 뉴클레오티드를 혼성화.
스토어는 -80 ° C에서 올리고 뉴클레오티드를 어닐링.
포름 알데히드와 생체 내 염색질 가교 3.
참고 : 일반적으로 칩 실험의 경우, 출발 물질은 약 5,000 만 셀을 포함해야합니다.
- 완충액을 포스페이트 신선한 37 % 메탄올 - 유리 포름 알데히드 스톡 용액을 첨가 (PBS)를 1 % (V는 / V) 잘 혼합하고 10 분 동안 실온에서 앉게의 최종 농도로 세포 배양 물을 세척 하였다.
참고 : 예를 들어, 우리는 일반적으로 실온에서 PBS 50 ㎖의 셀에 1.4 ml의 37 % 메탄올 무 포름 알데히드를 추가한다. 미디어의 단백질은 포름 알데히드의 일부를 해소하기 때문에 또한, 미디어 가교 포름 알데히드을 피하십시오. - 2.5 M 글리신을 첨가하여 가교 반응을 켄 칭하고125 mM의 최종 농도를위한 전자. 철저하게 섞는다.
- 얼음에 50 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 1,000 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀. 가만히 따르다 뜨는.
- 피펫으로 세포 펠렛과에 resuspend에 1 ml의 얼음처럼 차가운 1X PBS를 추가합니다. 1.5 ML 튜브로 전송합니다.
- 4 ° C에서 2,000 XG에서 3 분 동안 세포를 스핀. 기음 뜨는.
- 즉시 액체 질소 1.5 ml의 튜브에 세포 펠렛을 동결 깜박입니다. -80 ° C에서 보관하십시오. 가교 된 세포는 -80 ° C에서 무기한 안정하다.
1 일 : 세포 용해, 초음파 처리 및 칩
4. 세포 용해
주 : 모든 세포 용해 구간 동안 샘플 가교 반전을 최소화하기 위해 얼음 또는 4 ℃에서 유지되어야한다.
- 간단히 가교 세포 펠렛을 해동. 철저히 0.5 ml의 용해 버퍼 (1)의 각 펠렛을 재현 탁하고, 15 ml의 폴리스티렌 튜브에 4.5 ml의 용해 버퍼 (1)과 결합.
- 4 ° C에서 10 분 동안 락 튜브락 플랫폼에 대한. 4 ° C에서 2,000 XG에 4 분 스핀. 가만히 따르다 뜨는.
- 철저히 0.5 ml의 용해 버퍼 2의 각 펠렛을 재현 탁 4.5 ml의 용해 버퍼 2 번 재현 탁를 추가합니다.
- 락 플랫폼에서 4 ° C에서 5 분 동안 바위. 4 ° C에서 2,000 XG에 5 분 스핀. 종이 타월에 초과 눌러 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다합니다.
- 철저히 0.5 ml의 용해 버퍼 3 각 펠렛을 재현 탁하고 1 ml의 용해 버퍼 3 번 재현 탁를 추가합니다. 얼음에 핵 해물을 유지하고 즉시 초음파로 진행합니다.
핵 해물 5. 초음파 처리
참고 : 모든 초음파 섹션 동안, 샘플 가교 반전을 최소화하기 위해 얼음에 보관해야한다. 아래의 프로토콜과 관련하여 사용되는 초음파 처리기의 특정 모델은 재료의 표에서 발견 될 수있다. 특정 초음파 처리기 사용 및 다른 악기에 대한 가이드 라인에 대한 자세한 내용은 추가 정보 섹션에서 찾을 수있다.
- 경기 수핵 추출물을 포함하는 15 ml의 폴리스티렌 튜브 에이스 공명 어댑터 (금속 막대는 튜브의 벽에 닿지 않도록한다).
- 중간 전력에서 / 30 초 OFF ON 30 초와 2 × 15 분 세션에 얼음 냉수 목욕 초음파 처리 핵 해물. 한 번에 두 개의 15 ml의 튜브를 초음파 처리. 이러한 설정은 세포주 및 일차 세포 유형의 넓은 범위에서 작동하지만 염색질 전단이 불완전한 경우 추가적인 최적화가 필요할 수있다.
- 1.5 ml의 튜브에 해물에서 초음파 결과, 전송 2 × 10 μL 샘플을 확인하십시오.
- 가교를 바꾸려면, 10 ㎕의 TE-의 RNase A와 30 분 동안 37 ° C에서 테 K. 품어 0.2 μL로 처음 10 μL 나누어지는을 결합한다. 4 μl의 6 배 크실렌 DNA 염료를 추가합니다.
- 가교을 유지하려면, 2 μl의 6 배 크실렌 DNA 염료와 제 10 μL 나누어지는을 결합한다.
- 약 30 140 V에서 1.5 % 아가 로스 젤에 모두 샘플을 실행 - 사다리에서 브로 모 페놀 염료 때까지 45 분 전겔 내리막 길의의의 ¾.
- 초음파가 성공 (100 전단 대부분의 DNA 단편 - BP 500) 인 경우, 전송은 10 % 트리톤 X-100 150 μl를 함유하는 2 ml의 튜브를 초음파 해물. 소용돌이는 혼합한다.
- 불용성 염색질과 파편 펠렛, 스핀은 4 ℃에서 20,000 XG에 10 분 동안 핵 해물을 초음파.
- 새로운 2 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 무기한 -80 ° C에서 칩 또는 저장 샘플을 즉시 진행합니다. 초음파 추출물을 동결 한 번 이상 해동 할 수 없습니다.
비즈 6. 커플 링 항체
주 :이 산산조각 및 배경 신호를 증가하기 때문에 절대 소용돌이 또는 동결 / 자기 구슬을 녹여.
