Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Imaging Metaller i hjernevæv fra Laser Ablation - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS)

Published: January 22, 2017 doi: 10.3791/55042
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5,6, 7, 7, 8, 8, 2, 3, 1
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

Summary

Kvantitativt kortlægning metaller i væv ved hjælp af laser ablation - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS) er en følsom analytisk teknik, der kan give ny indsigt i, hvordan metaller deltager i normale funktion og sygdomsprocesser. Her beskriver vi en protokol til kvantitativt billeddannelse metaller i tynde sektioner af mus neurologisk væv.

Abstract

Metaller findes op overalt en organisme, med deres biologiske rolle dikteret af både deres kemiske reaktivitet og overflod inden for et specifikt anatomisk region. I hjernen, metaller har en meget rumopdelt distribution, afhængigt af den primære funktion, de spiller i centralnervesystemet. Imaging den rumlige fordeling af metaller har givet unik indsigt i den biokemiske arkitektur af hjernen, så direkte sammenhæng mellem neuroanatomiske regioner og deres kendte funktion med hensyn til metal-afhængige processer. Derudover indeholder adskillige aldersrelaterede neurologiske lidelser forstyrret metal homeostase, som ofte er begrænset til små områder af hjernen, som ellers er vanskelige at analysere. Her beskriver vi en omfattende fremgangsmåde til kvantitativ afbildning metaller i muse hjerne, ved hjælp af laser ablation - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS) og specielt konstrueret billedbehandlingsoftware. Fokus på jern, kobber og zink, som er tre af de mest udbredte og sygdomsspecifikke relevante metaller i hjernen, beskriver vi de væsentlige skridt i prøveforberedelse, analyse, kvantitative målinger og billedbehandling til at producere kort af metal spredning i lav mikrometer opløsningsområde. Denne teknik, der gælder for enhver nedskæring vævssnit, er i stand til at demonstrere meget varierende fordeling af metaller i et organ eller system, og kan bruges til at identificere ændringer i metal homeostase og absolutte niveauer i fine anatomiske strukturer.

Introduction

Den unikke redox kemi af metaller letter en række neurologiske funktioner, herunder signaltransduktion, energiproduktion og neurotransmittersyntese. I en række store neurodegenerative sygdomme, har dyshomeostasis af disse metaller været både impliceret i sygdom patogenese og identificeret som potentielle nye mål for terapeutisk intervention 1. For bedre at forstå, hvordan metaller er involveret i sygdomme som Alzheimers og Parkinsons sygdom (AD og PD, henholdsvis), er det bydende nødvendigt at kunne måle, hvordan metal distribution og niveauer ændre inden for regionerne negativt ramt af sygdommen proces. Disse ændringer er ofte tegn på subtile forskydninger i de biokemiske reaktioner, som kan være tæt forbundet med de processer, der initierer celledød, såsom vores nyligt foreslåede mekanisme af jern og dopamin neurotoksicitet i PD 2.

Traditionelt metal niveauer inden definerede anatomiske regioner er opnået gennem omhyggelig excision, fordøjelse og analyse ved hjælp af en række analytiske teknikker 3. Men en sådan metode mister geografisk information, som kan være kritisk, når sygdomstilstande undersøges involverer små, veldefinerede områder eller bestemte celletyper,. Et antal analysemetoderne findes til visualisering metaller i biologiske systemer, fra intakte prøver til vævssnit og i to og tre dimensioner, ved hjælp af emissionsspektroskopi, fluorescerende prober og massespektrometri 4. Hver teknik har fordele og ulemper vedrørende følsomhed, selektivitet af kemiske arter, og den rumlige opløsning, der kan opnås. For et samlet overblik over rækken af teknikker til rådighed, se anmeldelsen af Hare et al. Fem.

Massespektrometri (MS) -baserede metoder er de mest følsomme af disse teknikker, Der kan måle mest biologisk relevante metaller ved deres native koncentration 6. Laser ablation - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS) imaging anvender en fokuseret ultraviolet laserstråle varierer i størrelse fra 1 til> 100 um i diameter (eller bredde, når der anvendes en firkant stråleform), hvorefter prøven ledes 7. Kvantitative oplysninger kan opnås gennem det repræsentative ablation af standard referencematerialer, som kan fremstilles ved hjælp af en række forskellige tilgange 8, hver med varierende grader af tekniske vanskeligheder og analytisk funktionalitet. Den mest almindelige metode bruger matrix-matching, hvor en standard med en fremherskende kemisk makeup sammenlignes med prøven er udarbejdet ved at tilsætte med målanalysanden og præcist vurderet for homogenitet og absolut koncentration metal af uafhængige analytiske midler 9, 10. Ablation af fremstillede standarder kan derefter anvendes til eksterne kalibreringsformål, så koncentrationsdata fra den resulterende prøve billede, der skal ekstraheres per pixel.

Billedopløsning er bestemt af både strålen størrelse og hastighed, hvormed prøven scannes. Standarden kvadrupol-design ICP-MS (som tegner sig for over 90% af alle installerede ICP-MS-systemer på verdensplan 11) er en sekventiel masse analysator, idet massen detektor cykler gennem alle valgt masse-til-ladningsforhold (m / z ) snarere end at indsamle data samtidigt. Således skal erhvervelsen tid for hver cyklus af masserne svare til den tid, det tager for prøven at krydse en bredde af laserstrålen for at sikre en pixel er repræsentativt for den ønskede opløsning erhverves 12. Laser valg stråle størrelse er en afgørende parameter, der har væsentlig indvirkning på både følsomhed og samlede analyse tid. Som laserablation physitisk fjerner materiale, som bestryges til ICP-MS ved en argon bæregas, mængden af ​​stof, der fysisk kan detekteres af masseanalysator følger den omvendte kvadratlov. For eksempel reducerer laserstrålen diameter fra 50 - 25 um resulterer i en reduktion af ablateret materiale med en faktor på fire. Derudover, som en scanning metode, mindre beam diametre øge det samlede tid, der kræves til at ablatere et udvalgt område. Derfor eksperimentelle design er afgørende for at skabe balance mellem den nødvendige rumlige opløsning med følsomhed behov og tidspres.

Imaging af LA-ICP-MS er blevet anvendt på en række prøver, matricer og sygdomstilstande, herunder dyremodeller for neurologiske sygdomme 13, 14, traumatisk hjerneskade 15, distribution af metal-holdige lægemidler mod cancer 16, giftstof eksponering i placenta 17 og metal distribution i tænderne som en biomarkør for tidlig-life kosten overgange. 18 I denne protokol beskriver vi en generel fremgangsmåde til afbildning jern, kobber og zink i WT musehjerne med en opløsning på 30 um, selvom det let kan tilpasses til en række prøvetyper og eksperimentelle resultater baseret på behov analytiker.

Protocol

Procedurer beskrevet heri er blevet godkendt af Howard Florey Animal etiske komité og overholde de nationale Sundhed og helse Forskningsråds standarder for pasning af dyr.

1. Udarbejdelse af Prøve til Analyse

BEMÆRK: Dette trin varierer afhængigt af prøvematrixen, der skal analyseres.

  1. Prøveforberedelse og sektionering
    BEMÆRK: Fiksering anvendelse af 4% paraformaldehyd (PFA) og kryobeskyttelse i 30% sucrose i 0,1 M PBS vil resultere i varierende mængder af udvaskning af metaller fra væv. Se Hare et al 19 for specifikke detaljer. Sikre alle prøver har gennemgået identiske fiksering og kryobeskyttelse trin.
    1. Transkardialt perfundere den aflives dyr med iskold 0,1 M PBS, pH 7,4 (se afsnittet Metoder i Dodt et al. 20 for detaljer) og fjern hjernen.
    2. Placer hjernen i 4% PFA O / N til at fastsætte vævet.
      3. <li> Cryoprotect hjernen ved at placere det i 30% sucrose i 0,1 M PBS i 24 timer, og derefter skifte til friske 30% saccharose i yderligere 24 timer. 19
    3. Frys hjernen i en kryostat ved -20 ° C i mindst 1 time.
    4. Monter hjernen på en patron med en egnet monteringsmedium.
    5. Afsnittet hjernen på en kryostat ved anvendelse af en metalfri engangs klinge (f.eks polytetrafluorethylen [PTFE] -belagt knive) og montere på en standard mikroskopobjektglas. Den optimale tykkelse for sektionen skal være ca 30 um.
  2. Hvis der anvendes paraffinindlejrede prøver, sektion på den ønskede tykkelse, float båndet på et varmt vandbad og montere på standard mikroskopobjektglas.
    BEMÆRK: Præcise virkninger af langvarig fiksering og paraffin-indlejring af biologiske prøver er ikke kendt. Som beskrevet i 1.1, sikre alle prøver har gennemgået procedurer for prøveforberedelse identiske, hvis sammenlignende analyse er beregnet til.
    1. afvoksning paRAFFIN-embedded prøver ved at dyppe dias i 3 hold xylen, en ændring hver af: 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol og et minimum af 3 ændringer i ISO 3696 eller tilsvarende renset vand (herefter benævnt " vand ', se Hare et al 21 for en detaljeret metode)..
  3. Lad prøver lufttørre i ca. 1 time i et støvfrit miljø, såsom et dias boks med prøverne placeret lodret i stativer og låget på klem.

2. Udarbejdelse af Matrix-matchede Standarder

BEMÆRK: Det følgende er en sammenfattet protokol tidligere publiceret 9. Se venligst den oprindelige papir til detaljerede trin for at forberede matrixtilpassede væv standarder.

  1. Opnå kommercielle lam hjerner (eller lignende) og skyl i vand, fjerne alt blod og bindevæv.
  2. Ved hjælp af en skalpel, omhyggeligt dissekere ca. 50 g kortikale tissue og delvist homogeniseres ved anvendelse af en håndholdt vævshomogenisator med en polycarbonat engangs sonde på lav effekt. Opdel i 5 g portioner, med nummeret afhængigt af kalibreringsskalaen og antal kalibreringspunkter ønskede.
  3. Fremstille opløsninger af metaller til spike hver standard ved at opløse et opløseligt salt af hver analyt (f.eks FeSO4 · H2O) i 1% salpetersyre for at frembringe 0,1, 1 og 100 mg metal ml -1 bestande.
  4. Tilføj et forud beregnet volumen af stamopløsning til 5 g alikvoteret væv (f.eks 5 pi 10 mg ml-1 for en omtrentlig slutkoncentration på 10 ug g -1 vådt væv) for at opnå en række spiked metal niveauer i hver standard.
    1. Afhængigt af den ønskede slutkoncentration af hver standard, bruge en kombination af hvert metal stamopløsning at sikre den minimale mængde af opløsninger tilsættes til standarden. Tilføj en endelig spike vand til hver standard for at sikre equivalente mængder af tilsat væske er til stede i hver standard.
    2. Homogenisere spidse standarder for lav effekt i ca. 30 s. Hvis ikke skal anvendes straks, holde frosset ved -20 ° C i udjævnede polypropylenrør forseglet med Parafilm.
  5. Bestem præcis koncentration og homogenitet af hver standard ved hjælp af en af følgende procedurer:
    1. Microwave fordøjelse
      1. Placer 6 nøjagtigt vejet (ca. 50 mg) portioner af en standard i en vasket PTFE fordøjelse fartøj og tilsættes 4 ml koncentreret (65%) salpetersyre og 1 ml 30% hydrogenperoxid. Seal og fordøje ved 500 W i 30 minutter.
      2. Efter afkøling af fordøjelsen fartøj, åben i et stinkskab og hældes fordøjede opløsning til en afsyret 50 ml rør ved anvendelse af 10 ml portioner af vand. Gør til ca. 50 ml, og nøjagtigt vejes massen af ​​den endelige opløsning.
      3. Gentag trin 2.5.1.1 - 2.5.1.2 for hver standard.
    2. Brug følgende procedure, hvis mikrobølge udstyr ikke er tilgængelig:
      1. Placer seks nøjagtigt målt (mellem 25-200 mg) portioner af standard i syrevasket / metalfri polypropylen rør og lyofiliseres O / N.
      2. Tilsæt 40 ​​pi koncentreret salpetersyre og varme, ikke-reducerede, på en varmeblok til 70 ° C i 5 minutter, og derefter tilsættes 10 pi 30% hydrogenperoxid. Varme i yderligere 5 min, og derefter præcist foretage i 1 ml totalvolumen ved anvendelse 950 pi 1% salpetersyre.
        BEMÆRK: Det er tilrådeligt at fordøje et certificeret referencemateriale ved hjælp af den foretrukne metode til at sikre fordøjelse procedurer er nøjagtige.
  6. Bestem koncentrationen af ​​metal i hver fordøjelse opløsning ved opløsning forstøvning ICP-MS ved anvendelse af en standardprotokol. Vurdere homogenitet hver standard ved at bestemme den relative standardafvigelse (% RSD) mellem hver portion. Sørg% RSD falder alle inden for 15%. Brug af den målte masse af each portion, beregne den nøjagtige metal koncentrationen af ​​hvert homogeniseret væv standard.
  7. Vender tilbage til den homogeniserede væv standard, pakke en 5 x 5 mm plast engangs histologi skimmel og fryse i iso-pentan afkølet i flydende nitrogen. Fjern den frosne standard væv blok fra formen og afsnittet om en kryostat på samme tykkelse som prøven.
    Bemærk: Det er tilrådeligt at udarbejde en række afsnit med varierende tykkelser for fremtidige eksperimenter. Lufttørrede standarder kan opbevares på ubestemt tid i en lufttæt og støvfri beholder.

3. Udarbejdelse af LA-ICP-MS for analyse

  1. Placer standarder og prøve i ablation kammer, der sikrer, at de er inden for dybdeskarpheden af ​​CCD kamera monteret på LA enheden. Hvis det er nødvendigt tuning af instrumentet, indeholde en passende referencemateriale (f.eks NIST 612 sporstoffer i Glass). Spænd de to skruer på kammeret døren for at forsegle the ablation kammer.
  2. I ICP-MS software, skal du vælge åben argon gas ventil i "Vedligeholdelse" eller lignende panel og sæt bæregasflow til 1,2 L min -1 i den relevante dialogboks.
    BEMÆRK: I denne protokol argon anvendes som bæregas. Flere eksempler bruge enten helium eller en blanding af helium og argon som bæregas. Se Günther og Heinrich 22 for tekniske oplysninger om brug af helium og argonblandinger som aerosol carrier gasser.
  3. I LA-softwaren, skal du klikke på knappen "udrensning" for at skylle cellen med argongas i mindst 30 min.
    BEMÆRK: Purge tid kan ændres ved at klikke på en "purge tid« eller lignende knap. Ved brug af en ablation system med en to-binds ablation celle, periodisk flytte scenen til hvert hjørne og diagonalt krydse cellen for at sikre så meget tilbageværende luft fjernes fra cellen som muligt. Dette kan opnås ved at vælge hjemmemarkeder etaper «eller ækvivalentrende funktion.
  4. Tænd for ICP-MS ved at klikke "plasma på" og lad den varme op til to timer, i løbet af hvilke skridt 3,5-4,4 kan gennemføres. Instrumentindstillinger varierer mellem producenter, selv om et eksempel på passende LA-ICP-MS driftsbetingelser kan findes i Hare et al. 10.
  5. Repræsentant ablation af væv standarder
    1. Vælg linje værktøj og trække en enkelt linje af ablation ca. 3 mm lang hen over vævet overflade.
    2. Indstil parametrene som følger ved at højreklikke på linje ablation i eksperimentet listen og ændre følgende: beam diameter (valgt som passende af brugeren, en 30 um firkantet stråle anvendes her), scanningshastighed (4 gange strålen diameter per sekund, 120 um s -1) og energifluens (0,3 -0,5 J cm -2 for blødt væv, optimere om nødvendigt med hårdere matricer). Ved 30 um vævstykkelse laserstrålen ikke trænger hele thickness af dette væv, hvilket eliminerer enhver potentiel kontaminant fra mikroskopet support. Normalisering til carbon 23, kan anvendes til at korrigere for variationer i mængden af væv ablateret. Sæt disse parametre som standard for hver efterfølgende linje ved at vælge »misligholdelse« alternativknap.
    3. Dupliker denne linje seks gange ved at vælge den første linje, højreklikke og vælge 'dublerede scanninger'. Sørg linjer er forskudt i enten x - eller y akse af strålen diameter. Dette giver i alt syv linjer pr standard, indbyrdes afstand ifølge strålediameteren.
    4. Gentag trin 3.5.1 - 3.5.3 for hver standard, sikrer linje med identisk længde.
  6. For at tegne det ablation område over prøven, følge en af ​​følgende to metoder:
    BEMÆRK: Sørg for de samme scanning parametre (stråle diameter, scan hastighed, energifluens) anvendes til prøvetagningsledningerne.
    1. Hvis LA systemet er udstyret med enbred-synsfelt, skal du vælge linje værktøj og trække en linje fra øverste venstre hjørne af prøven længe nok til at dække prøven på det bredeste sted ved hjælp af de samme laser parametre skitseret i 3,5. Dupliker denne scanning som skitseret i 3.5.3 med linjer afstand efter strålen diameter så mange gange som nødvendigt for at sikre fuldstændig dækning af prøven.
    2. Hvis et bredt felt visning er ikke tilgængelig, fastlægge og registrere x og y-koordinater (typisk vises på hovedskærmen som "scene position« eller lignende), der svarer til hjørnerne af et rektangel, der dækker hele prøven. Brug disse koordinater til at placere parallelle ablation dækker hele prøven område som beskrevet i 3.7.1.
    3. Tegne linjer for intermitterende scanning af standarder senest efter på ~ 20 timer af scanning af prøven ved at gentage fremgangsmåden beskrevet i 3.5. Afhængigt af scanningen varighed af prøven kan være behov for flere gange. Afslut eksperimentet med en suppletionale scanning af standarderne.
      BEMÆRK: Ved bestemmelse af x og y-koordinater, mens cellen bliver udrenset, vælge udgangspositioner og den tilhørende kalibrering af aksen vil ændre tidligere erhvervede detaljerne for x og y koordinater mens forskellen (dvs. længden af linjen) vil være upåvirket.

4. Opsætning af dataopsamling Metoder til ICP-MS

  1. For standard linje af ablation, opdele længden af ​​linien af ​​laseren scanningshastighed at bestemme det samlede analyse tid til en enkelt linje. Gentag dette for prøven linje.
  2. I ICP-MS software, oprette en ny metode (vist her som en »parti«), og sikre, at »tiden løst analyse« eller tilsvarende er valgt. Marker m / z-værdier, der skal detekteres, og derefter justere integrationstiden for hver m / z så det samlede integrationstiden for en cyklus er lig 0,25 s. Klik på 'Gem Batch As 'og navn i overensstemmelse hermed (fx Std1).
    BEMÆRK: Når prøven vil gå igennem laserstrålen ved fire gange strålediameteren, dette sikrer et datapunkt for hver masse registreres svarende til bjælken diameter 12. For eksempel ved anvendelse af en 100 um pletstørrelse, en scanningshastighed på 400 um s -1 med en integrationstid på 0,25 s vil producere billeder med ægte pixel størrelser. Integration kan indstilles til at forbedre følsomheden; når stigende integration tid til 0,33 s scanningshastighed skal bremses til tre gange strålen diameter.
  3. For standarder, indtaste analysen tid for hver linje scanning i den relevante rubrik, plus yderligere 15 s at tage højde for laser warm-up og udvaskning gange. Indtast en prøve køre liste (dvs. den rækkefølge, som scanninger køres) med samme antal overtagelser (typisk nummereres fortløbende, dvs. 001, 002, etc.) som det samlede antal standard linjer.
  4. For prøven, Duplikere den anvendte metode til standarderne ved at gemme den nuværende metode eller parti med et alternativt filnavn, og justere den samlede erhvervelse tid (inklusive yderligere 15 s) og det samlede antal opkøb for at svare til antallet af linjer, der vil ablation prøven .
    BEMÆRK: Da de fleste LA-ICP-MS-systemer bruger en envejs udløser (LA udløser ICP-MS), er det afgørende, at ICP-MS software afventer aftrækkeren fra LA inden den efterfølgende linje af ablation begynder. erhvervelse Vinduet ICP-MS vil læse 'venter på start'.

5. Kørsel af eksperimentet

  1. Start ICP-MS kø ved tilsætning af den første metode eller batch til køen og sikre softwaren afventer aftrækkeren fra LA-systemet.
  2. I LA-softwaren, skal du aktivere laser strømforsyning ved at klikke på "emission", klik på 'køre' og indstil laser opvarmning tid til 10 s og udvaskning tid til 20 s i de relevante felter.
    Bemærk: Denne overskridelse vilsikre ICP-MS er klar til at starte erhverve nye data, når laseren begynder hver efterfølgende linje af ablation.
  3. Start laser sekvens ved at klikke på 'start'. Hvis der anvendes en to-volumen celle, sikre prøvekoppen er i position.

6. Beregning Kvantificering Standards

BEMÆRK: Der er flere varianter til konvertering ICP-MS-data til billeder. Disse omfatter anvendelsen af hjemmelavede softwareværktøjer skrevet i open source-sprog 17, 24, 25, kommercielle makroer 26 og dataanalyse software. 7. Her skal du bruge den nyligt udviklede software plugin (beskrevet i Paul et al. 27), er baseret på en specialiseret LA-ICP-MS dataanalyse suite 28.

