Protocol
Få godkjenning for bruk av humane prøver av forskningsetiske brett / Institutional Review Board, og få signert samtykke fra alle menneskelige givere. MMA kan også utføres ved hjelp av muse PBMC på en lignende måte som den menneskelige analysen, etter bruk dyr etikk godkjenning. MMA benytter aseptiske vevskulturteknikker.
MERK: Se figur 1.
MERK: Selv om vi anbefaler bruk av en nivå 2 biocontainment skap under analysen for å opprettholde aseptisk teknikk, som metoden er bare et "kortsiktig" kultur-metoden, det er egentlig ikke nok tid for bakterier å forurense analysen. Derfor, hvis en nivå 2 biocontainment skapet ikke finnes, i stedet for å kjøpe en bare for denne analysen, assayet kan utføres utenfor en biocontainment kabinett, på en åpen benk. Bruken av en 37 ° C inkubator med 5% CO2, men er ikke et alternativ, og må brukes foroptimale resultater.
1. perifere mononukleære blod Cell Isolation
- Skaff humant fullblod fra en frisk donor eller en pasient via venepunksjon ved hjelp vacutainers inneholder syre-citrat-dekstrose (ACD) antikoagulerende (gul-topp rør).
MERK: Fullblod kan lagres i ACD ved romtemperatur (18-22 ° C) i opptil 36 timer før du går videre til neste trinn 11. Normalt 1-2 10-ml vakuumrør av helblod er tilstrekkelig for analysen. - Fortynn den fullblod 1: 1 volum / volum i varm komplett RPMI-medium (RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum, 20 mM HEPES, og 0,01 mg / ml gentamicin).
- Isoler perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra fortynnet fullblod ved hjelp densitetsgradientsentrifugering, som anbefalt av produsenten (se liste over Materials). Lag det fortynnede blodet meget langsomt i løpet av densitetsgradienten (oppvarmet til romtemperatur, 18-22 ° C).
MERK: Minimer mengden av Mixing ved grenseflaten for optimal separasjon av blod ved forsiktig lagdeling blodet blandingen i en dråpevis måte eller ved hjelp av en pipette.- Tillat blodet blandingen langsomt lag over toppen av densitetsgradienten ved å plassere pipettespissen nær densitetsgradienten og ved at blodet blandingen kan renne ned langs siden av røret meget langsomt.
- Alt etter omfanget av forsøket, laget 10 ml blod blanding på toppen av 3 ml densitet-gradient (i en 15-ml tube) eller lag 35 ml blod blanding på toppen av 15 ml densitet-gradient (i en 50-mL rør). Typisk 10 ml fullblod gir 10 millioner PBMC, med noen donor til donor variasjon.
Merk: Det er meget viktig at det ikke forekommer noen blanding av blodet blanding med densitetsgradienten. Blodblandingen bør lag over den densitetsgradient og langsomt stiger inntil alt blodet er på toppen av densitetsgradienten. - Sentrifuger den lagdelte blandingen ved 700 xg i 30 minutter uten bremser. den centrifuged blandingen bør skilles i 5 lag (fra topp til bunn): plasma, buffy coat (som inneholder PBMC), tettshetsgradient materielle, granulocytter, og RBC.
- Fjern og kast det meste av plasma og nøye hente buffy coat (PBMC) innhold i en ny 15-ml tube ved hjelp av en Pasteur pipette og en sugekilden.
MERK: Fjerning av buffy coat-laget er effektivt gjøres ved å anvende suging på den Pasteur pipette mens de utfører en sirkulær bevegelse rundt utsiden av laget, med spissen av pipetten mot røret.
- Vask de isolerte PBMC tre ganger i pH 7,3 fosfat-bufret saltvann (PBS) ved sentrifugering ved 350 xg i 10 min (med full brems) i mellom hver vask. Rekonstituere PBMC pellet i fullstendig RPMI medium. Avhengig av størrelsen av pelleten, 3-7 ml av mediet er tilstrekkelig.
- Tell PBMC ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer. Bare telle disse cellene som ikke er farget av trypanblått. Reconstitute de PBMC til 1.750.000 celler / ml i fullstendig RPMI medium.
- Frø 400 ul (700.000 celler) i hver brønn av en 8-kammer lysbilde. Inkuber objektglasset i en 37 ° C, fullt ut fuktet vevskulturinkubator (supplert med 5% CO2) i 1 time for å tillate at monocytter / makrofager til å følge.
2. Forbehandling av levd Monocytter
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis du leter etter måter å hemme eller forsterke fagocytose.
- Pre-treat levd monocytter med noe narkotika (e) eller forbindelsen (e) av interesse. Rekondisjonering av medikamentet (e) eller annet testmaterialet til den ønskede konsentrasjon ved hjelp av fullstendig RPMI-medium.
NB: For eksempel er 200 ug / ml av IVIG vanligvis brukes for å gi en 95-100% inhibering av fagocytose ved bruk av humane monocytter. - Aspirer og kast supernatant inneholdende ethvert ikke-heftende celler fra den 8-kammeret lysbilde etter en-timers inkubasjon (etter trinn 1.6). Bytt den ut med 400ul av et medikament eller en annen behandling og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Når aspirere og erstatte løsninger i 8-kammer lysbilde, sørg for å styre strømmen av væsker, slik at svakt levd cellene ikke løft av. Dessuten arbeider med bare 2-3 tomme brønner i en tid og unngå tørking av brønnene.
MERK: Vanligvis er hver behandling utføres i tekniske triplicates.
- Når aspirere og erstatte løsninger i 8-kammer lysbilde, sørg for å styre strømmen av væsker, slik at svakt levd cellene ikke løft av. Dessuten arbeider med bare 2-3 tomme brønner i en tid og unngå tørking av brønnene.
3. opsonisering av R 2 R 2 røde blodlegemer
MERK: R2 R2 er brukt her er hentet fra Blodprøvetaking Senter (Canadian Blood Services), men de er også kommersielt tilgjengelig. Opsonisert R2 R2-RBC-er brukt som en positiv kontroll for FcγR-mediert fagocytose. Naive R2 R2 bør lagres i Alsever løsning (for å forlenge holdbarheten) ved 4 ° C i opptil en måned. Alsever løsning er gjort i huset og består av 0,8% Vekt / volum trinatriumcitrat (dihydrat), 1,9% w / v glukose, 0,42% vekt / volum natriumklorid, og 0,05% vekt / volum sitronsyre (monohydrat). Hvis R 2 R 2 celler ikke er tilgjengelige, andre Rh-fenotypiseres celler, slik som R 1 R 2 R 1 R 1, R 1 R, eller R 2 R, kan anvendes.
- Vask R2 R2 (CDE / CDE) røde blodlegemer i PBS totalt tre ganger med sentrifugering ved 350 xg i 5 min hver.
MERK: Mengden av RBC som trengs avhenger av den eksperimentelle størrelse og kan være back-beregnet. Vask alltid et overskudd av RBC-er, ettersom RBC-er går tapt ved hver vask på grunn av lysis eller under fjerning av supernatanten. For eksempel, i et forsøk med 5 behandlinger og 2 kontroller, alle utført i tekniske triplicates, det er totalt 21 brønner. 21 brønner med 400 pl / brønn av 1,25% RBC blanding indikerer at 105 ul av pakket, opsonisert RBC er nødvendig. 200 ul av RBC bør innledningsvis vaskes og 150 & #181; L bør opsonisert for å sikre at det er en tilstrekkelig mengde av RBC for fagocytose trinnet. - Opsonisere den vaskede R2 R2 pellet med 1: 1 volum / volum av polyklonale anti-D-antistoffer fra humant serum og inkuberes i 1 time ved 37 ° C med leilighetsvis blanding.
MERK: Hvis polyklonale anti-D-antistoffer ikke er tilgjengelig, er det mulig å bruke monoklonale anti-D-antistoffer, som er kommersielt tilgjengelige, eller anti-D som normalt brukes for Rh immune profylakse, som kan fås fra blodbanker eller transfusjon tjenester. Optimalisering testing bør gjennomføres i begynnelsen, når du setter opp analysen, og når du bytter masse un-titered polyklonale antistoffer eller bytte til et monoklonalt antistoff. Dette er for å identifisere den optimale konsentrasjonen eller volumet av anti-D som er nødvendig for en antiglobulin test (IAT) produktet av mellom 3+ og 4+ og et fagocytose resultat på mellom 70-90 fagocytterte RBC per 100 monocytter telles. - Vask opsonisered R 2 R 2 til sammen tre ganger i PBS ved hjelp av sentrifugering ved 350 xg i 5 min hver.
MERK: Vellykket opsonization av R2 R2 kan bekreftes ved å utføre en indirekte IAT. I korthet, blir sekundære polyklonale anti-humane antistoffer tilsatt for å binde primære opsonizing antistoffer på RBC flater, og det forsterkede signal kan observeres i form av hemagglutinering. En detaljert produsent protokollen kan bli funnet i supplerende materiale fil. - Rekonstituere vasket R2 R2 pellet til 1,25% v / v hjelp komplett RPMI medium.
MERK: Overskudd av opsonisert R 2 R2 kan lagres i Alsever løsning ved 4 ° C i opp til en uke.
4. Fc-reseptor-mediert Fagocytose
- Aspirer medikament eller et medium supernatant fra 8-kammeret lysbilde og tilsett 400 ul av 1,25% volum / volum R2 R2 blanding. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
- After to h inkubasjon fjerne kamrene ved hjelp av produsentens adaptere. DAB av overflødig R2 R2 på et papirhåndkle. Pass på at raset ikke tørker ut.
- Fyll en 100-ml beger med PBS. Senk og vaske raset ved sakte å bevege glide frem og tilbake (rundt 30-40 slag) for å fjerne det meste av un-phagocytosed R2 R2.
- Fjern lysbildet fra PBS. DAB av overflødig PBS ved hjelp av et papirhåndkle eller vev og luft-tørke lysbildet.
- Fest lufttørket lysbilde i 100% metanol i 45 s. Deretter luft-tørke fast lysbilde.
MERK: Lysbilder kan løses ved hjelp en annen metode som er mer kompatibel for nedstrøms flekker, som for eksempel Grünwald-Giemsa beis 21 eller Wright-Giemsa beis 22. - Monter lysbildet bruker en in-house-laget elvanol montering medium (eller en annen kommersielt tilgjengelig monteringsmedium) og legge dekkglass.
MERK: Elvanol montering medium er sammensatt av 15% w / v polyvinyl alkohol-harpiks og 30% volum / volum glycerol i PBS. Blandingen oppvarmes inntil all harpiksen er oppløst, og glyserinet er homogent blandet. Dette kan erstattes med andre kommersielt tilgjengelige monteringsmedium. - La mount tørke over natten før kvantifisering.
5. Kvantifisering av Fagocytose
- Ved hjelp av et fasekontrastmikroskop og et 40X objektiv, manuelt kvantifisere mengden av fagocyterende hendelser ved å telle minst 200 monocytter og antall phagocytosed R2 R2 innenfor disse monocytter. Ha en teller i hver hånd for samtidig å kvantifisere antallet av monocytter og antallet phagocytosed R2 R2.
- Skaff gjennomsnittlig phagocytic indeksen ved å dividere antall phagocytosed R2 R2 med antall monocytter og multiplisere med 100. Express data gjennomsnittet (gjennomsnittlig phagocytic indeks) ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM).
Representative Results
Ved å følge de viktigste trinnene i figur 1 og fremgangsmåten skissert ovenfor, kan det være MMA reproduserbart utført. IVIG ble anvendt som et eksempel for inhibering av fagocytose i figur 2. IVIG er kjent for å binde seg og blokkere Fc-reseptorer, og således inhibere den nedstrøms utfallet av fagocytose. Ved å titrere mengden av IVIG anvendes, er en dose-avhengig hemming observert, i hvilke konsentrasjoner over 200 pg / ml resulterte i nær 100% inhibering og konsentrasjoner under 0,5 mikrogram / ml hemmet ikke i det hele tatt (figur 2A). Når fagocytiske indekser blir transformert og normalisert til R2 R2 positiv kontroll som 0% inhibering, en inhiberingskurve med en IC50 på 3 mikrogram / ml kan bli bestemt (figur 2B).
I tillegg til å utføre analysen konsekvent, quantificasjon av analysen kan noen ganger være vanskelig. Figur 3 er en samling av fasekontrastmikroskopi bilder av ulike MMA lysbilder. Med mikroskopi erfaring, kan man skille mellom en monocytt fra en forurensende RBC (figur 3D), eller en vakuole fra en phagocytosed RBC (figur 3B). Tette klynger av celler og / eller rusk bør unngås under kvantifisering (Tall 3E og F). I tillegg bør man unngå over opsonizing R 2 R 2 RBC, noe som ville føre til økt fagocytose at overcrowds monocytt interiør og forstyrrer nøyaktig kvantifisering (Figur 3C).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av MMA. En trinn-for-trinn skildring av de viktigste trinnene i MMA: isolere PBMC fra fullblod, fôring levd monocytes med opsonisert R2 R2, og vaske kammer lysbilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Intravenøs IgG (IVIG) inhiberer in vitro fagocytose ved hjelp av MMA. IVIG er kjent for å hemme fagocytose og brukes som en hemning kontroll i den menneskelige MMA. (A) Titrering av IVIG resulterte i en doseavhengig inhibering av fagocytose når sammenlignet med den ubehandlede R2 R2 kontroll. Resultatene viser gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) av n = 3 forsøk. Den statistiske analysen ble utført ved bruk av Student t-test: ** P≤0.01 og *** P≤0.001. (B) Inhibering kurve av IVIG med en IC50 of 3 ug / ml (prikket linje). Resultatene viser dataene normalisert til ubehandlet R2 R2 (0% inhibering); middelverdi ± SEM av n = 3 forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. fase kontrast mikroskopi bilder av prøveglass i henhold til 40X forstørrelse. (A) Den perfekte lysbilde der monocytter phagocytosed 1-2 R2 R2 i gjennomsnitt (svarte piler med en særegen glorie glød), med svært få forurensende, un-phagocytosed R2 R2 i bakgrunnen (hvite piler). (B) Som vist i dette lysbildet, monocytter noen ganger har forstørret vakuoler (hvite piler), som kan forveksles med phagocytosed R2 R2. (C </ strong>) Når R2 R2 har vært over-opsonisert, mer enn 4-5 phagocytosed R2 R2 per monocytter (svarte piler) gjengi nøyaktig telling vanskelig, siden R2 R2 er overfylt i monocytter og distinkte celle grenser ikke kan skilles. (D) Utilstrekkelig vasking av raset fører til rikelig R2 R2 forurensning (hvite piler), som kan forveksles følges RBC. (E) og til, monocytter og forurensende røde blodlegemer kan danne klaser. Klynger også indikere bakteriell forurensning, noe som bør unngås. (F) Monocytter kan danne større aggregater, noe som bør unngås under kvantifisering. Ved hjelp av tilfeldig utvalg av feltene for å se, er panel A hva er vanligvis observert om MMA er korrekt utført. Scale bar er 20 mikrometer. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
MMA er en arbeidskrevende teknikk som krever kompetanse i både vev kultur og mikroskopi. Det er flere viktige tiltak for å sikre suksess: 1) generasjon av monocytt monolayer; 2) opsonization av RBC, og 3) manuell kvantifisering. Den monocytt-monolaget ikke fester seg meget sterkt til kammeret lysbilde, så fysiologisk pH må opprettholdes gjennom hele analysen 11 og et tilstrekkelig antall av PBMC skal podes. Under kraftig pipettering, som kan forstyrre det adherte celler, bør unngås. En tilnærming er å alltid fjerne og legge løsninger fra det samme hjørnet av kammeret og for å sikre at bevegelsen er langsom og jevn. Likeledes, i løpet av det siste vasketrinn for å fjerne overskudd av RBC, bør bevegelsen være langsom og jevn. Dette sikrer minimal forstyrrelse av monolaget og samtidig å fjerne mesteparten av de un-phagocytosed RBCs. Utilstrekkelig vasking vil føre til en høy bakgrunn av forurensende røde blodlegemer, noe som gjør manuell quantification vanskelig. Dernest må de to R R 2 RBC være tilstrekkelig opsonisert for å oppnå et gjennomsnitt fagocytisk indeks på 80-120 for fagocytose kontroll. Denne ønskede fagocytisk rekkevidde basert på en balanse mellom den enkle telle (f.eks monocytter med mer enn 5 phagocytosed RBCs er vanskelig å nøyaktig kvantifisere) og opprettholde en tilstrekkelig mengde av fagocytose for statistisk analyse. Graden av opsonization kan bekreftes ved en IAT, og en lese mellom 3+ til 4+ er nødvendig. R 2 R 2 RBC-er skal kastes når det er overflødig lyse under vask, når supernatanten blir mørk rød, eller når en betydelig reduksjon i fagocytose er observert i eksperimenter på grunn av aldring av cellene i lagring. Til slutt kan manuell kvantifisering ved hjelp av mikroskop være vanskelig, spesielt når man sammenligner teller mellom lab personell og mellom eksperimenter. Ved å undersøke den samme felt på hver brønn, eller ganske enkelt ved å telle flere cellerKan oppnås en mer konsistent teller. Side-ved-side trening med en erfaren tekniker og bruk av et utpekt sett med trenings slides anbefales.
En viktig kritikk av MMA er subjektivitet av håndboken kvantifisering trinn. Men med tilstrekkelig trening, konsistens kan oppnås på tvers av forskjellige tellere. En annen begrensning er den iboende donor-til-donor forskjeller i monocytt fagocytiske egenskaper og i R-2 R-2-overflateantigenet ekspresjonsnivåer, som er en kilde til variasjon av data når håndtere humane prøver.
Andre alternative teknikker er tilgjengelige for å undersøke FcγR-mediert fagocytose. Flertallet av kommersielle sett utnytte fluoriserende effekt for å overvåke fagocytose (f.eks bioparticles, pH-sensitive fluorescens-protein, eller IgG-merkede fluorescerende latekskuler). Bruk av fluoriserende effekt ikke tilbyr mer objektiv kvantifisering, men man trenger også å lureSider tilgjengelighet, kostnad, og trening i forbindelse med bruk av en fluorescerende mikroskop eller et flowcytometer, så vel som den påfølgende avhengighet av kommersielt tilgjengelige sett.
Endelig kan denne analysen modifiseres avhengig av problemstillingen. For eksempel, ved testing av medikament hemming av fagocytose, monocytter kan enten være forhåndsbehandlet eller ko-inkubert med både legemidler og opsonisert RBC-er (det vil si en konkurranseanalyse). Den nedstrøms signalisering av antistoffer med forskjellige undertyper, kimære antistoffer eller rekombinante konstruksjoner kan også bli testet. Med de siste gjennombrudd i utviklingen av en universell antigen-null blod 24, kan den MMA utnyttes i første skjermer av disse antigen-RBCs null med forskjellige antistoffer for å vurdere hvorvidt det er faktisk en lavere effekt i utløser fagocytose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers | BD | REF364606 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R8758 | |
| HEPES | Bioshop | HEP003.100 | |
| Fetal bovine serum | Multicell | 080150 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-64 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-03 | https://www.gelifesciences.com/ |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| 8-chamber slides | Lab-Tek-ll | 154534 | |
| R2R2 (cDE/cDE) red blood cells | Canadian Blood Services | Commercially available (e.g., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells) | |
| Polyclonal anti-D from human serum | Gamma Biologics | DIN 02247724 | Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin |
| 100% methanol | Caledon | 6700-1-42 | |
| Polyvinyl alcohol resin | Sigma | P8136 | Can be substituted with commercially available mount |
| UltraPure glycerine | Invitrogen | 15514-011 | |
| Cover slips | VWR | 48366 067 | |
| Novaclone anti-IgG | Immucorgamma | 5461023 | Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf) |
References
- Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
- Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
- Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
- Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
- Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
- Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
- Grandstaff Moulds, M. K.
- Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
- Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
- Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
- Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
- Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
- Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
- Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
- Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
- Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
- Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
- Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
- Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
- Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
- Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
- Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
- Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
- Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).
