Imaging Metals in hersenweefsel door Laser Ablation - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie (LA-ICP-MS)

Summary

Kwantitatief afbeelden metalen weefsel door laserablatie - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie (LA-ICP-MS) is een gevoelige analytische techniek die nieuw inzicht in hoe metalen deel aan normale functie en ziekteprocessen kunnen bieden. We beschrijven hier een protocol voor het kwantitatief beeldvorming metalen in dunne secties van muizen neurologisch weefsel.

Abstract

Metalen worden een rode draad door een organisme gevonden, met hun biologische rol gedicteerd door zowel hun chemische reactiviteit en overvloed binnen een bepaalde anatomische regio. In de hersenen, metalen hebben een sterk gecompartimenteerd distributie, afhankelijk van de primaire functie zij binnen het centrale zenuwstelsel. Afbeelden van de ruimtelijke verdeling van metalen heeft unieke inzicht gegeven in de biochemische architectuur van de hersenen, waardoor directe correlatie tussen neuroanatomische regio en de bekende functie met betrekking tot metaal-afhankelijke processen. Daarnaast beschikken over verschillende leeftijd gerelateerde neurologische aandoeningen verstoorde homeostase metaal, vaak beperkt tot kleine gebieden van de hersenen die anders moeilijk te analyseren zijn. We beschrijven hier een uitgebreide werkwijze voor kwantitatief afbeelden metalen in muizenhersenen, middels laser ablatie - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie (LA-ICP-MS) en speciaal ontworpen beeldverwerkingsoftware. Gericht op ijzer, koper en zink, waarbij drie van de meest voorkomende en ziekte-relevante metalen in de hersenen, de ter zake stappen monsterbereiding, analyse, kwantitatieve metingen en beeldverwerking kaarten metaal verdeling in de lage micrometer produceren beschrijven resolutie afstand. Deze techniek van toepassing op alle gesneden weefselsectie, kan tonen dat zeer variabele verdeling van metalen binnen een orgaan of systeem, en kunnen worden gebruikt om veranderingen in metaal homeostase en absolute niveaus binnen fijne anatomische structuren te identificeren.

Introduction

De unieke redox chemie van metalen maakt verschillende neurologische functies, waaronder signaaltransductie, energieproductie en synthese van neurotransmitters. In een aantal belangrijke neurodegeneratieve ziekten, dyshomeostasis van deze metalen zijn beide betrokken bij de ziekte pathogenese en geïdentificeerd als potentiële nieuwe doelen voor therapeutische interventie ^1. Om een ​​beter begrip metalen zijn betrokken bij aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson (PD en AD, respectievelijk), is het noodzakelijk om te kunnen meten hoe metaaldistributie en niveau veranderen in gebieden getroffen door het ziekteproces. Deze veranderingen zijn vaak indicatief voor subtiele veranderingen in de biochemische reacties die nauw kan worden gekoppeld aan de processen die celdood leiden, zoals de recent voorgestelde mechanisme van ijzer en dopamine neurotoxiciteit bij PD ^2.

Traditioneel, metal niveaus binnen bepaalde anatomische gebieden is bereikt door een zorgvuldige uitsnijding, de spijsvertering en analyse met behulp van een scala aan analytische technieken ^3. Echter, een dergelijke benadering verliest ruimtelijke informatie, die kritisch kan zijn bij ziektetoestanden onderzocht omvatten kleine, goed gedefinieerde gebieden of specifieke celtypen. Een aantal analytische methoden beschikbaar voor het visualiseren van metalen in biologische systemen, uit intacte monsters weefselcoupes en in twee en drie dimensies, middels emissie spectroscopie, fluorescerende probes en massaspectrometrie ^4. Elke techniek heeft voor- en nadelen met betrekking tot gevoeligheid, selectiviteit van chemische stoffen, en de ruimtelijke resolutie kan worden bereikt. Voor een uitgebreid overzicht van het bereik van de technieken die beschikbaar zijn, zie de recensie van Hare et al. ^5.

Massaspectrometrie (MS) gebaseerde methodes het meest gevoelige van deze technieken, Geschikt voor het meten meest biologisch relevante metalen bij hun eigen concentratie ^6. Laser ablatie - inductief gekoppeld plasma - massaspectrometrie (LA-ICP-MS) beeldvorming maakt gebruik van een gefocusseerde UV-laserbundel die variëren in grootte van 1 tot> 100 urn in diameter (of breedte bij een vierhoek bundelvorm wordt gebruikt), waarbij de monster afgelopen ^7. Kwantitatieve informatie kan door de representatieve ablatie van standaard referentiematerialen, die kunnen worden geproduceerd met diverse verschillende benaderingen ^8, elk met een verschillende mate van technische problemen en analytische bruikbaarheid. De meest gebruikelijke benadering gebruikt matrix-matching, terwijl een standaard met een overheersende chemische samenstelling vergelijkbaar met die van het monster wordt bereid door spiking met de doelanalyt en nauwkeurig onderzocht op homogeniteit en absolute metaalconcentratie van onafhankelijke analytische middelen ^9, 10. Ablatie van bereide standaarden kunnen vervolgens worden gebruikt voor externe calibratie doeleinden, zodat concentratiegegevens beeld de resulterende monster van per pixel te extraheren.