  1. Overfør alle batch mapper, der indeholder de køre data (001.d, 002.d osv.) På enseparat computer med analysen software installeret. Uddrag de * .csv datafiler for hver linje i partiet i en separat mappe.
    BEMÆRK: Brug af et script til automatisk at overføre * .csv-filer til en ny mappe er stærkt anbefales. Se vedlagte Python kode for flere detaljer. Dette script er blevet skrevet til at passe enten en Agilent 7700 eller 8800 serien ICP-MS, men kan redigeres til at passe til output fil fra andre producenter.
  2. Åbn software platform og følg fanerne sekventielt til at importere og analysere de standarder, til at producere kvantitative billeder som beskrevet nedenfor.
  3. For at importere data fra den første standard parti, vælg 'Agilent .csv' for 'File Type "," Hele mappe "for" Import type «og kontroller, at den" Datoformat "er identisk med computeren format. Klik på 'Import', skal du vælge mappen med de .csv-filer til det første sæt af standarder, og flytte til fanen 'basislinjer «.
  4. Baselinesubtraktion
    1. Brug 'Automatiske Selections' fanen (kommando 2) fra hovedsagen rullemenuen i værktøjslinjen, vælg 'Information fra import «og klik på' Fortsæt '.
    2. Klik på 'Vælg alle' og vælg 'Baseline_1 "for integration.
    3. For at vælge de første 10 sekunder af hver scanning linje (svarende til laseren opvarmningstid), beskære dataene ved at anden værdier "0" og "(varighed linje - 10 s) 'og klik på' Tilføj integrationer« (f.eks for en 35 s scanlinie indtaste værdier '0' og '25').
  5. Sådan vælger eksempeldataene, bruge 'Automatiske Selections' fane, som beskrevet i 6.4, men vælg 'OUTPUT_1' som integration. Beskær data fra begyndelsen og slutningen af hver standard linje at udelukke baggrunden signal (f.eks en 35 s scanlinie indtaste værdier '13' og '4').
  6. At udelukke dråber i signalet forårsaget af muble huller i standarderne, i fanebladet 'Samples ", skal du klikke på" kanaler "på øverst til venstre i grafen område for at vælge en kanal med en høj signal-støj-forhold (f.eks C13 eller P31). Notér skarpe fald i signalet, og vælg en CPS værdi lav nok, der er under den normale variation inden prøverne, men høj nok til at udvælge de skarpe fald i signalet.
  7. Klik på fanen 'DRS' og vælg 'Baseline_Subtract «til» Aktuelle data Reduction Scheme «. Vælg den kanal fra 6,6 for "Indeks Channel" og CPS værdi for "Threshold at bruge, når maskering lave signaler«. Indsæt en værdi <0,5 s for 'Sekunder at trimme før / efter lave signaler' til at redegøre for den forsinkede signaloverførsel fra laseren til ICP-MS.
  8. For at bekræfte tilstrækkelig maskering af de lave signal områder, skal du klikke tilbage til fanen "Prøver" og vælg en bearbejdet (f.eks., Fe56_CPS) kanal spor. Gentag og forfine CPS og & #39, Sekunder at trimme før / efter lave signaler værdier som i 6.7 hvis det er nødvendigt.
  9. Klik på fanen 'resultater' og vælg 'Eksporter data "fra hovedsagen rullemenuen. Indtast et filnavn til at generere et regneark datafil af resultater (f.eks, Std1 beregninger, Std2 ...).
  10. Åbn datafil i et egnet regnearksprogram og beregne CPS værdier for hver enkelt kanal, der skal kvantificeres. Brug de forudbestemte metal koncentrationer fra løsningen forstøvning ICP-MS til at beregne omregningsfaktoren fra CPS værdier til ppm (mg g -1) for hver kvantificerbar element.
  11. Gentag trin 6,3-6,10 for alle de sæt af standarder i tiden.

7. Konstruktion Kvantitative billeder

  1. Skriv 'BioLite () "i kommandoprompten for at åbne softwaren.
  2. Importer eksempeldataene ved at klikke på "Indlæs billeder" og vælge den mappe, der indeholder de .csv-filer for prøven billedet.
  3. korrektion Baggrund
    1. Klik på fanen basislinjer 'for at anvende korrektion baggrund for prøven. På fosfor (P31) billede bedt på skærmen, skal du vælge områder af baggrunden ved hjælp af rektangel tegne værktøj. Valg så mange regioner som muligt skaber et billede i hele kort over signal / plasma drift for at sikre passende erstatning fra disse forstyrrende faktorer.
    2. For at gøre baggrunden signal mere synlig, skal du vælge grafen redigere værktøj (øverst til venstre for det viste billede) og højre på billedet. Vælg 'Ændre Billede Udseende' og ændre 'First Color på Z =' til en stor negativ værdi (f.eks -100.000). Fortsæt ved at klikke på 'Udført'.
  4. Klik på fanen 'Standards "for at få et bord til CPS / ppm korrektionsfaktorer. Indtast værdier beregnet ud fra standarderne i trin 6.10 for hver af elementerne. Dette trin vil bidrage til at korrigere for følsomheden afdrift i ICP-MS. Klik på 'Go! '
  5. Open 'Data Browser' fra 'Data' fanen, som holder billederne for hvert element og hvert trin.
  6. For at færdiggøre et billede til eksport, vælge det ønskede billede i "StdCorrImages 'mappen, højreklik navnet billedet (* _ppm), og klik på' NewImage«. Højreklik på billedet for at åbne 'Ændr Billede Udseende' for at vælge en ønsket farve bord og farveskala. Tilføj en farveskala til billedet ved at højreklikke på billedet og vælge "Tilføj Annotation". Vælg 'ColorScale "fra øverste venstre rullemenu og bruge fanerne til at ændre den ønskede farve skalaen.
  7. Hvis du vil eksportere et billede, skal du sørge for, at det pågældende billede er valgt, og gå til fanen 'Filer' og klik på 'Gem grafik ... «. Vælg det ønskede format, og gemme billedet. Alternativt kan det valgte billede overføres ved hjælp af de kopiere og indsætte værktøjer.
  8. Gentag trin 7.6 og 7.7 for alle billederne af interesse.
  9. QuantifYing diskrete områder
    1. For at aktivere ROI værktøjer, navigere til 'Analyse' fanen, »Kolli 'og vælg' Billedbehandling '.
    2. Vælg det ønskede billede og gå til fanen 'Billede' og klik på 'ROI ... «. Klik på 'Start ROI uafgjort "og bruge en tegning til at markere et område af interesse i prøven. For at afslutte tegning, skal du klikke på 'Afslut ROI «.
    3. At erhverve statistikken for den valgte ROI Naviger til fanen 'Billede' og klik på 'Stats ... «.
    4. Kopier og indsæt resultaterne til en separat regneark. Gentag valg ROI (7.9.2) for alle regioner og elementer af interesse.

Representative Results

For at demonstrere mulighederne i denne LA-ICP-MS billedbehandling tilgang, et simpelt eksperiment ved hjælp af et enkelt afsnit af en WT C57BL / 6 mus hjerne, gennemskæres ved corpus callosum og sektioneret i koronale plan, præsenteres. En arbejdsgang til analyse af data ved hjælp af BioLite (figur 1), som beskrevet i afsnit 6 og 7, samt for at give et repræsentativt billede af metal distribution i afsnittet analyseret (figur 2) er også beskrevet.

Som det kan ses, metal distribution i muse hjerne er variabel ifølge anatomisk område. Dette kan henføres til de variable roller metaller, og mere specifikt de proteiner, som de er bundet, spille i hver hjerne region 27. For eksempel jern tendens til at have højere koncentrationer i midthjernen og langs den tandede gyrus, hvorimod zink er mest forekommende i Cortical områder. Carbon, som er et almindeligt anvendt intern standard 8 er homogent fordelt. Elemental kort (figur 2) kan være særligt nyttigt, når det anvendes i forbindelse med eksisterende anatomiske og funktionelle referencepunkter atlas 29, hvor information om colokalisering af metaller kan ekspressionen af specifikke metalbindende proteiner kan give indsigt i funktionen af metaller i en hjerne region, eller ændringer i metal niveauer i overensstemmelse med en identificeret sygdomsrelateret biomolekyle. Brug den fremgangsmåde, der er beskrevet, der er optimeret til en bredere vifte af analytter, gør udelukker følsomhed for lav hyppighed elementer som mangan, og metoder kan tilpasses primært at fokusere på denne analyt ved at øge opholdstider på bekostning af andre målte masser.

Den største fordel ved anvendelse af billeddannelse af LA-ICP-MS iagttager relative forskelle i metal concentration og fordelingen mellem forsøgsgrupper. Vi har tidligere anvendt en sådan teknik til at påvise forøget jern efter et neurotoksin insult efterligne PD 2, 10, og ændringer i kortikale jern niveauer i human Alzheimers sygdom væv 21. En sådan protokol, som beskrevet her, kan let tilpasses til andre vævstype med minimale ændringer af børsnoterede metoder.

figur 1
Figur 1: Workflow for Image Processing. Workflow supplerer §§ 6 og 7, der viser omdannelsen af ​​rå tid løst data fra ICP-MS kvantitative billeder af metal fordeling i musen hjernen. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2
Figur 2: Typisk Elemental Fordeling af Biometals inden for en mus hjerne. Repræsentative element kort over en 30 um tyk koronale snit af en enkelt mus hjernehalvdel analyseret med LA-ICP-MS. Billeder til kulstof-13 (C13), magnesium-24 (Mg24) og fosfor-31 (P31), der vises i guld farve skalaer (tællinger per sekund; CPS) (øverste række). Kvantitative billeder (nederste række) for mangan-55 (Mn55), kobber-63 (Cu63), jern-56 (Fe56) og zink-66 (Zn66) vises med tilsvarende BlueHot farveskalaer (pg g -1). Samlede analysetid for sektionen hjerne var ca. 5 timer. Scale bar = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Imaging metaller i neurologisk væv er blot ét eksempel på, hvordan denne protokol kan give nyttige oplysninger om fordelingen og mængder af metaller i enhver biologisk matrix. Skønt fremstillingen af ​​standard referencematerialer kan være vanskelig, er det et eksperiment, der kan udføres én gang og arkiveres til senere brug.

LA-ICP-MS har visse fordele i forhold til alternative metoder, såsom synkrotron-baserede X-ray fluorescens mikroskopi, for det meste i form af tilgængelighed og følsomhed. Der er dog visse ulemper, der bør overvejes, når forberede et eksperiment ved hjælp LA-ICP-MS, og som sådan er det ofte en nyttig supplerende teknik til kemisk billeddannelse, der omfatter alternative metal analyseteknikker, samt sammenlignende histokemi 5.

Tilpasning med kendte anatomiske træk med musen hjernen kan give nyttige oplysninger om den mulige funktionelle relationship mellem metal niveauer og rumlige fordeling. Tidligere har vi brugt Allen Brain Atlas online ressource, 29, som er et open-adgang opbevaringssted for både anatomiske og genekspression data i C57BL / 6 mus hjerne til at undersøge rumlig korrelation af både metal-afhængige enzym udtryk 14 og neuroanatomi 27, 30. Andre ressourcer, såsom gnaver Brain WorkBench 31 er også klar til at hjælpe med registrering og tilpasning af metal billeder til at hjælpe i korrekt identifikation af metal distribution i ofte små anatomiske regioner.

Anvendelser af denne teknik er nyttige for vurderingen, hvordan metal niveauer og fordeling ændring på mikroskala hele både normale livsbegivenheder (fx ældning) og i sygdomstilstande; samt undersøgelse af virkningerne af både metalholdige forbindelser og lægemidler designet til at målrette migtal metabolisme. De nuværende store begrænsninger i LA-ICP-MS som en billeddannende teknik til rumligt vurdering metal fordeling er gennemløb og følsomhed. Der er en afvejning mellem hastighed analyse og rumlig opløsning 5, 12, med højere opløsning billeder kræver længere analyse gange. Teknikken er velegnet til biologiske elementer ved højere koncentrationer, men elementer såsom mangan, cobalt og selen er begrænset på grund af deres lave overflod i normalt væv og / eller begrænsninger i deres detektion med konventionel ICP-MS. Nye fremskridt i ICP-MS teknologi, såsom indførelse af triple-kvadrupol masseanalysatorer, på målrettet detektering af vanskelige analytter, såsom selen 32 ved højere følsomheder 33. Som en teknologi-drevet procedure, fremskridt i både laser og massespektrometri design vil se denne imaging teknik udvikler sig fortsat, stigendehastigheden af analyse og følsomhed 34.

Acknowledgments

DJH og PAD understøttes af en australsk Forskningsråd Linkage Project (LP120200081) med Agilent Technologies og ESI Ltd. bidrag BK blev støttet af Ruhr University Research School PLUS, finansieret af Tysklands Excellence Initiative [DFG GSC 98/3]. DJH blev delvist støttet af Ramaciotti Foundation. KK er støttet af Sigrid Juselius Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soda glass microscope slides n/a n/a Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades C.L. Stuckey DT315R50 Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 16005 Any supplier suitable
Sucrose n/a n/a Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate-buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P5368 Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene Sigma-Aldrich 247624 Any supplier suitable
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Any supplier suitable
Lamb brain n/a n/a Available from most local butchers
Metal salts n/a n/a Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser Omni Inc THP115 Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes Omni Inc TH115-PCRH
Microwave digestion unit n/a n/a Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes TechnoPlas P4010 Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid Merk Millipore 100441 Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 95321 Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds Ted Pella 27181
Isopentane Sigma-Aldrich 76871
Liquid nitrogen n/a n/a Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system ESI Ltd n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS Agilent Technologies n/a Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite Iolite Software n/a Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel Microsoft n/a
IGOR Pro Wave Metrics n/a Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912 (2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53 (2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690 (2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159 (2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508 (2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4 (2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

Tags

Medicin billedbehandling laser ablation induktivt koblet plasma-massespektrometri metaller metallomics neurovidenskab
Imaging Metaller i hjernevæv fra Laser Ablation - induktivt koblet plasma - massespektrometri (LA-ICP-MS)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., … More

Hare, D. J., Kysenius, K., Paul, B., Knauer, B., Hutchinson, R. W., O'Connor, C., Fryer, F., Hennessey, T. P., Bush, A. I., Crouch, P. J., Doble, P. A. Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (119), e55042, doi:10.3791/55042 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter