Cancer Research

הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Published: February 20, 2017 doi: 10.3791/55027

Richard Wang¹, Harris Wang¹, Zhixiang Wang¹

¹Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Introduction

הגורם המוביל לתמותה מסרטן השד הוא באמצעות גרורות ^{^1,} ^2. Taxanes, כגון docetaxel ו- paclitaxel, משמש כיום כקו ראשון משטר לטיפול בסרטן השד גרורתי ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^6. הם חלק מהקבוצה של סוכני מיקוד-microtubule (MTAs) משבשי דינמיקת microtubule. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר באמצעות taxanes בטיפול מרפא הוא הפיתוח של התנגדות taxane בתאים סרטניים, אשר מובילה למחלות ישנות ^7. עמידות לתרופות אחראית ליותר מ -90% מכלל מקרי המוות בקרב חולי סרטן שד גרורתי ^7.

Microtubules נוצרות על ידי פילמור של heterodimers α- ו β טובוליןclass = "Xref"> ^8, ^9. ההתקנה המדויקת של דינמיקת microtubule חשובה תפקודים תאיים רבים, כולל קיטוב תא, התקדמות מחזור התא, תחבורה תאית, ואיתות תא. חוסר וויסות של microtubules והדינמיקה שלהם ישבש תפקוד התא לגרום מוות של תאים ^{^10,} ^11. תלוי איך הם לגרום חוסר וויסות זה, תרופות MTA ניתן לסווג גם כסוכני ייצוב microtubule (כלומר, taxanes) או סוכני microtubule-destabalizing (כלומר, אלקלואידים וינקה או באתר קולכיצין סוכנים מחייב) ^20. למרות ההשפעות שלהם הפוכות על מונית microtubule, במינון מספיק, כיתות שניהם יכולות להרוג תאים סרטניים באמצעות השפיע על דינמיקת microtubule ^21.

Taxanes לתפקד בעיקר על ידי ייצוב microtubule ציר ^12, המובילחוסר תיאום כרומוזומליות. ההפעלה התמידית הבאה של מחסום הרכבת ציר (SAC), עוצרת את תא מיטוזה. מעצר mitotic ממושך ואז גורם לאפופטוזיס ^{^13,} ^14. Taxane אינטראקציה עם microtubules דרך האתר taxane מחייב על β טובולין ^{^8,} ^15, אשר שוהה רק טובולין התאספו ^16.

מנגנונים מרובים להתנגדות taxane הוצעו ^{^9,} ^17. מנגנונים אלה כוללים הן התנגדות multidrug כללית בשל ביטוי יתר של חלבונים-בזרימת סמים taxane ספציפי התנגדות ^{^5,} ^{^9,} ^{^18,} ^19. לדוגמא, תאים סרטניים עמיד taxane יש בו כדי לשנות ביטוי ותפקוד של β-גיגית מסוימתulin isotypes ^{^5,} ^{^9,} ^{^19,} ^{^20,} ^{^21,} ^{^22,} ^23. באמצעות שיטה in vivo למדוד חוסר יציבות microtubule דינמי, אנו מראים כי, כאשר בהשוואה ללא-עמיד, תאי _CC MCF-7 הוריה ^17, דינמיקת microtubule של תאי docetaxel העמיד MCF-7 _TXT הן רגישה לטיפול docetaxel.

כדי להבין טוב יותר את הפונקציה של MTAs ואת המנגנון המדויק של התנגדות taxane בתאים סרטניים, זה הכרחי למדוד דינמיקת microtubule. כאן אנו מדווחים שיטה in vivo לעשות זאת. באמצעות הדמיה חיה בשילוב עם ביטוי של טובולין-tagged GFP בתאים, אנו יכולים למדוד את הדינמיקה microtubule של _TXT MCF-7 ותאי _CC MCF-7 עם ואינטרנטthout טיפול docetaxel. התוצאות יכולות לעזור לנו לעצב תרופות יעילות יותר שיכול להתגבר על התנגדות taxane.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים עבור הדמיה חיה

תרבות זריעת תאים
1. השתמש תאי סרטן השד MCF-7 נבחרו להתנגדות docetaxel (MCF-7 _TXT) וקו תא ההורים שאינם העמיד שלהם _(CC MCF-7). תהליך הבחירה מפורט לאפיון שורות תאים שנבחרו אלה תוארו בעבר ^24.
2. לגדול כל תאים בצלחות תרבות 10 ס"מ על 37 מעלות צלזיוס במדיום מורכב 90% של המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו -10% בסרום שור העובר (FBS) שיושלם עם חומצות אמינו לא חיוניות. לשמור על המדיום באווירה ₂ 5% CO. שמור על תאי _TXT MCF-7 ב 5 docetaxel ננומטר.
3. תאי זרע על coverslips הדמיה לחיות. לעקר 24 מ"מ coverslips זכוכית מצופה פולי- L- ליזין על ידי שטיפה אותם עם אלכוהול 70% ולאחר מכן לחשוף אותם UV למשך הלילה. מניחים את coverslips לתוך צלחת תרבות 6-גם של 35 מ"מ. Plאס coverslip אחד בכל טוב.
4. הסר את המדיום מצלחת התרבות של 10 ס"מ לשטוף את התאים עם PBS. הוסף 0.5 מ"ל של טריפסין-EDTA כדי בצלחת כדי לנתק את התאים מצלחת. הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבות צלחת לנטרל את טריפסין בעקבות ניתוק של התאים.
5. ספירת התאים עם hemocytometer כדי לקבוע את מספר הסלולרי ליחידת נפח.
6. להוסיף כ 10 ⁵ תאים לכל מבוסס היטב על המספר הנייד ליחידת נפח. אחרי שלחצתי אותו בעדינות, לשים צלחת בחזרה לתוך החממה כדי לאפשר לתאים לצרף את coverslips.
הביטוי של טובולין α GFP-tagged
1. כדי assay דינמיקת microtubule, transduce התאים עם GFP-tagged α-טובולין באמצעות שלט תמרת GFP המסחרי (למשל, BacMam) על פי הפרוטוקול של היצרן.
2. תרבות תאי הבאר במשך 36 שעות בתוך חממת תרבית תאי 37 ° C כדי לאפשר comהידבקות plete ו מפגש 60%.
3. חשב את הנפח המתאים של GFP-tagged α-טובולין להוסיף כל טוב, על פי המשוואה הבאה:
  
  מספר התאים הוא המספר הכולל המשוער של תאים היטב בעת תיוג ואת PPC הרצוי הוא מספר חלקיקים לכל תא.
  הערה: מתזמנת את תאי MCF-7 צריכה הכפילה את ספירת התאים מ 10 ⁵ 2 x 10 ⁵ עם PPC רצוי של 20, נפח דרושים כל coverslip לכן 40 μL. עבור תאים שונים, היקף מחושב על בסיס הנוסחה לעיל לא יכול להיות הטוב ביותר. ההיקף המדויק צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הביטוי בפועל של טובולין GFP.
4. מערבבים את פעמים טובולין-α GFP-tagged כמה על ידי היפוך כדי להבטיח פתרון הומוגני. לא מערבולת.
  הערה: לקבלת השליטה, Null (שליטה) מגיב חסר כל גנטי יונקיםאלמנטים וניתן להשתמש בו כדי לקבוע אפקטי קרינת רקע baculovirus בתיווך פוטנציאליים. פקד תמרת GFP הלא ממוקדת עשוי לשמש גם, אשר יאיר את התא כולו.
5. החלף את מדיום התרבות עם מדיום חדש. הוסף 2 מ"ל של מדיום חדש ו -40 μL של ה- GFP-tagged α-טובולין היטב כל אחד.
6. לנער את הצלחת בעדינות כדי לאפשר ערבוב מלא של טובולין-α GFP-tagged עם המדיום לתרבות. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור תרבות דגירה במשך 24 שעות כדי לאפשר את הביטוי של טובולין GFP.
תאי Treat עם docetaxel
הערה: ניסוי זה היא לבדוק את ההשפעה של docetaxel על חוסר יציבות microtubule דינמי. לפיכך, תאי מטופלים עם הריכוז הרצוי של docetaxel.
1. הכן בינוני מורכב 90% של DMEM ו -10% של FBS שיושלם עם חומצות אמינו לא חיוניות. השתמש DMEM ללא פנול אדום בגלל פנול אדום עלולים להפריע fluorescence של טובולין GFP. מוסיפים את הריכוז הרצוי של docetaxel (הנעים בין 10 ננומטר ל -10 מיקרומטר). פתרון המניות של docetaxel הוא 10 מ"מ ב sulfoxide דימתיל (DMSO).
2. טרום לחמם את המדיום המכיל docetaxel עד 37 ° C בחממה בתרבית רקמה.
3. החלף את מדיום התרבות הנורמלי עם המדיום המכיל docetaxel דגירה במשך 30 דקות ב בתרבית רקמת החממה. לא צריך להיות לפחות 3 coverslips לכל טוב עבור כל ריכוז docetaxel.

2. הדמיה חיה לבדיקת חוסר יציבות microtubule דינמי

הגדרת המערכת
1. בצע ניסויים בתא שמור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לרכוש תמונות קרינה על ידי זמן לשגות עם מערכת מיקרוסקופית מצויד בעדשה אובייקטיבית 60X, 1.42 NA שמן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת CCD.
2. הגדר את תאי הדמיה לחיות. טרום חם הוא לבעל המדגםהמדיום ל -37 מעלות צלזיוס. בחר coverslip לבחון. הר coverslip ריבית על בעל מדגם דגירה זה עם 1 מ"ל של מדיום המכיל-docetaxel מוכן בשלב 1.3.1.
הדמיה חיה של חוסר יציבות microtubule דינמי
1. זהה את התאים אשר ישמשו הדמיה. הם צריכים להיות שטוחים, יש עוצמת קרינה גבוהה של GFP-טובולין באו לידי ביטוי, ויש מבני microtubule ברורים.
2. בחר תא אחד מהקבוצה של חוליות מזוהות משלבים 2.2.1 לבחון תחילה. דגש על אזור הפריפריה של התא המזוהה. הגדר את התכנית עבור זמן חשיפה ואת תדירות רכישה של תמונה. ככל שזמן חשיפה הוא בדרך כלל 0.5 s, התמונות תירכשנה כל שתי שניות.
3. לאפשר 20 דקות נוספות עבור צעדים מן 1.33 ל 2.2.3. לכן, בדיוק 50 דקות לאחר תוספת של docetaxel, כמתואר בשלב 1.3.3, להתחיל הדמיה (זה סטנדרטיזציה).
4. רשום את ד microtubuleynamics למשך 2 דקות, מצלם כל 2 שניות. בסך הכל, לרכוש 60 תמונות עבור התא המזוהה.
5. העבר אל התא הבא מזוהה וחזור על שלבים 2.2.2 עד 2.2.4. חזור על התהליך עד 5 תאים כבר צילמו. זה הכרחי כדי לעשות זאת לפני הזמן מגיע 70 דקות לאחר התוספת של docetaxel, כמתואר בשלב 1.3.3.
6. עבור כל תנאי הטיפול, חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.2.5 3 coverslips שונים. בסך הכל, תאי 15 תמונה, וזה מספיק נתונים כדי למדוד חוסר יציבות microtubule דינמי.

3. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

Deconvolution של תמונות
1. Deconvolve התמונות רכשו להשיג באיכות גבוהה. פתח את תכנית deconvolution מצוידת במערכת מיקרוסקופ.
2. לחץ על "תהליך" ובחר "deconvolve." גרור את קובץ התמונה אל החלון "קלט" ולחץ על "Do." קובץ התמונה יהיה deconvolved, ואתקובץ deconvolved יישמר כקובץ חדש באופן אוטומטי.
דור של קטעי וידאו
1. לחץ על קובץ תמונת deconvolved לפתוח עם תוכנה מאובזרת.
2. לחץ על "קובץ" ובחר "שמירה בשם הסרט." בחר "פורמט הסרט" כמו "AV" ואת "סגנון האנימציה" כמו "קדימה". בחר את "איכות הדחיסה" ל "100%" ואת "קצב הפריימים" ל "5 / שני."
3. סמן את התיבה של "הנפשת בזמן" ולחץ על "עשה זאת." הקליפ יופק.
מדידת קיצור microtubule ושיעור הצמיחה
1. זהה את microtubules אשר ישמש למדידה. עבור כל תא, רק כמה microtubules תוכל להיות הקיצור או הצמיחה שלהם בעקבות ברור ומלא.
2. לבחון כל מסגרת של וידאו כדי לזהות את המסגרת המציגה את אורך ההתחלה של א microtubulend המסגרת עם microtubule המורחבת ביותר או מקוצר. מודד את השינוי באורך בין שני microtubules ואת הזמן שחלף בין שתי המסגרות.
3. חשב את קצב צמיחה או קיצור ידי חלוקת השינוי באורך ידי זמן (היחיד הוא מיקרומטר / s). עבור כל תנאי הטיפול, אחרי לפחות 10 תאים ולמדוד לפחות 20 microtubules.
4. חשב את הממוצע ואת סטיית התקן עבור כל תנאי הטיפול. נתח את הבדל סטטיסטי בין תנאי שימוש במבחן הסטודנטים. דווח על הנתונים בטבלה ו / או בתרשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המובא כאן, חקרנו את ההשפעות של docetaxel על הדינמיקה microtubule של הנורמה _(CC MCF-7) ו- docetaxel עמיד (MCF-7 _TXT) תאי סרטן השד. שני סטים של תמונות להראות את ההשפעות של docetaxel (0.5 מיקרומטר) על צמיחה microtubule וקיצור ב _CC MCF-7 ו MCF-7 תאים _TXT (איור 1 א).

אנחנו גם לחשב את שיעור הצמיחה microtubule או קיצור בתנאים אלה עבור שתי שורות תאים והראה כי ברמה של 0.5 מיקרומטר, docetaxel מאוד מעכב את הדינמיקה טובולין של תאים _CC MCF-7 אבל לא MCF-7 תאים _TXT (איור 1B).

איור 1: השפעות של Docetaxel על Dynamic microtubuleים של _TXT MCF-7 תאים _CC MCF-7. הדמית החיה בוצעה כמתואר. (א) תמונות נבחרות מן הדמיה חיה של הדינמיקה microtubule ב _CC MCF-7 ותאי MCF-7 _TXT לאחר טיפול עם 0.5 מיקרומטר docetaxel במשך 1 שעה. החץ מציין את microtubules ההארכה. ראש החץ מצביע על microtubules הקיצור. גודל בר = 5 מיקרומטר. (ב) שיעור ההארכה וקיצור שיעור microtubules נמדדו מהתמונות המוקלטות. נתון כל הוא ממוצע של 20 מדידות מלפחות 8 תאים שונים. הבר השגיאה הוא סטיית התקן. ** מציין כי ההבדל הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית, עם p <0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנן שתי שיטות עיקריות למדידת חוסר יציבות microtubule דינמי: במבחנה in vivo. בשיטה במבחנה, טובולין מטוהר משמש למדידת חוסר יציבות microtubule דינמית עם מיקרוסקופיה מחשב משופר זמן לשגות הפרש התערבות ניגודיות. בשיטת in vivo, microinjected טובולין ניאון, או הביע GFP-טובולין, הוא שולב microtubules. הדינמיקה (צמיחה וקיצור) של microtubules נרשמת לאחר מכן על ידי זמן לשגות באמצעות מצלמה רגישה באזור הפריפריה של תאים שלב ^{^10,} ^{^20,} ^25. בעוד סוגים של מיקרוסקופים שונים שימשו למטרה זו, פרוטוקול דיווחנו כאן משתמש במיקרוסקופ deconvolution.

בשנת vivo, חוסר יציבות דינמית מתרחשת רק microtubule בתוספת הקצוות (הקצוות עם β טובולין פונה כלפי חוץ), ואילוהקצוות מינוס (הקצוות עם טובולין α פונה כלפי חוץ) להישאר באותו אורך ^26. מצד שני, עבור microtubules התאספו במבחנה, חוסר יציבות דינמית מתרחשת בשני הקצוות של microtubules, עם הקצוות בתוספת להיות יותר חזקים מאשר מינוס מסתיימת ב ^-27. היתרון העיקרי של ניתוח אי יציבות דינמית במבחנה הוא בכך שהוא מספק מידע מכניסטית על התפקיד הספציפי של סוכנים שונים על דינמיקת microtubule בהעדר מפות הסלולר. יתר על כן, בתנאים במבחנה, חוסר יציבות דינמית ניתן ללמוד בשני קצותיו. זה מספק תובנה על המנגנונים שבאמצעותם תרופות או חלבוני בקרה להשפיע יציבות microtubule בשני הצדדים. מבחינה הסטורית, את קצות מינוס מתבצעים מעקב אחר הרבה פחות בתוספת מסתיימת ^10. חלק גדול הבנתנו התנהגות microtubule מגיע ממחקרים על microtubules המורכב מ טובולין מטוהר במבחנה. עם זאת, בעוד שרבים מן העקרונות הבסיסיים של התנהגות microtubule צבר ממחקרים אלה יכולים לחול גם על microtubules בתאים, ישנם הבדלים מסוימים הדינמיקה microtubule בין במבחנה in vivo. בתאים, microtubules לרוב גדלים בכל חמש עד עשר לקפל בקצב מהיר, ומעברים בין צמיחה ו / או קיצור להתרחש ~ 10 פעמים בתדירות גבוהה יותר מאשר עם microtubules המורכב מ טובולין מטוהרים במבחנה. ישנם גם שינויים דרמטיים ארגון microtubule ודינמיקה לאורך כל מחזור התא, אשר משקפות רמה גבוהה של רגולציה במרחב ובזמן של התנהגות microtubule הסלולר. התנהגות זו לא ניתן ללמוד על ידי מחקר במבחנה. יתר על כן, הסדרת הדינמיקה microtubule מושגת על ידי שינוי posttranslational טובולין, ביטוי אלוטיפ טובולין, וקבוצה גדולה של מפות חלבונים אינטראקציה-microtubule אחרים אשר לייצב או לערער מיקרוtubules ^{^28,} ^29. לכן, לומד חוסר יציבות microtubule בתאים חיים הרבה יותר מבחינה פיזיולוגית רלוונטי.

השיטה המתוארת כאן היא פרוטוקול פשוט מאוד אמין ללמוד דינמיקת microtubule בתאים חיים. השלבים שדורשים יותר תשומת לב הם הבחירה של התא לצורך השגחה וקביעת זמן החשיפה. זה קריטי כדי לבחור תאים הם שטוחים יש עוצמת קרינה גבוהה של טובולין GFP. זה גם רצוי כדי להפחית את עוצמת עירור את זמן החשיפה כדי למנוע דהייה של הקרינה GFP. אין ספק, כמו כל האחרים שיטות vivo, פרוטוקול זה אינו מתאים ללמוד חוסר יציבות microtubule דינמי בתנאי מניפולציות שונים. לדוגמה, isoforms שונים של טובולין β α- ו עשויים להתנהג באופן שונה מבחינת הדינמיקה microtubule. רק בשיטות במבחנה יכול לשמש sTudy את ההשפעות של isoforms טובולין מטוהרים הפרט על חוסר יציבות דינמית microtubule. יתר על כן, בהשוואה microinjection של טובולין הקרינה שכותרתו, הביטוי של טובולין-tagged GFP ידי transfection או התמרה של פלסמידים עשוי להפגין נמוך יחסית יחס אות לרעש. עם זאת, הביטוי של טובולין-tagged GFP בתאים על ידי transfection או התמרה של פלסמידים מאפשר יותר חופש לשנות מאפיינים תאיים אחרים באופן ניסיוני.

הפרוטוקול דיווח כאן יוכל לשמש עבור מחקרים שונים. מצד אחד, הוא יכול לספק תובנות רומן וביקורתיים לגבי הפונקציה של microtubules במהלך שלבים שונים של מחזור התא, במיוחד מיטוזה. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של תהליכים תאיים שונים, כגון הגירה, על דינמיקת microtubule. מצד שני, זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי microtubule שונים (רבים מהם הם תרופות נגד סרטן) על הדינמיקה microtubule ב נורמליתאים סרטניים בתנאים פיסיולוגיים יותר. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור את ההשפעות של תרופות נגד סרטן אנטי mitotic השונים על חוסר יציבות דינמית microtubule בשני תאי docetaxel העמידים ובלתי docetaxel עמיד סרטן השד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Non-essential amino acids	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM phenol red-free	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent BacMam 2.0 GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	Key reagent for expressing GFP tubulin in cells
CellLight Reagent BacMam 2.0 GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich+B9:AA9	472301	for dissoving decetaxel
22-mm glass coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
6-well culture plate	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25200056
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific	Hausser Scientific, Distributed by VWR	Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172