Beeldresolutie wordt bepaald door zowel de bundelgrootte en de snelheid waarmee het monster wordt afgetast. De standaard quadrupool-ontwerp ICP-MS (die meer dan 90% van alle geïnstalleerde ICP-MS systemen wereldwijd ¹¹⁾ een sequentiële massa-analysator, doordat de massadetector doorloopt alle geselecteerde massa-tot-lading verhouding (m / z ) in plaats van gegevens tegelijkertijd verzamelen. Zo moet de acquisitietijd voor elke cyclus van massa gelijk aan de tijd die het monster een breedte van de laserstraal doorlopen te zorgen voor een pixel representatief is voor de gewenste resolutie wordt verkregen ^12. Laserstraal grootte selectie is een cruciale parameter die aanzienlijke gevolgen hebben voor zowel de gevoeligheid en de totale analyse tijd heeft. Laser ablatie physitisch verwijdert materiaal dat wordt geveegd met de ICP-MS door een draaggas argon, de hoeveelheid materie die fysiek met de massa analysator kan worden gedetecteerd volgt kwadratenwet. Een vermindering van de laserstraal diameter 50-25 urn resulteert in een vermindering van geablateerd materiaal met een factor vier. Bovendien, als scanmethode kleinere straaldiameters verhogen de totale tijd die nodig is om een ​​geselecteerd gebied ablatie. Daarom proefopzet is essentieel om de vereiste ruimtelijke resolutie en gevoeligheid behoeften en tijdsdruk evenwicht.

Beeldvormend LA-ICP-MS werd toegepast op een reeks monsters, matrices en ziektetoestanden, waaronder diermodellen van neurologische aandoeningen ^{13, 14,} traumatisch hersenletsel ^15, verdeling van metaalbevattende antikanker geneesmiddelen ^16, giftige stof blootstelling in de placenta ¹⁷ en metalen distribution in tanden als een biomarker van het vroege leven dieet overgangen. ¹⁸ In dit protocol beschrijven we een algemene werkwijze voor het afbeelden van ijzer, koper en zink in de WT muizenhersenen met een resolutie van 30 urn, hoewel het gemakkelijk kan worden aangepast aan verschillende soorten monsters en experimentele resultaten, op basis van de behoeften van de analist.

Protocol

Hierin beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Howard Florey Animal Ethics Committee en zich aan de National Health en Medical Research Council normen van de verzorging van dieren.

1. Voorbereiding van het te analyseren monster

OPMERKING: Deze stap is afhankelijk van het monster matrix te analyseren.

1. Monstervoorbereiding en snijden
   OPMERKING: Fixatie middels 4% paraformaldehyde (PFA) en cryoprotection in 30% sucrose in 0,1 M PBS zal resulteren in verschillende hoeveelheden van uitloging van metalen uit weefsel. Zie Hare et al ¹⁹ voor specifieke details. Zorg ervoor dat alle monsters zijn identiek fixatie en cryoprotection stappen ondergaan.
   1. Transcardially perfuseren het dier geëuthanaseerd met ijskoude 0,1 M PBS, pH 7,4 (zie de paragraaf Methods in Dodt et al. ²⁰ voor details) en verwijder de hersenen.
   2. Plaats de hersenen in 4% PFA O / N om het weefsel te bevestigen.
   <li> Cryoprotect de hersenen door het plaatsen van het in 30% sucrose in 0,1 M PBS gedurende 24 uur, en dan overstappen op vers 30% sucrose voor nog eens 24 uur. ¹⁹
   3. Bevries de hersenen in een cryostaat bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
   4. Monteer de hersenen op een boorkop met een geschikt montage medium.
   5. Sectie van de hersenen op een cryostaat met behulp van een metalen-vrij besteedbaar mes (bv polytetrafluorethyleen [PTFE] -gecoate messen) en monteren op een standaard microscoop dia. De optimale dikte voor de sectie moet ongeveer 30 urn.
2. Bij gebruik van in paraffine ingebedde monsters, sectie op de gewenste dikte, drijven het lint op een warm waterbad en monteren op standaard microscoop dia's.
   LET OP: Precieze effecten van langdurige fixatie en paraffine-inbedding van biologische monsters zijn niet bekend. Zoals beschreven in 1.1, zodat alle monsters zijn identiek monstervoorbereidingsprocedures ondergaan als vergelijkende analyse is bestemd.
   1. dewax pa-Raffin ingebedde monsters door dompelen van de schuif 3 veranderingen van xyleen, 1 verandering elk: 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en minimaal 3 veranderingen in ISO 3696 of gelijkwaardig gezuiverd water (hierna aangeduid als " water ', zie Hare et al ²¹ voor een gedetailleerde methode)..
3. Sta monsters aan de lucht drogen gedurende ongeveer 1 uur in een stofvrije omgeving, zoals een schuifkast met de verticaal in rekken geplaatst monsters en het deksel kier.

2. Bereiding van Matrixgekoppelde Standards

OPMERKING: De volgende is een samengevat protocol eerder gepubliceerd ^9. Raadpleeg de originele papieren voor gedetailleerde stappen voor het voorbereiden matrixgekoppelde weefsel normen.

1. Het verkrijgen van commerciële lam hersenen (of iets dergelijks) en spoel in het water, het verwijderen van al het bloed en bindweefsel.
2. Met behulp van een scalpel, zorgvuldig ontleden ongeveer 50 g van de corticale tissue en gedeeltelijk homogeniseren middels een handbediende weefselhomogenisator met een polycarbonaat wegwerpbare probe op laag vermogen. Verdeel het deeg in 5 g porties, met het nummer afhankelijk van de kalibratie assortiment en het aantal gewenste ijkpunten.
3. Worden de oplossingen van metalen Voor iedere standaard spike door het oplossen van een oplosbaar zout van elk analyt (bijvoorbeeld FeSO ₄ · H ₂ O) in 1% salpeterzuur 0,1, 1 en 100 mg metaal mL ^-1 voorraden produceren.
4. Voeg een vooraf berekende volume van de stockoplossing aan de 5 g gealiquoteerde weefsel (bijvoorbeeld, 5 ui 10 mg ^ml-1 voor een benaderde uiteindelijke concentratie van 10 ug ^-1 g nat weefsel) een reeks spiked metaal niveaus bereiken elke norm.
   1. Afhankelijk van de gewenste eindconcentratie van elke standaard, een combinatie van elk metaal stockoplossing aan de minimale hoeveelheid oplossingen worden toegevoegd aan de standaard te waarborgen. Voeg een laatste piek van water aan elke standaard equi verzekerenvalent volumina toegevoegde vloeistof aanwezig in elke standaard.
   2. Homogeniseer de spiked normen op laag vermogen ongeveer 30 s. Indien niet direct wordt gebruikt, blijven bevroren bij -20 ° C in afgesloten polypropyleenbuizen afgesloten met Parafilm.
5. Bepaal de juiste concentratie en homogeniteit van iedere standaard met een van de volgende procedures:
   1. microgolfontsluiting
      1. Plaats 6 nauwkeurig afgewogen (ca. 50 mg) aliquots standaard in een gewassen PTFE ontsluitvat en voeg 4 ml geconcentreerd (65%) salpeterzuur en 1 ml 30% waterstofperoxide. Seal en te verteren bij 500 W gedurende 30 min.
      2. Na afkoelen van het ontsluitvat, wordt in een zuurkast en kwantitatief de verteerde oplossing met een zuur gewassen 50 ml buis met behulp van 10 ml porties water. Voeg ongeveer 50 ml, en nauwkeurig wegen van de massa van de uiteindelijke oplossing.
      3. Herhaal stap 2.5.1.1 - 2.5.1.2 voor elke standaard.
   2. Gebruik de volgende procedure als microgolfontsluiting apparatuur niet beschikbaar is:
      1. Plaats zes nauwkeurig gemeten (tussen 25 - 200 mg) monsters van de standaard in zuur gewassen / metal-vrij polypropyleen buis en Lyophilize O / N.
      2. Voeg 40 ul van geconcentreerd salpeterzuur en warmte, afgetopte op een verwarmingsblok bij 70 ° C gedurende 5 min en voeg 10 ul 30% waterstofperoxide. Warmte nog eens 5 min, en vervolgens nauwkeurig te brengen in 1 ml totaal volume met 950 ui 1% salpeterzuur.
         OPMERKING: Het is raadzaam om een ​​gecertificeerd referentiemateriaal te verteren met behulp van de methode bij uitstek om ervoor te zorgen spijsvertering procedures juist zijn.
6. Bepaal de concentratie van metalen in elke vertering oplossing oplossing verneveling ICP-MS met behulp van een standaard protocol. Beoordelen van homogeniteit van elke standaard door het bepalen van de relatieve standaardafwijking (% RSD) tussen elke portie. Zorg ervoor% RSD vallen allemaal binnen de 15%. Met behulp van de gemeten massa van each monster, het berekenen van de precieze metalen concentratie van elk gehomogeniseerd weefsel norm.
7. Terugkerend naar het gehomogeniseerde weefsel standaard, pak een 5 x 5 mm plastic wegwerp histologie schimmel en bevriezen iso- pentaan gekoeld in vloeibare stikstof. Verwijder de bevroren standaard weefselblokje uit de matrijs en punt op een cryostaat op dezelfde dikte als het monster.
   Opmerking: Het is raadzaam om een ​​aantal secties te bereiden op verschillende dikten voor toekomstige experimenten. Luchtgedroogde standaard kan onbeperkt worden bewaard in een luchtdichte en stofvrije container.