- 철저하게 1.5 ml의 튜브로 비드 슬러리 μL 주식, 나누어지는 Y를 혼합 한 후 여기서 Y = 1.1 × 2.5 μL의 × (칩 샘플 수). 2.5 μL 비드 슬러리에 대한 용량을 바인딩 13 μg의 IgG에 달려있다. 풀 구슬 1 ml의 차단으로 3 배 세척완충기.
- 세척 후 구슬의 일관성 aliquotting를 들어, 버퍼를 차단와 10 배 원래 슬러리 볼륨 (25 μL / 칩)에 재현 탁 구슬. 나누어지는 1.5 ml의 튜브에 칩 샘플 당 25 μl를.
- 에 resuspend 구슬 나누어지는 대응하는 항체의 10 μg의 - 5를 추가합니다. 버퍼를 차단하여 250 μL에 최종 볼륨을 가져옵니다. 4 ° C에서 (밤새 16 시간 동안, 선택적으로) 회전 플랫폼에서 4 시간 동안 샘플을 품어.
- 기음 뜨는. 언 바운드 또는 과량의 항체를 제거하려면 버퍼를 차단 1 ㎖로 한 번 구슬을 씻는다.
- 비드 접합체 : 마지막 세척을 흡입 한 후, 즉시 항체에 초음파 추출 (~ 1.6 ㎖)의 5000 만 셀 등가물을 추가합니다. 초음파 추출이 준비가되지 않은 경우, 버퍼를 차단 100 μL에 재현 탁 비즈 그들은 준비가 될 때까지. 구슬 건조시키지 않을 것이 중요합니다.
7. 염색질 면역 침전 (칩)
- 각각의 칩 샘플의 경우, 초음파 처리의 1.5 ml의 결합D 항체를 추출 : 비드 접합체 1.5 ml를 2 ml의 튜브입니다.
- 4 ℃에서 9의 속도 설정에서 밤새 (약 16 시간) 미니 튜브의 회전에 튜브를 품어. 샘플이 유출되지 않고 적절하게 혼합되도록하는 데 몇 분 후 확인합니다.
주 2 : 칩 세척 및 효소 반응을 켜기 - 수지
8. 칩 세척
참고 : 잠깐, 교차 오염을 최소화 각 세척 사이에 튜브를 회전합니다. 최초의 포부를 들어, 각 샘플 사이의 조언을 변경합니다. 후속 세척 동안, 동일한 팁은 비드에 접촉하지 않은만큼 사용될 수있다. 적절한 칩 세척에 대한 지침에 대한 추가 정보 섹션을 참조하십시오.
- 아주 잠깐의 microcentrifuge를 사용하여 튜브를 회전 (~ 500 XG에 3 초) 대문자로 액체를 수집하고 1 분 동안 자기 선반에 배치합니다. 여전히 자기 랙, 흡인 추출물에있는 동안.
- 각각의 튜브에 0.75 ㎖의 RIPA 버퍼를 추가합니다. 자기 랙에서 튜브를 제거와 섞어 여러 번 반전. 자기 랙 및 흡인 상층 액에 튜브를 교체합니다. 7 배를 반복합니다.
- 각 관에 0.75 ml의 10 mM 트리스 염산 (산도 7.5)를 추가합니다. 자기 랙에서 튜브를 제거하고 섞어 여러 번 반전. 자기 랙 및 흡인 상층 액에 튜브를 교체합니다. 배를 반복합니다.
- 마지막 세척을 흡입 한 후, 연마를 진행합니다.
참고 : 1 분, 흡인 상등액을위한 자기 랙에 대한 각각의 배양 섹션 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3에서 반응, 15.3, 스핀 튜브 간단히과 장소 후. 0.75 ml의 트리스 염산 (산도 7.5)와 0.75 ㎖의 RIPA 버퍼 및 배 씻을 배.
9. 연마 반응
- 마스터 믹스 계산 (표 11) 연마 작성합니다. 얼음에 1.5 ml의 튜브에 혼합을 연마합니다. 피펫 믹스합니다.
- 마지막 칩 세척이 흡입 직후, 여전히 자기 선반에있는 동안 각각의 샘플 수지에 혼합 연마의 50 μl를 추가합니다. 3 XG에서 30 분 동안 샘플을 품어써모 30 ℃에서.
- 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, A-미행로 이동합니다.
10. 반응을 A-미행
- A-미행 마스터 믹스 계산 (표 12)를 작성합니다. 얼음에 1.5 ML 튜브에서 A-미행 믹스를 확인합니다. 피펫 믹스합니다.
- 즉시 섹션을 연마 한 후, 자기 선반에있는 동안 여전히 각각의 샘플 수지 A-미행 믹스의 50 μl를 추가합니다. 써모 37 ℃에서 3 XG에 30 분 동안 샘플을 품어.
- 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, P7 어댑터 결찰로 진행합니다.
11 P7 어댑터 연결 반응
- 결찰 마스터 믹스 계산 (표 13)를 작성합니다. 결찰이 얼음에 1.5 ML 튜브에 혼합합니다. 피펫 믹스합니다.
- 즉시 섹션 A가-미행 한 후, 48 ㎕의 P7의 결찰 마스터 믹스와 다른 어댑터 인덱스 t의 2 μl를 추가O 각 샘플 수지 자기 선반에 여전히있다. 써모 25 ℃에서 3 XG에 2 시간 동안 샘플을 품어.
주 : 각 샘플에 대한 다른 인덱스의 이용은 더 많은 샘플을 하나의 플로우 셀에서 서열화되는 것을 허용한다. - 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, Φ-29 닉 수리를 진행합니다.
12. 피-29 닉 수리 반응
- Φ-29 마스터 믹스 계산 (표 14)를 작성합니다. 얼음에 1.5 ml의 튜브 Φ-29 믹스를 확인합니다. 피펫 믹스합니다.
- 즉시 P7 결찰 섹션 후 자기 선반에 계속하는 동안, 각 샘플 수지에 Φ-29 믹스 50 μl를 추가합니다. 써모 30 ℃에서 3 XG에 20 분 동안 샘플을 품어.
- 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, 키나제 반응을 진행합니다.
(13) 키나제 반응
- (키나제 마스터 믹스 계산을 작성
- 즉시 Φ 29 부 후에 자기 랙 계속하면서 키나제 50 μL를 각각의 시료를 수지에 혼합하여 추가한다. 써모 37 ℃에서 3 XG에 20 분 동안 샘플을 품어.
- 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, 람다 엑소 뉴 클레아 제 반응을 진행합니다.
14. 람다 엑소 뉴 클레아 제 반응
- 작성 람다 엑소 뉴 클레아 마스터 믹스 계산 (표 16). 람다 엑소 뉴 클레아 제는 얼음에 1.5 ml의 튜브에 혼합합니다. 피펫 믹스합니다.
- 즉시 키나제 부 후에 자기 랙 계속하면서 람다 엑소 뉴 클레아 제의 50 μL를 각각의 시료를 수지에 혼합하여 추가한다. 써모 37 ℃에서 3 XG에 30 분 동안 샘플을 품어.
- 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, RecJ f를 반응을 진행합니다.
15 RecJ F클레아 제 반응
- RecJ f를 마스터 믹스 계산 (표 17)를 작성합니다. 얼음에 1.5 ml의 튜브 RecJ f를 혼합합니다. 피펫 믹스합니다.
- 자기 선반에 여전히 동안 즉시 람다 엑소 뉴 클레아 섹션 후, 각각의 샘플 수지에 RecJ f를 믹스의 50 μl를 추가합니다. 써모 37 ℃에서 3 XG에 30 분 동안 샘플을 품어.
- 8.4 절 후 노트에 설명 된대로 마지막 세척을 흡입 한 후, 칩 용출를 진행합니다.
(16) 용출 및 가교 반전
- 마스터 믹스를 준비 : 샘플 수를 1.5 ml의 튜브 X 1.1 × (200 μL 칩 용출 버퍼 + 1 ㎕의 20 ㎎ / ㎖ 테 K). 각각의 샘플 수지 200 ㎕의 칩 용출 버퍼 + 테 K 마스터 믹스를 추가합니다.
- 응축을 방지하기 위해 가열 뚜껑 써모 65 ℃에서 3 XG에서 밤새 (약 16 시간) 샘플을 인큐베이션.
주 3 : DNA 추출이온 및 어댑터 내고
17. 용출 및 가교 반전 (계속)
- 65 ℃에서 하룻밤 배양 후, 간단히 응축수를 수집하기 위해 샘플을 회전. 1 분 동안 자기 선반에 장소 샘플.
- 200 ㎕의 TE 완충액 (pH 7.5)를 함유하는 새로운 150 ㎖의 튜브에 상청 200 ㎕를 전송.
(18) 페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올 (PCIAA) 추출
- 각 샘플에 이소 아밀 알코올 400 ㎕의 페놀 클로로포름을 추가합니다. 소용돌이 20 초 동안 혼합한다.
- 실온에서 20,000 XG (RT)에서 10 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 새로운 튜브로 위 수성 층의 325 μl를 전송합니다.
참고 : 새로운 튜브에 유기 (하위 계층) 중 하나를 전송하지 않도록주의하십시오. - 각 샘플에 3 M의 NaOAc (산도 5.5) 1 ㎕의 20 ㎎ / ㎖ 글리코겐의 1/10 볼륨을 추가합니다. 다수의 샘플의 경우, 마스터 믹스를 준비한다.
- 각 샘플에 얼음 차가운 100 % 에탄올 3 볼륨을 추가합니다. 와동혼합합니다. -80 ℃에서 15 분 동안 품어.
- 4 ℃에서 20,000 XG에 15 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지해야하고, 상층 액을 가만히 따르다.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하지해야하고, 갓 얼음 차가운 70 % 에탄올을 만들어 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 20,000 XG에 5 분 동안 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 가만히 따르다.
- 45 ℃에서 속도 진공에서 약 20 분 (또는 건조까지)에 대한 건조 펠렛.
참고 :이 프로토콜의 일시 정지 지점입니다. 드라이 DNA 펠렛은 -20 ℃에서 저장 될 수있다. - 반복 DNA 펠렛이 건조 된 펠릿을 볼 수없는 경우에도 영역에 걸쳐 10 μL DDH 2 O. 피펫에 재현 탁 펠릿.
- 샘플의 수에 따라, 새로운 0.3 ㎖의 PCR 용 튜브 랙 8에 각 시료의 10 μl를 옮긴다.
19 P7 뇌관 확장 반응
- 작성 P7 프라이머 확장 마스터 믹스 계산 (표 18). 확장이 얼음에 1.5 ml의 튜브에 혼합합니다. 피펫 믹스합니다.
- 각 10 μL 샘플로 확장 믹스의 10 μL (마이너스 Φ-29 효소)를 추가합니다. 피펫 믹스합니다.
- 30 ˚C까지 템플릿에 어닐링 프라이머로 프로그램 (표 19)를 사용하여 열 순환기의 실행 샘플 단계」를 개최 ".
- 30 ˚C 중 1 ㎕를 Φ-29 효소를 추가 프로그램의 단계」를 개최 ". 피펫 믹스합니다. 프로그램 (표 19)의 나머지 부분을 다시 시작합니다.
(20) 반응을 A-미행
- A-미행 마스터 믹스 계산 (표 20)를 작성합니다. 얼음에 1.5 ML 튜브에서 A-미행 믹스를 확인합니다. 피펫 믹스합니다.
- 각 샘플에 A-미행 믹스의 10 μl를 추가합니다. 피펫 믹스합니다.
- 열 순환기에서, 75 ℃에서 20 분 동안 비활성화 된 열 후 37 ℃에서 30 분 동안 샘플을 품어합니다.
21 P5 어댑터 연결 반응
- 필난 밖으로 P5 어댑터 내고 마스터 믹스 계산 (표 21). 결찰이 얼음에 1.5 ML 튜브에 혼합합니다. 피펫 믹스합니다.
- P5 내고 20 ㎕를 각 시료에 혼합 추가합니다. 피펫 믹스합니다.
- 열 순환기에서, 25 ℃에서 2 시간 동안 샘플을 품어.
(22) 구슬 정리
참고 : 청소 구슬에 제조 업체의 자세한 내용은 자료 섹션을 참조하십시오.
- 새로운 1.5 ML 튜브에 각 50 μL 샘플을 전송합니다.
- 실온에서 15 분 동안 15의 속도 설정에 미니 튜브 회전에 구슬을 정리 재현 탁. 비즈 피펫 팅 전에 정착시키지 말라.
- 샘플 60 μl를 정리 구슬을 추가 (1.2 : 비를 맛볼 수 구슬을 정리 1은보다 짧은 200 염기쌍 인 DNA를 제거하는 것이 중요합니다). 피펫은 20 초 동안 혼합한다.
- RT에서 3 분 동안 15의 속도 설정에 미니 튜브 회전에 구슬을 정리 재현 탁. 간단히 튜브를 회전.
- 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다.오프 피펫과 상층 액을 버린다.
참고 : 그것은 청소 구슬을 빨아 때문에이 부분에 진공 흡입을 사용하지 마십시오. - 그들은 자기 선반에있는 동안 각 샘플에 갓 만든 RT 70 % 에탄올 400 μl를 추가합니다. 혼합하지 마십시오. 기음 뜨는. 배를 반복합니다.
- 실온에서 10 분 동안 청소 구슬을 건조. 구슬의 색깔은 구슬이 건조 할 때 수지 펠렛에서 볼 수 밝은 갈색의 아주 작은 균열에 어두운집니다.
- DNA를 용출, 40 ㎕의 10 mM이 트리스 (산도 7.5)를 추가합니다. 철저하게 20 초 동안 섞어 피펫.
- 1 분 동안 자기 선반에 샘플을 놓습니다. 천천히 피펫 0.3 ml의 PCR 튜브에 36 ㎕의 용출 직접 전송할 수 있습니다.
- -20 ℃에서 PCR 반응 또는 저장 용출액에 직접 진행합니다.
주 4 : PCR 및 젤 분석
(23) PCR
- PCR 마스터 믹스 계산 (표 22)를 작성합니다. PCR 믹스를 확인합니다. 피펫은 매우 부드럽게 피하기 위해 혼합하는거품입니다.
- PCR의 14 μl를 각 36 μL의 DNA 샘플을 혼합 추가합니다. 피펫 믹스합니다. 열 순환기에 넣어 준비가 될 때까지 얼음에 샘플을 유지합니다.
- 긍정적 인 PCR 제어를 들어, 이전에 제조 된 라이브러리를 포함한다. 부정적인 PCR 제어를 위해, 물을 포함한다. PCR 프로그램 (표 23)를 사용하여 열 순환기에서 실행 샘플.
(24) 젤 준비, DNA 절제술 및 시각화
- 철저히 탈 이온수로 적절한 크기의 젤 상자를 씻어. 1.5 % 아가로 오스 겔 준비 60 μl를 수납 할 수있는 두께, 폭 넓은 잘 빗 (포함 0.5 ㎎ / ㎖ 에티 디움 브로마이드).
참고 : 에티 디움 브로마이드 (EtBr이)는 발암 물질이며주의하여 취급해야합니다. - 결로를 수집하기 위해 간단히 PCR 샘플 튜브를 스핀 다운.
- 결합 된 샘플 6 배 크실렌 DNA 염료의 1/5 볼륨을 추가합니다. 이 샘플 DNA와 같은 위치에서 마이그레이션 이후 DNA 염료에 브로 모 페놀 블루를 사용하지 마십시오.
- 전체 샘플 INT를로드O를 각 웰, 바람직하게는 샘플 사이에 빈 우물에.
참고 : 동일한 인덱스 도서관 같은 겔에서 실행되지해야합니다. - 부하 7 μL 샘플의 양쪽에 100 bp의 사다리. 약 30 ~ 45 분 동안 140 V에서 젤을 실행 사다리 브로 모 페놀 염료는 ¾ 방법 젤 아래가 될 때까지.
- 이미지는 낮은 UV 설정에 transilluminator가에 젤을 시각화합니다. 500 bp의 - DNA 단편 (200)를 포함하는 아가로 오스의 섹션을 절제. 125 bp의에서 실행되는 어댑터 다이머 밴드를 절단하지 않도록 매우주의해야합니다.
- 15 ML 튜브에 각각의 절제 젤 슬라이스를 놓습니다. 각 겔 슬라이스의 기록 순 중량. 튜브에 직접 무게를 작성합니다.
- 이미지, 저장하고, 올바른 크기의 범위는 선택한 확인 적출 젤 주석을 달 수 있습니다.
25 젤 정화
- 다음과 같이 수정하여, 제조업체의 지침에 따라 적출 젤 조각에서 DNA를 정화.
- 흔들어 겔 조각을 녹여플랫폼 락에 실온에서. 그것은 용해 약 20 분 소요됩니다.
- 고순도 DNA를 얻기 위해 열을 통과 한 0.5 ml의 버퍼 QG 후 용해 젤 열을 씻는다.
- 5 분 - 버퍼 PE 세척 한 후, 열이 2 RT에 앉아 보자. 실온에서 13,000 XG에서 1 분 동안 스핀.
- 신선한 1.5 ML 튜브에 PCR 반응 마스터 믹스, 40 μl의 EB 버퍼와 용출 샘플을위한 공간을 허용합니다.
26. DNA 정량
- 제조업체의 지침 (표 24)에 따라 샘플을 준비합니다. 광 튜브와 특정 기기에서 측정 샘플.
- 칩 - 엑소 라이브러리 정량되면, 시퀀싱 합성에 의한이 프로토콜의 DNA 어댑터와 호환되는 화학 (16)를 사용하는 플랫폼에서 시퀀싱 제출합니다.
주 : 일반적으로, 샘플 2 μL를 정량 충분하지만보다 시료 농도가 낮은 경우에 필요하다. DNA는 일반적인 산출(50) 200 ng의 사이에 사라져 범위. - 정량화 한 후, 매장 샘플을 -20 ℃에서.
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Representative Results
다음 그림은 여기에 제시된 칩 - 엑소 프로토콜 대표 결과를 보여줍니다. 몇 효소 단계를 기존의 칩-SEQ 방법과는 달리, 칩 - 엑소는 열한 순차적으로 의존 효소 반응 (그림 1)가 필요합니다. 따라서, 치료는 각 반응 성분이 각각의 반응 마스터 믹스에 추가되도록 각 단계에서 수행되어야한다. 우리는 생성 된 표를 인쇄하는 자동 반응 마스터 믹스 계산을 수행하는 반응 테이블에 기초하여 공식화 된 스프레드 시트를 생성하고,이를 마스터 믹스를 첨가 한 후 각 항목을 확인 바랍니다.
우리는 고품질 시퀀싱 결과 (도 2)를 확인하기 위해 프로토콜을 통하여 품질 관리 방법들을 이용한다. 각 칩의 반응은 세 가지 기본 구성 요소가 포함되어 있습니다 : 1) intere의 세포에서 염색질 추출물을 초음파세인트 관심의 단백질에 대해 지시, 2) 항체, 3) ProteinG (또는 ProteinA) 수지를 석출 면역 복합체를 고정화한다. 초음파 조건이 각각의 세포 유형 및 초음파 장비에 최적화되어야하기 때문에 고품질의 초음파 염색질 추출물 (도 2a)를 얻는 것은 매우 어려울 수있다. BP (500) (도 2A, "+"차선) - 최고 품질 라이브러리 (100) 사이의 DNA 단편을 낳는 초음파 결과로 시작하기 때문에이 단계를 최적화 할 시간을 소비 가치가있다. 초음파 처리 추출물이 분명 슈퍼 교대로 그대로 단백질 DNA의 가교가 포함되어 있는지 확인 - 포름 알데히드 가교가 불안정하고 포름 알데히드 자체가 제한된 저장 수명을 가지고 있기 때문에, 우리는 전기 영동 이동성의 변화 분석 (레인 ""그림 2A를) 사용 DNA 단편. 배경 신호를 평가하기 위해 우리는 정기적으로 칩의 반응 항체를 생략는 "모의"칩을 수행합니다. 고품질 칩 전이 경우의 특정 칩 항체에 대하여, 폴 II 대해 지시 -이 O 라이브러리 제제는 "거짓"칩 배경 신호 ( "")가있는 경우, 매우 적은 것이다. 도 2b에서 알 수있는 바와 같이, 기존의 칩-SEQ 라이브러리는 칩 - 엑소보다 실질적으로 더 많은 배경 신호가 있습니다. 마지막으로, 순서, 칩 - 엑소 라이브러리 품질 이전은 bioanalyzer (- D 그림 2C)에 평가된다. 분석 정확하게 라이브러리 크기 분포를 측정하고, 125 bp의 실행 (화살표로 표시) 오염 어댑터 다이머를 검출한다. 어댑터 다이머가 존재하는 경우에는, 시퀀스의 대역폭을 감소시킬 것이다. 따라서, 우리는 효율적으로 DNA 미만 200 bp의 프래그먼트 제거합니다 추가 비드 정리하는 것이 좋습니다.
이 공간적으로 시작, 발산 해결의 유일한 방법 할 수 있기 때문에 칩 - 엑소 일시 중지 및 RNA 중합 효소 II (을)를 연신 강력한 기능 유전체학 기술이다NA 게놈 전체 규모 (그림 3) 11. 이 인접한 결합 이벤트 떨어져 염기쌍 수십 때문에, 칩 서열 수백 염기쌍 해상력 이러한 바인딩 이벤트들을 구별 할 수 없다.
그림 1 : 칩 엑소 도식을. 칩 후, P7 어댑터가 초음파 테두리에 결찰된다. 람다 엑소 뉴 클레아 제는 이에 따라 단백질 DNA 상호 작용을 footprinting에, 가교 지점에 '3'DNA 5 트림. 용출 및 가교 반전 후, 프라이머 확장은 이중 DNA를 합성한다. 마지막으로, P5 어댑터 결찰 좌우 엑소 뉴 클레아 테두리를 표시하고, 생성 된 라이브러리는 높은 처리량 시퀀싱 받는다. 기준 게놈 서열 태그의 5 '말단을 매핑하면 이에 엑소 뉴 클레아 장벽 단백질 DNA의 정확한 위치를 획정가교. 그림 이승만과 퓨 (17)에서 수정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 칩 - 엑소 품질을 제어합니다. 패널 AC는 관련이없는 실험에서 대표적인 결과를 보여줍니다. (A) (HCC1806 인간 유방암 세포주)에서 초음파 처리 염색질 추출물의 품질과 (+)와없는 추출물을 아가 로스 겔 전기 영동으로 평가된다 (-)를 가교 반전. 그대로 가교 속도가 느린 마이그레이션하는 단백질-DNA 복합체의 원인이됩니다. 따라서, 반대로 가교없이 실행 추출물 (-) 성공적인 칩 중요한 평가하는 포름 알데히드 가교 결합의 품질을 허용한다. 모의 IP의 (B) 비교 (-)를차 폴 II (+) 칩 엑소과 PCR 증폭의 21주기 후 칩-SEQ 라이브러리 준비. PCR 후, 200-500 bp의 절제되는 DNA 단편 (적색 해시 박스로 표시) 및 겔 추출 키트를 사용하여 정제 하였다. 패널 C에서 (CD)은, 상부 트레이스 풀링 된 라이브러리 (P1)로부터 이상적인 추적을 나타내고, 하부 트레이스는 어댑터 이량 체를 포함하는 풀링 된 라이브러리 (P2)을 도시한다. 패널 D는 패널 C에서 P1-2 라이브러리 흔적 (화살표 어댑터 이량 체 대역을 의미한다)에 해당하는 DNA 밀도 플롯을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 칩 - 엑소는 공간적으로 고유 양방향 전사 개시 단지를 해결합니다. (A) 가닥-해부의 고른 분포에드 칩 엑소 태그 (5)는 '폴 II에 대한 끝, K562 세포 증식에서 인간의 RPS12 유전자에 TFIIB 및 TBP. (B)은 가장 가까운 나온 RefSeq TSS 주변 칩 엑소 패턴 평균. 모든 TFIIB 점유 걸쳐 피크 쌍 태그는 TSS에 대하여 다음 평균 피크 쌍 농도 값이 10bp 간격 겹치지 비닝 상기 TSS 유전자에 의해 유전자를 정렬 하였다 (N = 6511) 유전자로서 플로팅 하였다 전체의 백분율. TBP 및 TFIIB의 "스파이크"(수직으로 삽입 오프셋 (offset)) 식별 할 수없는입니다. (C) 모델 칩 엑소 (검은 색 트레이스)에 의해 해결 별개의 전사 개시 복합체를 나타내는 패널 B 데이터에 기초. 폴 II는 발산 전사 개시 ( "발산") 및 "일시 중지"사이트의 사이트가 동시에 두 개의 별도의 해석 위치를 점령했다. 폴 II 단지이 명확 공간 분리 발산 성적 증명서는 별개의 개시 단지에서 발생하는 것을 나타냅니다. 대부분의 폴 II 가교 ABO 이 전사를 개시 한 후 일시 정지 할 것으로 예상된다 "일시 중지"사이트에서 TSS의 하류 유타 (50) 염기쌍. 전 개시 복합체 ( "PIC") 형태, 평균적으로는 가능성이 일시 중지 된 사이트에서보다가 적은 시간을 보내는 것을 나타내는 TSS의 상류에 60 bp의 - 폴 II는 대부분의 (20)를 고갈되었다. 이 제안이 폴 II가 모집되면 대부분의 (하지만 반드시 모든)의 경우, 그것은 빠르게 프로모터를 지우고 약 30 일시 중지 상태 가정에 - 폴 II 일시 정지 해제는 관측과 일치하는 TSS의 50 bp의 하류, 전사의 속도 제한 단계. 그 해상도는 수백 염기 쌍으로 제한하기 때문에이 인접 개시 복합체 (회색 채우기 추적에 의해 설명) 칩-서열로 해석 할 수없는입니다. 그림 퓨과 벤터 (11) 수정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 1 M HEPES-KOH (PH 7.5) | (50) | 50 mM의 |
| 5 M NaCl을 | (28) | 140 밀리미터 |
| 0.5 M EDTA | 이 | 1 ㎜ |
| 100 % 글리세롤 | (100) | 10 % |
| 10 % NP40 | (50) | 0.50 % |
| 10 % 트리톤 X100 | (25) | 0.25 % |
| DDH 2 O | 1 L에 작성 |
0.22 μm의 필터를 사용하여 용해 버퍼 (1) 필터 표 1. 레시피. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 보관할 것. 사용하기 직전에 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 1 M 트리스 -HCl (pH를 8) | (10) | 10 mM의 |
| 5 M NaCl을 | (40) | 200 밀리미터 |
| 0.5 M EDTA | 이 | 1 ㎜ |
| 0.5 M EGTA | 1 | 0.5 밀리미터 |
| DDH2 O | 1 L에 작성 |
0.22 μm의 필터를 사용하여 용해 버퍼 2 필터 표 2. 레시피. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 보관할 것. 사용하기 직전에 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 1 M 트리스 -HCl (pH를 8) | (10) | 10 mM의 |
| 5 M NaCl을 | (20) | 100 밀리미터 |
| 0.5 M EDTA | 이 | 1 ㎜ |
| 0.5 M EGTA | 1 | 0.5 밀리미터 |
| 10 % 데 옥시 콜레이트 | (10) | 0.10 % |
| 5g | 0.5 % (W / V) | |
| DDH 2 O | 1 L에 작성 |
0.22 μm의 필터를 사용하여 용해 버퍼 3. 필터 표 3. 레시피. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 보관할 것. 사용하기 직전에 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 10 배 PBS | (50) | 1 배 |
| 소 혈청 알부민 | 2.5 g | 0.50 % |
| DDH 2 O | (500)에 입력 |
차단 표 4. 레시피 완충기. 0.22 μm의 필터를 사용하는 필터. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 보관할 것. 사용하기 직전에 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 1 M HEPES (pH를 7.5) | (25) | 50 mM의 |
| 0.5 M EDTA (pH를 8) | 1 | 1 ㎜ |
| 10 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 | (35) | 0.70 % |
| 10 % NP40 | (50) | 1% |
| 1 M LiCl을 | (250) | 500 밀리미터 |
| DDH 2 O | (500)에 입력 |
RIPA 버퍼 표 5. 레시피. 0.22 μm의 필터를 사용하는 필터. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 보관할 것. 사용하기 직전에 버퍼의 50ml로 100 ㎕의 소비자 물가 지수의 주식을 추가합니다.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 1 M 트리스 - CL (PH 7.5) | 2.5 | 50 mM의 |
| 0.5 M EDTA | 1 | 10 mM의 |
| 20 % SDS | 2.5 | 1% |
| DDH 2 O | (50)에 입력 |
칩 용출 버퍼 표 6. 레시피. 0.22 μm의 필터를 사용하는 필터. 실온에서 보관하십시오.
| 시약 | 양 (㎖) | [결정적인] |
| 1 M 트리스 - CL (PH 7.5) | 0.5 | 10 mM의 |
| DDH 2 O | (50)에 입력 |
TE 버퍼 표 7. 레시피. 0.22 μm의 필터를 사용하는 필터. 4 ℃에서 보관하십시오.
| 볼륨 (μL) | [결정적인] | |
| 100 μM ExA2-IX | (75) | 15 μM |
| 100 μM ExA2-33 | (75) | 15 μM |
| 1 M 트리스 (산도 7.5) | (50) | 100 밀리미터 |
| 5 M NaCl을 | (5) | 50 mM의 |
| DDH 2 O | 295 | - |
| 총 볼륨 | (500) |
표 8. P7 어댑터 어닐링 믹스.
| 볼륨 (μL) | [결정적인] | ||
| 100 μM ExA1-58 | (75) | 15 μM | |
| 100 μM ExA1-13 | (75) | 15 μM | |
| 1 M 트리스 (산도 7.5) | (50) | 100 밀리미터 | |
| 5 M NaCl을 | (5) | 50 mM의 | |
| DDH 2 O | 295 | - | |
| 총 볼륨 | (500) |
| 온도 (C) | 시각 |
| (95) | 5 분 |
| (72) | 5 분 |
| 65 60 램프 하락 | 5 분 |
| 55 50 램프 하락 | 3 분 |
| 45 40 램프 하락 | 3 분 |
| (30) | 3 분 |
| (20) | 3 분 |
| (10) | 3 분 |
| 4 | 영원히 |
표 10. 어댑터 어닐링 프로그램.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | 39.8 | |
| 10 배 반응 버퍼 2 | (5) | 1 배 |
| 100 μM ATP | 0.5 | 1 ㎜ |
| 3 밀리미터의 dNTPs | 1.7 | 100 μM |
| 3 U / μL T4 폴리머 | 1 | 3 U |
| 5 U / μL 클레 나우 | 1 | 5 U |
| 10 U / ㎕의 T4 폴리 뉴클레오티드 키나제 | 1 | 10 U |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 11. 연마 마스터 믹스.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | 42.3 | |
| 10 배 반응 버퍼 2 | (5) | 1 배 |
| 3 mM의 dATP를 | 1.7 | 100 μM |
| 5 U / μL 클레 나우 3'-5 '엑소 마이너스 | 1 | 5 U |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 12. 마스터 믹스를 A는-미행.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | (41) | |
| 100 mM의 ATP | 0.5 | 1 ㎜ |
| 10 배 반응 버퍼 2 | (5) | 1 배 |
| 400 U / μL T4 DNA LIG 손해ASE | 1.5 | 600 U |
| 반응 혼합물 부피 | (48) | |
| 15 mM의 색인 어댑터 | 이 | 30 picomoles |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 13. P7 어댑터 내고 마스터 믹스.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | (41) | |
| 10 배 Φ-29 버퍼 | (5) | 1 배 |
| 3 밀리미터의 dNTPs | 2.5 | 150 μM |
| 10 U / μL Φ-29 효소 | 1.5 | 15 U |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 14. Φ-29 닉 수리 마스터 믹스.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | 43.5 | |
| 100 mM의 ATP | 0.5 | 1 ㎜ |
| 10 배 반응 버퍼 2 | (5) | 1 배 |
| 10 U / ㎕의 T4 폴리 뉴클레오티드 키나제 | 1 | 10 U |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 15. 키나제 반응 마스터 믹스.
| 1 배 (# 956; L) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | (43) | |
| 10 배 람다 버퍼 | (5) | 1 배 |
| 5 U / μL 람다 엑소 뉴 클레아 제 | 이 | 10 U |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 16. 람다 엑소 뉴 클레아 제 반응 마스터 믹스.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | (44) | |
| 10 배 반응 버퍼 2 | (5) | 1 배 |
| 30 U / μL RecJ f를 엑소 뉴 클레아 제 | 1 | 30 U |
| 총 반응 Volume | (50) |
표 17. RecJ F 클레아 제 반응 마스터 믹스.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | 6.45 | |
| 10 배 Φ-29 버퍼 | 이 | 1 배 |
| 3 밀리미터의 dNTP | 1.3 | 200 μM |
| 20 μM P7 프라이머 | 0.25 | 0.25 μM |
| 반응 혼합물 부피 | (10) | |
| EtOH로 침전 된 샘플 | (10) | |
| 총 반응 부피 | (20) |
표 18. P7뇌관 확장 반응 마스터 믹스.
| 온도 (C) | 시각 |
| (95) | 5 분 |
| (65) | 5 분 |
| (30) | 2 분 |
| (30) | Φ-29가 추가 될 때까지 보류 |
| (30) | 20 분 |
| (65) | 10 분 |
| 4 | 영원히 |
표 19. P7 프라이머 확장 프로그램입니다.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | (5) | |
| 삼 | 1 배 | |
| 3 mM의 dATP를 | 1 | 0.1 mM의 |
| 5 U / μL 클레 나우 3 '5'엑소 마이너스 | 1 | 5 U |
| 반응 혼합물 부피 | (10) | |
| 프라이머 확장 샘플 | (20) | |
| 총 반응 부피 | (30) |
표 20. 마스터 믹스를 A는-미행.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| DDH 2 O | 11.5 | |
| 10 배 T4 리가 버퍼 | (5) | 1 배 |
| 15 μM ExA1-58 /13 어댑터 | 이 | 30 picomoles |
| 400 U / μL T4 DNA 리가 | 1.5 | 600 U |
| 반응 혼합물 부피 | (20) | |
| A-꼬리 샘플 | (30) | |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 21. P5 어댑터 내고 마스터 믹스.
| 1 배 (μL) | [결정적인] | |
| 5 배 PCR 버퍼 | (10) | 1 배 (2 밀리미터의 MgCl 2) |
| 각각의 dNTP의 10 mM의 | 1 | 200 μM 각 |
| 20 μM P1.3 프라이머 | 1.25 | 0.5 μM |
| 20 μM P2.1 프라이머 | 1.25 | 0.5 μM |
| 2 U / μL 핫 스타트 중합 효소 | 0.5 | 1 U |
| 반응 혼합물 부피 | (14) | |
| 구슬 용출 샘플 | (36) | |
| 총 반응 부피 | (50) |
표 22. PCR.
| 온도 (C) | 시각 | 사이클 |
| 98 | 30 초 | 1 |
| 98 | 10 초 | 15-21 (칩 효율에 따라 다름) |
| (52) | 30 초 | |
| (72) | 20 초 | (72) | 2 분 | 1 |
| 4 | 영원히 | 보류 |
표 23. PCR 프로그램입니다.
| 당 DNA 표준 (μL) | 샘플 당 (μL) | |
| 1 : 200 희석 버퍼 / 염료 혼합 | (190) | 198 |
| DNA 표준 | (10) | |
| 칩 - 엑소 라이브러리 | 이 | |
| 총 볼륨 | (200) | (200) |
표 24. 정량화.
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Discussion
우리는 염색질 근처 염기쌍 해상도 편견, 게놈 차원의 방식으로 단백질 상호 작용에 대한 정확한 결합 위치를 결정하기 위해 기능 유전체학 프로토콜을 제시한다. 면역 침전이 자성 수지에 남아있는 동안 근처 염기쌍 매핑 해상도를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 칩 - 풍부 DNA의 엑소 뉴 클레아 제 처리이다. 표면 상, 단백질 복합체는 잠재적으로 주어진 서브 유닛 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링 복합체 또는 뉴 클레오 코어 입자)의 생체 배출량 측정을 차단할 수 있습니다. 포름 알데히드 가교제 비효율적이기 때문에,로가 이전에보고 된 10, 그것은 더욱 복잡한 다중 소단위는 DNA에 가교 것 같지는 같은 궤적에서 동일 셀 내의 서로된다. 따라서, 이러한 뉴 클레오의 개별 히스톤 서브 유닛과 같은 단백질 복합체의 개별 서브 유닛의 생체 배출량 측정에서, 칩 - 엑소 가능합니다.
t는 "> 칩 - 엑소의 가장 주목할만한 장점이 근처 염기쌍 해상도와 낮은 배경입니다. 울트라 높은 해상도는 다른 방법으로 현재 가능하지 게놈 전체의 규모로 만들어 질 상세한 구조 및 공간 통찰력을 허용 . 한편, 칩 엑소의 주요 한계는 마스터하는 기술적 도전 분자 생물학 방법 때문이다. 또한, 칩 공정의 일반적인 한계는 칩 엑소 (예를 들면, 상업적인 항체의 가용성 특이 적용 세포의 에피토프의 접근성, 비교적 다수 따라서 초음파 조건이주의 깊게 최적화되어야한다. 일반적인 실수가 아닌 칩 등급 항체를 사용하고, 가능한 한 얼음에 샘플을 유지하지 않는 불량 초음파 추출을 포함한다.)가 필요하고 각 이전과 같이 검증 항체는 이러한 매개 변수는 실험 결과에 미칠 수있는 악영향을 방지하기 위해 (18)을 설명했다.한약 20 백만 고유 정렬 읽기에 대한 전사 인자의 대상에 대한 순서 깊이, 우리는 일반적으로 목표로하고 있습니다. 폴 II와 히스톤 수정이 더 광범위하게 분산되어 있기 때문에, 우리는 30 읽 만 50 목표. 이 칩은 칩 엑소 서열보다 실질적으로 더 적은 배경을 갖기 때문에, 이하 유사한 깊이 시퀀싱을 달성하기 위해 필요한 읽는 것이 중요하다.
원래 프로토콜에 강력한 변화가 17,19,20를 게시 할 계속 칩 엑소 기술은 현재 널리, 기술적 어려움에도 불구하고 채택되고있다. 특히 칩 단백질 곤란 위해 유용 할 수있는 하나의 변화는 라이브러리 (20)의 제조 효율을 증가시키는 하나의 결찰 단계를 사용하여 칩 넥서스 불린다. 요약하면, 칩 - 엑소는 세계적인 규모 염색질 상호 작용하는 단백질의 초 고해상도 매핑에 점점 더 사용하고 강력한 방법입니다. 시중에서 판매하는 칩 수준의 개미의 목록으로ibodies이 성장을 계속하고, 칩 엑소 방법론 미래 애플리케이션은 매우 높은 해상도의 셀의 분자 회로를 이해할 매핑 미지 유전자 조절 네트워크에 지시한다. 또한, 칩 - 엑소 가능성이 더 정제 될 근처 염기쌍 해상도 생체 단백질 RNA 상호 작용을 풋 프린트하도록한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 26 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (2011).
- Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
- Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling. Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).
- Cho, S., et al. The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).
- Katainen, R., et al. CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer. Nat Genet. 47, 818-821 (2015).
- Murphy, M. W., et al. An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination. Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).
- Zere, T. R., et al. Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems. PLoS One. 10, e0145035 (2015).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes. Nature. 483, 295-301 (2012).
- Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome. Cell. , 1377-1388 (2014).
- Pugh, B. F., Venters, B. J. Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes. PLoS One. 11, e0149339 (2016).
- Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework. Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS computational biology. 8, e1002638 (2012).
- Bardet, A. F., et al. Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution. Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).
- Wang, L., et al. MACE: model based analysis of ChIP-exo. Nucleic Acids Res. 42, e156 (2014).
- Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24 (2012).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).
- Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol. 14, R147 (2013).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).
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