3. Bereiding van LA-ICP-MS analyse

1. Plaats normen en monster in de ablatie kamer, ervoor te zorgen dat ze binnen de scherptediepte van de CCD-camera gemonteerd op de LA-eenheid. Als het afstemmen van het instrument nodig is, zijn voorzien van een geschikt referentiemateriaal (bv, NIST 612 Trace Elements in Glass). Vinger-draai de twee schroeven aan de kamerdeur te verzegelen the ablatie kamer.
2. In de ICP-MS software, selecteert u openen de argon gas klep in de 'Maintenance' of soortgelijke paneel en zet de vervoerder gasstroom naar 1,2 L min ^-1 in het daarvoor bestemde dialoogvenster.
   Opmerking: In dit protocol argon wordt gebruikt als het dragergas. Verschillende voorbeelden gebruikt u helium of een mengsel van helium en argon als dragergas. Zie Günther en Heinrich ²² voor technische details voor het gebruik van helium en argon mengsels Vanwege aerosol carrier gassen.
3. In de LA software, klikt u op de 'purge' knop om de cel met argon gas te spoelen voor een minimum van 30 min.
   LET OP: Purge tijd kan worden gewijzigd door te klikken op een 'purge time' of een vergelijkbare knop. Bij gebruik van een ablatie systeem met een twee-volume ablatie cel periodiek verplaatsen het podium elke hoek en diagonaal dwars door de cel zodat een zo resterende lucht uit de cel mogelijk verwijderd. Dit kan worden bereikt door het selecteren van de 'home stages of equivalent functie.
4. Schakel de ICP-MS op de pagina "plasma op en laat opwarmen twee uur, gedurende welke stappen 3,5-4,4 kan worden uitgevoerd. Instrument instellingen variëren tussen de fabrikanten, maar een voorbeeld van geschikte LA-ICP-MS werkomstandigheden kunnen worden gevonden in Hare et al. ^10.
5. Vertegenwoordiger ablatie van weefsel normen
   1. Selecteer de regel gereedschap en trek een enkele lijn van ablatie ongeveer 3 mm lang over het weefsel oppervlak.
   2. Stel de parameters als volgt door met de rechtermuisknop te klikken op de lijn van ablatie in het experiment lijst en het veranderen van de volgende: bundeldiameter (zo nodig door de gebruiker gekozen, een 30 urn vierkante balk wordt hier gebruikt), scansnelheid (4 keer de straal diameter per seconde; 120 micrometer s ^-1) en energie fluentie (0,3 -0,5 J cm ^-2 voor zacht weefsel; optimaliseren indien nodig voor hardere matrices). Op 30 urn weefsel dikte van de laserstraal niet de volledige thic doordringenkness van dit weefsel, waardoor eventuele verontreiniging uit de microscoop drager. Normaliseren koolstof ²³ kan worden gebruikt om te corrigeren voor variatie in de hoeveelheid weefsel geablateerd. Stel deze parameters als de standaard voor elke volgende regel voor het selecteren van de 'default' radioknop.
   3. Dupliceren deze lijn zes keer door het selecteren van de eerste lijn, de rechtermuisknop te klikken en te kiezen voor 'dubbele scans'. Controleer lijnen zijn verschoven in de x- - of y-as van de bundeldiameter. Dit geeft een totaal van zeven lijnen per standaard, op afstand van elkaar volgens de bundeldiameter.
   4. Herhaal stap 3.5.1 - 3.5.3 voor elke standaard, zodat de lijn van dezelfde lengte.
6. Om de ablatie gebied te tekenen over het monster, volgt u een van de volgende twee methoden:
   LET OP: Zorg ervoor dat de dezelfde scan parameters (bundeldiameter, scansnelheid, energie fluentie) worden gebruikt voor het monster lijnen.
   1. Als het LA systeem is uitgerust met eenbreed gezichtsveld, selecteert u de regel gereedschap en trek een lijn van de linker bovenhoek van het monster lang genoeg om het monster op zijn breedste punt met behulp van dezelfde laser parameters geschetst in 3,5 dekken. Dupliceren deze scan zoals in 3.5.3 met lijnen onderlinge afstand overeenkomt met de bundeldiameter zo vaak als nodig om volledige dekking van het monster te verzekeren.
   2. Als breedbeeld veld beschikbaar, te bepalen en de x- en y-coördinaten nemen (meestal op het hoofdscherm als 'stage positie "en dergelijke) corresponderend met de hoeken van een rechthoek over de gehele monster. Gebruik deze coördinaten om parallelle lijnen van ablatie voor de gehele steekproef gebied zoals beschreven in 3.7.1 te positioneren.
   3. Teken lijnen voor onderbroken scannen van de normen ten laatste na ~ 20 uur voor het scannen van het monster door het herhalen van de in 3.5 beschreven werkwijze. Afhankelijk van de duur van de scan monster kan meerdere keren worden vereist. Beëindig het experiment met een addinele scan van de normen.
      OPMERKING: Bij het bepalen van de x- en y-coördinaten, terwijl de cel wordt gespoeld, selecteren uitgangsposities en de bijbehorende kalibratie van de as verandert de eerder dat het verschil verkregen bijzonderheden voor de x- en y-coördinaten (dat wil zeggen de lengte van de lijn) zal zijn onaangetast.

4. Installatie Data Acquisition Methoden voor de ICP-MS

1. Voor de standaard lijn van ablatie, verdeel de lengte van de lijn door de laser scan snelheid aan de totale analyse tijd voor een enkele lijn te bepalen. Herhaal dit voor het monster lijn.
2. In de ICP-MS software, maak een nieuwe methode (hier afgebeeld als een "partij"), en ervoor te zorgen dat 'time opgelost analysis' of gelijkwaardig is geselecteerd. Selecteer de m / z waarden te detecteren, en pas de integratie tijd voor elke m / z, zodat de totale integratie tijd voor een cyclus is gelijk aan 0,25 s. Klik op 'Save Batch Zoals 'en de naam dienovereenkomstig (bijv STD1).
   Opmerking: Als het monster de laserstraal doorlopen vier maal de bundeldiameter, dit zorgt voor een gegevenspunt voor elke massa gelijk aan de bundeldiameter ¹² opgenomen. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van een 100 urn vlekgrootte, een scansnelheid van 400 micrometer s ^-1 met een integratietijd van 0,25 s worden beelden met ware pixelgroottes produceren. Integratietijd worden aangepast om de gevoeligheid te verbeteren; bij het verhogen integratietijd tot 0,33 s scansnelheid worden vertraagd tot driemaal de bundeldiameter.
3. Voor de normen, voert de analyse tijd voor elke lijn scan in het desbetreffende vak, plus een extra 15 s rekening te houden met laser warm-up en wash-out tijden. Voer een monster run lijst (dat wil zeggen de volgorde waarin de scans worden uitgevoerd) met hetzelfde aantal acquisities (meestal genummerd, dat wil zeggen 001, 002, etc.) als het totale aantal standaard regels.
4. Voor de steekproef, Dupliceren de methode die wordt gebruikt voor de normen die door het opslaan van de huidige methode of de partij met een alternatieve naam van het bestand, en pas de totale overnameprijs (inclusief de extra 15 s) en het totale aantal overnames om het aantal regels dat het monster zal ablatie overeenkomen .
   OPMERKING: Aangezien de meeste LA-ICP-MS systemen een enkele trekker (LA triggers ICP-MS), is het essentieel dat de ICP-MS software wacht op de trekker van de LA voor de volgende lijn van ablatie begint. De overname venster ICP-MS zal lezen 'wachten voor de start'.

5. Het uitvoeren van de Experiment

1. Start de ICP-MS omzeilen door toevoeging van de eerste methode of partij aan de wachtrij en zorgen voor de software wacht de trekker van het LA systeem.
2. In de LA-software, kan de laser voeding door te klikken op 'uitstoot', klikt u op 'run' en stel de laser opwarmtijd tot 10 s en wash-out tijd tot 20 s in de daarvoor bestemde vakken.
   Opmerking: deze overschrijding zalzorgen voor de ICP-MS is klaar om te beginnen met het werven van nieuwe gegevens wanneer de laser begint elke volgende lijn van ablatie.
3. Start de laser reeks door te klikken op 'start'. Bij gebruik van een twee-volume cel, zorgen voor het monster beker is op zijn plaats.

6. Het berekenen Kwantificering Standards

LET OP: Er zijn meerdere varianten voor het omzetten van ICP-MS-gegevens in beelden. Deze omvatten het gebruik van zelfgemaakte software tools geschreven in open-source talen ^{17, 24, 25, 26} commerciële macro's en data-analyse software. ⁷ gebruiken hier de recent ontwikkelde software plugin (in Paul et al. Beschreven ^27), gebaseerd op een gespecialiseerde LA-ICP-MS data analyse suite ^28.

1. Breng alle de partij mappen met de run data (001.d, 002.d, enz.) Op eenaparte computer met de analysesoftware geïnstalleerd. Pak het * .csv gegevensbestanden voor elke lijn van de partij in een aparte map.
   LET OP: Het gebruik van een script om automatisch over te dragen * .csv bestanden in een nieuwe map wordt sterk aanbevolen. Zie bijgevoegde Python-code voor meer informatie. Dit script is geschreven om ofwel een Agilent 7700 of 8800 Series ICP-MS te passen, maar kan worden bewerkt om de output file van andere fabrikanten aan te passen.
2. Open de software platform en volg de tabs achtereenvolgens invoeren en analyseren van de normen kwantitatieve beelden te produceren zoals hieronder beschreven.
3. Om de gegevens van de eerste standaard batch importeren, selecteert u 'Agilent .csv' voor 'File Type', 'volledige map' voor 'het type Import' en controleer of de 'Date format' is identiek aan de computer-formaat. Klik op 'Import', selecteert u de map met de CSV-bestanden voor de eerste set van normen, en ga naar het tabblad 'Baselines'.
4. Baselineaftrekking
   1. Gebruik het tabblad 'Automatic Selecties' (opdracht 2) uit de belangrijkste toepassing dropdown menu in de werkbalk, selecteert u 'Informatie van import' en klik op 'Doorgaan'.
   2. Klik op 'Alles selecteren' en selecteer 'Baseline_1' voor integratie.
   3. Om de eerste 10 seconden in elke scan lijn (overeenkomend met de laser warm-up tijd) te selecteren, bijsnijden van de gegevens door het invoeren van tweede waarden '0' en '(duur van de lijn - 10 s)' en klik op 'integraties Add' (bv , voor een 35 s scan lijn, voert u waarden '0' en '25').
5. Om het monster gegevens te selecteren, gebruikt u het tabblad 'Automatisch Selecties', zoals beschreven in 6.4, maar kies 'Output_1', zoals de integratie. Crop data vanaf het begin en einde van elke standaard lijn naar de achtergrond signaal uit te sluiten (bijvoorbeeld voor een 35 s scan lijn, voert u waarden '13' en '4').
6. Druppels uit te sluiten in het signaal veroorzaakt door mogeble gaten in de normen, in het tabblad 'Samples', klikt u op 'Channels' in de linkerbovenhoek van de grafiek gebied om een kanaal met een hoge signaal-ruisverhouding (bv C13 of P31) te selecteren. Maak een notitie van eventuele scherpe dalingen in het signaal en selecteer een CPS-waarde laag genoeg dat lager is dan de normale variatie in de monsters, maar hoog genoeg op te halen uit de scherpe dalingen in het signaal.
7. Klik op het tabblad 'DRS' en selecteer 'Baseline_Subtract' voor de 'Huidige gegevens Reduction Scheme'. Kies het kanaal van 6,6 voor 'Index Channel' en de CPS waarde voor 'Threshold om te gebruiken bij het maskeren van zwakke signalen'. Plaats een waarde <0,5 s voor 'Seconds to vóór trimmen / na laag signaal om rekening te houden met de vertraging in de signaaloverdracht van de laser naar de ICP-MS.
8. Om voldoende maskering van de lage signaal gebieden bevestigen, klikt u terug naar het tabblad 'Samples' en selecteer een verwerkt (bijv., Fe56_CPS) kanaal trace. Herhaal en verfijnen van de CPS en & #39; Seconds to vóór trimmen / na het waarden zwakke signalen ', zoals in 6.7 indien nodig.
9. Klik op het tabblad 'Resultaten' en kies 'export gegevens' uit de belangrijkste toepassing dropdown menu. Voer een bestandsnaam om een spreadsheet bestand van de resultaten (bijv STD1 berekeningen STD2 ...) te genereren.
10. Open het gegevensbestand in een geschikt spreadsheetprogramma en bereken de CPS-waarden voor elk kanaal worden gekwantificeerd. Gebruik de voorafbepaalde metaalconcentraties uit de oplossing verneveling ICP-MS om de omzetting te berekenen van CPS-waarden in ppm (ug g ^-1) voor elk kwantificeerbare element.
11. Herhaal stap 6,3-6,10 voor alle sets van de normen in de aanloop.

7. Constructing Kwantitatieve Images

1. Schrijf 'Biolite ()' in de opdrachtprompt het openstellen van de software.
2. Importeer de sample gegevens door te klikken op 'Afbeeldingen laden' en het selecteren van de map met de CSV-bestanden for imago van de steekproef.
3. achtergrondcorrectie
   1. Klik op het tabblad 'Baselines' op de achtergrond correctie toe te passen voor de steekproef. Op de afbeelding fosfor (P31) gevraagd op het scherm, het openbaar vervoer van de achtergrond met behulp van de rechthoek draw tool. Het selecteren van zo veel regio's mogelijk een beeld-brede kaart van het signaal / plasma drift op een passende vergoeding van deze verstorende factoren te garanderen.
   2. Om de achtergrond signaal beter zichtbaar te maken, selecteert u het gereedschap grafiek bewerken (linksboven van het weergegeven beeld) en klik op de rechterkant van de afbeelding. Kies 'Wijzig Image Appearance' en verander de 'First kleur op Z =' om een grote negatieve waarde (bv -100.000). Ga verder door te klikken op 'Done'.
4. Klik op het tabblad 'Standards' om een ​​tafel voor CPS / ppm correctiefactoren te brengen. Voer waarden berekend uit de normen stap 6,10 voor elk element. Deze stap helpt om te corrigeren voor de gevoeligheid drift in de ICP-MS. Klik op 'Go! '
5. Open 'Data Browser' van het tabblad 'Data', die de foto's voor elk element en elke stap houdt.
6. Om een ​​beeld voor de export af te ronden, selecteert u de gewenste afbeelding in de map 'StdCorrImages', met de rechtermuisknop op de afbeelding naam (* _ppm) en klik op 'newimage'. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding om te openen 'Modify Image Appearance' om een ​​gewenste kleur tafel en kleur schaal te kiezen. Voeg een kleur schaal aan het beeld door met de rechtermuisknop te klikken op het beeld en 'Annotatie toevoegen' te selecteren. Selecteer 'ColorScale' uit de top-links dropdown-menu en gebruik de tabbladen om de gewenste kleur schaal te wijzigen.
7. Om een ​​beeld te exporteren, zorg ervoor dat het beeld in kwestie is geselecteerd en ga naar het tabblad 'Bestand' en klik op 'Save graphics ...'. Selecteer het gewenste formaat en sla de afbeelding. Als alternatief kan de geselecteerde afbeelding worden overgebracht met behulp van het kopiëren en plakken gereedschappen.
8. Herhaal stap 7.6 en 7.7 voor alle beelden van belang.
9. Quantifying afzonderlijke gebieden
   1. Om de ROI gereedschap te activeren, ga naar 'Analysis' tab, 'pakketten' en selecteer 'Image Processing'.
   2. Selecteer de gewenste afbeelding en ga naar het tabblad 'Beeld' en klik op 'ROI ...'. Klik op 'Start ROI draw' en gebruik maken van een tekening gereedschap om een ​​gebied van belang in het monster te selecteren. Tekening af te maken, klikt u op 'Finish ROI'.
   3. Om de statistieken voor de geselecteerde ROI te verwerven, ga naar het tabblad 'Beeld' en klik op 'Stats ...'.
   4. Kopieer en plak de resultaten naar een aparte spreadsheet. Herhaal ROI selectie (7.9.2) voor alle regio's en elementen van belang.

Representative Results

Om de mogelijkheden van deze LA-ICP-MS imaging benadering tonen, een eenvoudig experiment met een enkel stuk WT C57BL / 6 muizenhersenen, doorsneden in het corpus callosum en deelbaar in het frontale vlak wordt gepresenteerd. Een werkstroom voor de analyse van gegevens met behulp Biolite (figuur 1), zoals beschreven in de paragrafen 6 en 7, en voor het verschaffen van een representatief beeld van metaaldistributie in de sectie analyse (figuur 2) is ook beschreven.

Zoals blijkt, metaalverdeling in muizenhersenen varieert volgens anatomisch gebied. Dit kan worden toegeschreven aan de variabele rollen metalen, en meer bepaald de eiwitten waaraan ze gebonden zijn, spelen in elk hersengebied ^27. Bijvoorbeeld ijzer meestal hoger concentraties in de middenhersenen en langs de dentate gyrus, terwijl zink is het meest overvloedig in de cortical gebieden. Koolstof, hetgeen een algemeen gebruikte interne standaard ^8, homogeen verdeeld. Elemental kaarten (figuur 2) kan bijzonder nuttig zijn wanneer gebruikt in combinatie met bestaande anatomische en functionele referentie atlassen ^29, waarbij gegevens over de colokalisatie van metalen kan de expressie van specifieke metaalbindende eiwitten kan inzicht in de functie van metalen in hersenen regio, of veranderingen in de metaal niveaus in lijn met een geïdentificeerde ziekte-gerelateerde biomolecuul. Met de beschreven benadering, die is geoptimaliseerd voor een breder scala analyten, uitsluit gevoeligheid voor lage abundantie elementen zoals mangaan en werkwijzen kunnen worden aangepast om voornamelijk richten op het analyt door het verhogen verblijftijden ten koste van andere gemeten massa.

Het grote voordeel bij het gebruik van beeldvorming door LA-ICP-MS is het observeren van relatieve verschillen in metalen concentratie en de verdeling tussen de experimentele groepen. We hebben eerder gebruikte techniek om dergelijke verhoogde strijken na een insult neurotoxine nabootsen PD ^{2, 10,} en veranderingen in corticale ijzer niveaus in Alzheimer weefsel ²¹ te tonen. Dergelijk protocol zoals hier beschreven kan gemakkelijk worden aangepast aan andere typen weefsel met minimale wijzigingen in de genoemde methoden.

Figuur 1: Workflow voor Beeldverwerking. Workflow een aanvulling op de artikelen 6 en 7, beeltenis van verwerking van ruwe tijd opgelost gegevens van de ICP-MS kwantitatieve beelden van metaal distributie in de hersenen van muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Typische Elemental Verdeling van Biometalen binnen een muizenhersenen. Vertegenwoordiger element kaarten van een 30 urn dikke coronale gedeelte van een enkele muis hersenhelft geanalyseerd met LA-ICP-MS. Beelden voor koolstof-13 (C13), magnesium-24 (MG24) en fosfor-31 (P31) weergegeven in Gold kleurschalen (tellingen per seconde; CPS) (bovenste rij). Kwantitatieve beelden (onderste rij) voor mangaan-55 (Mn55), koper-63 (Cu63), ijzer-56 (Fe56) en zink-66 (Zn66) weergegeven met bijbehorende BlueHot kleurschalen (ug g ^-1). Totale analysetijd het hersenpreparaat ongeveer 5 uur. Schaal bar = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Imaging metalen in neurologisch weefsel is slechts één voorbeeld van hoe dit protocol nuttige informatie over de verdeling en hoeveelheden metalen in een biologische matrix kunnen verschaffen. Hoewel bereiding van standaard referentiematerialen lastig kan zijn, is een experiment dat eens kunnen worden uitgevoerd en gearchiveerd voor later gebruik.

LA-ICP-MS heeft bepaalde voordelen boven andere werkwijzen, zoals synchrotrongebaseerde X-ray fluorescentie microscopie, vooral wat betreft toegankelijkheid en gevoeligheid. Er zijn echter bepaalde nadelen die moeten worden overwogen bij het bereiden van een experiment met LA-ICP-MS, en als zodanig vaak een nuttige aanvullende techniek voor chemische beeldvorming dat alternatieve metal analysetechnieken, evenals vergelijkende histochemie ⁵ omvat.

Afstemming met bekende anatomische kenmerken van de hersenen van muizen kunnen nuttige informatie over de mogelijke functionele relati biedenonship tussen metal niveaus en ruimtelijke verdeling. Eerder hebben we de Allen Brain Atlas online resource, ²⁹ dat is een open-access opslagplaats van zowel anatomische en genexpressie data in de C57BL / 6 muizenhersenen ruimtelijke correlatie van zowel metal-afhankelijke enzym expressie ¹⁴ en neuroanatomy ²⁷ onderzoeken ^{gebruikt, 30.} Andere bronnen, zoals inproefdierhersenen WorkBench ³¹ zijn ook beschikbaar om te helpen met de registratie en uitlijning van metaalbeelden te helpen bij correcte identificatie van metaaldistributie vaak in kleine anatomische gebieden.

Toepassingen van deze techniek zijn nuttig bij de beoordeling van hoe metalen niveaus en distributie verandering op de microschaal gedurende zowel normale gebeurtenissen in het leven (bijvoorbeeld vergrijzing) en bij de ziekte van staten; en bestuderen van de effecten van zowel metaalbevattende verbindingen en geneesmiddelen ontworpen te richten meTal metabolisme. De huidige grote beperkingen van LA-ICP-MS als een beeldvormende techniek voor ruimtelijk beoordelen van metalen distributie zijn throughput en gevoeligheid. Er is een afweging tussen de snelheid van de analyse en de ruimtelijke resolutie van ^{5, 12,} met een hogere resolutie beelden die langere analyse keer. De techniek is geschikt voor biologische elementen bij hogere concentraties, hoewel elementen zoals mangaan, kobalt en seleen beperkt door de lage overvloed in normaal weefsel en / of beperkingen in hun detectie met conventionele ICP-MS. Nieuwe ontwikkelingen in ICP-MS technologie, zoals de introductie van triple-quadrupool massa-analysatoren, mogelijk maken om gericht detectie van moeilijke analyten, zoals selenium ³² bij hogere gevoeligheden ^33. Als een technologie-gedreven procedure, de vooruitgang in zowel laser en massaspectrometrie ontwerp zal deze beeldvormende techniek blijven evolueren zien, het verhogende snelheid van de analyse en gevoeligheid ^34.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soda glass microscope slides	n/a	n/a	Typical slides are suitable for all experiments
PTFE-coated microtome blades	C.L. Stuckey	DT315R50	Blade size depends on cryostat blade holder. Check before ordering.
Parafomaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	16005	Any supplier suitable
Sucrose	n/a	n/a	Commercial grade white sugar is suitable
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5368	Premixed sachets listed, can be prepared according to normal laboratory protocols
Xylene	Sigma-Aldrich	247624	Any supplier suitable
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Any supplier suitable
Lamb brain	n/a	n/a	Available from most local butchers
Metal salts	n/a	n/a	Use water soluble metal salts containing desired analytes
Omni TH Tissue Homogeniser	Omni Inc	THP115	Alternative homogenizers are suitable
Polycarbonate homgenizer probes	Omni Inc	TH115-PCRH
Microwave digestion unit	n/a	n/a	Optional. See Section 2
1.5 mL microfuge tubes	TechnoPlas	P4010	Metal-free polypropylene tubes. Acid washed tubes are also suitable
65% nitric acid	Merk Millipore	100441	Trace analysis grade
30% hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	95321	Trace analysis grade
10 x 10 mm disposable cryomolds	Ted Pella	27181
Isopentane	Sigma-Aldrich	76871
Liquid nitrogen	n/a	n/a	Use local supplier
NWR213 Laser Ablation system	ESI Ltd	n/a	Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Used in these experiments. Other manufacturers suitable, may require modifications to protocol
Iolite	Iolite Software	n/a	Available from http://iolite-software.com/. Other methods are available, see protocol
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Avalable from https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm