Abstract
혈장 또는 혈청 무 세포 DNA 순환 존재 널리 많은 종류의 암에 대한 생체의 적합한 소스 것으로 도시되었지만, 몇 가지 연구는 소변 무 세포 (UCF) DNA의 잠재적 인 사용에 초점을 맞추고있다. 더 이상 DNA, 전립선이나 방광 암과 건강한 사람과 환자를 구별 할 수있는 조기 진단 마커로 평가 하였다 UCF의 DNA 무결성의 잠재적 역할은 정상 세포 사멸 세포가 매우 조각난 DNA를 생성 가설하고 암 세포에서 눌렀다 시작.
C-MYC, BCAS1, HER2 및 AR하십시오 UCF DNA 무결성 분석은 250 염기쌍 이상 네 서열 네 정량적 실시간 PCR들에 기초하여 제안되었다. 종종 방광 및 전립선 암에서 증가 된 DNA의 카피 수를 서열 분석을 위해 선택되었지만, 상기 방법은가요 성이며, 이들 유전자는 INTE 다른 유전자로 치환 될 수있는휴식. 바이오 마커의 소스로 UCF DNA의 잠재적 인 유틸리티는 이미 이렇게 UCF DNA 특성에 대한 자세한 연구를위한 방법을 포장, 비뇨 기계 악성 종양에 대한 입증되었다. UCF DNA 무결성 검사는 비 침습적 신속하고 수행하기 쉬운 분석을 수행하는 데 필요한 소변 몇 밀리리터 있다는 장점을 갖는다.
Introduction
무 세포 사멸은 DNA 또는 괴사 메커니즘 혈액 세포 사망으로 인해 소변으로 검출 할 수있다. 혈액의 무 세포 DNA 널리 각종 질병의 진단 및 예후 목적으로, 특히 암 1 연구되고있다. 그러나, 이하 소변 무 세포 (UCF) DNA의 역할에 대한 알려져있다. UCF DNA는 사구체 여과 시스템을 통해, 또는이 둘의 체액 (예 urothelial 세포 또는 전립선 세포)와 접촉 직접 제공 세포로부터 혈액 통과 기인 할 수있다. 바이오 마커의 근원으로 UCF의 DNA의 사용은 주로 요로 3,4- 세포로부터 나오는 DNA UCF의 높은 백분율 신장, 방광, 전립선 암의 조기 진단을 위해 연구되어왔다.
약간은 UCF DNA와 분리하고 특성화하기위한 최선의 방법에 대한 알려져있다. 상기 평가 종양 세포는 정상 세포보다 긴 DNA 단편을 방출한다는 가설을 감안무 세포 DNA의 무결성의 혈행 5 DNA의 출처를 규명하기위한 시도로 검토되고있다. 일부 연구는 혈중 무 세포 DNA 무결성 암 (6)의 여러 유형에 대한 좋은 진단 테스트를 나타내고, 동일한 가설 소변 7-9과 관련하여 제안 된 것으로 설명했다.
이 논문은 방광과 전립선 암 검출에 잠재적 인 응용 프로그램 UCF DNA 무결성 분석을위한 새로운 방법을 설명합니다. 특히, UCF DNA의 무결성 이상 250 bp의 전립선과 방광 암을 포함한 고형 종양에서 증가 DNA의 복제 수있는 것으로 알려져 4 지역에서 시험되었다 프래그먼트 : C-MYC (8q24.21을), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2)와 AR (Xq12) 10-14. 특정 암 유전자가 아닌 임의의 순서는 암 환자의 무 세포 분획을 발견 할 확률을 증가하도록 선택되었다. 의 주요 장점 중 하나이 방법은 유연하고 다른 영역은 또한 종양의 종류 및 특성에 기초하여 선택 될 수 있다는 것이다.
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Protocol
프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
주 :이 프로토콜에서, 우리는 UCF 무결성 DNA 분석을 수행 소변 샘플에서 DNA를 격리. 된 LNCaP 및 MRC 세포 라인 표준을 구성하는 데 사용 하였다. 이러한 특정 종양 유전자에 대한 DNA 추출 (제어 유전자 분광 실시간 PCR, STOX1) DNA 정량 및 실시간 PCR 등의 기술 (도 1)를 수행 하였다.
1. 소변 수집 및 처리
- 깨끗하고, 건조, 플라스틱 컵에 클린 캐치 첫 아침 소변 샘플을 얻습니다. 뇨 샘플의 적어도 50 ㎖ 수집.
- 3 시간의 최대 4 ° C에서 소변을 유지하고 같은 온도에서 실험실로 보내.
- 두 50 ML 원뿔 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 실험실 및 전송에 도착 두 번 즉시 반전하여 각 샘플을 섞는다.
- 튜브를 원심 분리기4 ℃에서 상온에서 10 분 동안 850에서 XG.
- 조심스럽게 세포 펠렛 위에 뜨는 적어도 2ml를두고 두 5 ㎖의 튜브에 소변 상등액의 상부 10 mL로 옮긴다.
주 : 상등액의 상부 전송이 세포 또는 세포 파편에 의한 오염의 위험을 감소시킨다. 상부 및 하부 사이의 명확한 묘사는 없다. - 펠렛을 취소하고 즉시 사용할 때까지 -80 ° C에서 뜨는을 동결.
소변 뜨는 및 세포주 2. DNA 분리
주 : 세포주에서 DNA를 분리 (예를 들어, 된 LNCaP 방광 암 전립선 암 또는 MRC에 대한) 상용 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라. 다음 뇨 상등액으로부터 DNA의 분리 변형 상용 프로토콜을 사용하여 수행한다 :
- 실온에서 소변 상청 한 분취 량을 해동. </ 리>
- 소용돌이 및 소변 샘플을 혼합하고 맑은 5 ㎖의 튜브에 소변 상등액 1㎖를 옮긴다. -80 ° C에서 잔류 소변을 고정.
- 직접 샘플에 테 k의 100 μL를 추가합니다.
- 샘플에 AL 버퍼 1 ㎖를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다.
- 튜브를 닫고 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품어.
- 배양하는 동안, 각 샘플에 대해 하나의 컬럼을 준비하고 제조업체의 지침에 따라 세척 버퍼 AW1과 AW2를 (100 % 에탄올 표시된 금액을 추가) 준비합니다.
- 다시 실온으로 샘플을 가져와 무수 에탄올 1 mL를 넣어. 피펫에 의해 완전히 섞는다.
- 열 단계 2.7에서 얻어진 혼합물 650 μL를 추가하고 1 분 동안 6,000 XG에 그것을 원심 분리기.
- 플로우를 통해이 들어있는 튜브를 버리고 새로운, 깨끗한 수집 튜브에 열을 배치합니다. 샘플 혼합물의 모두 (5 회) 사용 때까지 반복 2.8 및 2.9 단계를 반복합니다.
- 추가 500# 181; 컬럼의 테두리를 적시하지 않고 버퍼 AW1의 L. 1 분 동안 6,000 XG에 그것을 원심 분리기.
- 플로우 스루를 포함하는 튜브를 버리고 새로운 깨끗한 포집 관으로 대체.
- 컬럼의 테두리를 적시하지 않고 버퍼 AW2 500 μL를 추가합니다. 3 분 동안 최대 속도 (20,000 XG)에서 그것을 원심 분리기.
- 플로우 스루를 포함하는 튜브를 버리고 새로운 깨끗한 포집 관으로 대체.
- 단계를 반복 2.12 잔류 세척 버퍼를 제거합니다.
- 깨끗한 1.5 ML의 튜브에 열을 놓습니다. 용출 버퍼 AE의 50 μL를 추가하고 버퍼 적시 그 열을 보장하기 위해 7 분을 기다립니다.
- 1 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기.
- 미니 열에 단계 2.15에서 용리액을 피펫과 DNA의 최대 회복을 보장하기 위해 1 분 동안 최대 속도로 원심 분리.
3. DNA 정량 및 희석
- 분광 광도계를 사용하여, 로봇의 DNA의 정량 분석을 수행H 세포주 소변 상등액 샘플. 제조업체의 지침에 따라, 벤치 탑 분석기에 샘플 2 μL를 사용합니다.
- 1 NG / μL의 농도를 수득하고, DNA의 무결성을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 DNA를 저장할 UCF DNA 샘플을 희석한다.
주 : DNA 양이 실시간 PCR (적어도 100 NG)로 진행하는데 충분하지 않은 경우, 새로운 DNA 분리 과정을 수행한다. - 상이한 농도 여섯 기준을 얻었다 세포주 시료로부터 DNA를 희석 : 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, 2 NG / μL, 100 μL의 부피 (ST1, ST5, ST4, ST3, ST2 각 및 ST6). DNA의 무결성을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 세포주 DNA 기준을 저장한다.
4. DNA 무결성 테스트 - PCR
- 프라이머 (농도 분석의 유형에 따라 달라짐), 녹색 수퍼 믹스 셀 라인 DNA 표준 및 얼음 UCF 희석 DNA 샘플을 해동.
- 판 f를 스트립 튜브를 준비합니다또는 72 웰 로터 디스크. 나누어 각 표준 시료 희석하고 네거티브 컨트롤의 RNase가없는 물 10 μL 중복 10 μL.
- 각 프라이머 1 μL를 혼합하여 준비 (농도는 표 1에 나타내었다) 녹색 수퍼 믹스 12.5 μL, 각 시료의 RNA 분해 효소가없는 물을 6.5 μL. 2 복제, 2 복제에 대한 부정적인 제어,이 여분의 샘플 샘플이 복제에 대한 6 표준 번호 : 믹스를 준비 할 때, 다음과 같은 샘플의 번호를 사용합니다.
- 각 웰에 혼합 나누어 15 μL. 피펫 또는 튜브를 회전하지 마십시오.
- 표 1의 조건으로 PCR 프로토콜을 시작한다.
참고 : 29 × 2 샘플 + 6 × 2 표준 + 음성 대조군 × 2 = 72 (UCF DNA의 값) : UCF DNA 값 29 DNA 샘플을 72 웰 로터 디스크를 이용하여 각각의 실시간 실험을 위해 처리 하였다.
참고 : UCF DNA 무결성 분석을위한 프로토콜도 할 수있다(다른 장치를 사용할 때, ROX 염료가 추가 될 필요가 있음) 다른 PCR 실시간 장비를 사용하여 수행 하였다.
5. DNA 무결성 테스트 - 데이터 분석 및 해석
주 : 앞서 7-9 (도 2)에 기술 된 바와 같이 각 샘플에 대한 UCF DNA 값은 각각의 PCR 유전자 평가를위한 표준 곡선 구조를 사용하여 표준 곡선 보간을 이용한 실시간 장비 검출 시스템 소프트웨어에 의해 수득 하였다.
- 복제 평가; 샘플은 차이가 복제 ≥1 코네티컷은 폐기되어야하며, 두 번째 실험에서 다시는-평가했다.
- 각 샘플에 대해 중간 코네티컷을 계산하고 36 ≤ CT 촬영 값으로 샘플을 고려합니다.
- 융점 분석을 사용하여 PCR 산물의 특이성을 평가한다.
- 표준 곡선으로 보간하여 각 앰플 리콘의 농도를 평가; 각 앰플 리콘에 대한 농도 값 (NG / μL)을 얻었다.
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Representative Results
모든 샘플은 1.51 내지 138 NG / μL의 범위를 보여주는 분석을 위해 총 무료 DNA 농도는 분광 광도법에 의해 정량화 하였다. 다섯 제어 샘플 데이터의 재현성에 사용 하였다 : 두 개의 독립된 실시간 실험 C-MYC, HER2, BCAS1, AR 및 STOX1 수행 하였다. 변동 (CV)의 계수는 두 개의 독립적 인 실험 간 재현성의 좋은 정도 (표 2)와 각 유전자 (표 2)에 대해 계산 하였다.
125 bp의 STOX1 서열을 PCR 억제제들의 존재를 배제하기 위해 분석 하였다. 샘플이 STOX1의 증폭 하였다 경우 UCF DNA 무결성 검사를 수행 하였다. 증폭의 부족 DNA 량이 t을 반복 할 필요성을 나타내는 UCF DNA 무결성 검사를 수행 할 수있는 것을 의미하지새로운 소변 컬렉션 그는 분석. 증폭 방광 및 전립선 암에 대한 STOX1 삭제 가능한 적은 정보가있을 때,이 유전자는 이러한 종양 형태에 대한 제어 시퀀스로서 사용될 수있다. 마지막으로, DNA UCF 무결성 평가 함께 세 종양 유전자 (도 3)에 대해 얻어진 값을 가산함으로써 수행 하였다.
C-MYC, AR 및 HER2 전립선 암 7,8 위해 제안되었지만 C-MYC, HER2 및 BCAS1 유전자의 합계의 사용은 방광암 검출 9 제안되었다. 방광과 전립선 암의 검출을 위해 식별 된 가장 컷오프 값은 각각 0.1 NG / μL 0.04 NG / μL이다. 이러한 컷오프 값을 사용하여, 73 %의 민감성 및 84 %의 특이성 동안 증상 개인 대 방광암 검출 얻었다 58 % 및 민감도 44 % 특이성만 양성 비뇨 생식 기관 질환 7-9 환자에 비해 전립선 암을 검출 관찰되었다. 결론적 UCF DNA 무결성 검사는 유연하므로, 본 연구에 사용 된 유전자는 질환에 따라 관심의 다른 긴 서열로 치환 될 수있다.
그림 1. 소변 셀 무료 DNA 무결성 워크 플로 및 타임 라인. 이 방법의 워크 플로우는 여러 단계와 시간으로 구분된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
을 c-MYC 증폭 물 분석을위한 그림 2. 보고서. 용융 분석 증폭 플롯의 일례및 표준 곡선은 C-MYC 평가에보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. UCF DNA 무결성 분석 워크 플로우. UCF DNA 무결성 분석을위한 간단한 워크 플로우가보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 레퍼런스 시퀀스 | 프라이머 앞으로 | 프라이머 역 | 앰플 리콘 길이 (BP) | 실시간 프로토콜 |
| MYC (C-MYC) (V-Myc와 조류 Myelocytomatosis 바이러스 종양 유전자 동족체 궤적 8q24.21) | NG_007161.1 | TGGAGTAGGG ACCGCATATC | CCCAACACCA CGTCCTAAC | (264) | 40초 40 초 동안 56 ℃, 1 분 동안 72 ° C, 94 ° C에서 45 회 반복이 3 분 동안 95 ° C. |
| ERBB2 (HER2) (ERB-B2 수용체 티로신 키나제 2 궤적 17q12.1) | NG_007503.1 | CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT | TCAGTATGGC CTCACCCTTC | 295 | |
| BCAS1 (유방 암 증폭 순서 1, 궤적 20q13.2) | NC_000020 | GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG | CGTTGTCCTG AAACAGAGCA | (266) | |
| AR (안드로겐 수용체, 궤적 Xq12) | NG_009014.2 | AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT | TGGCTAGTC CTCAGCTT | (265) | |
| STOX1 (Storkhead BOX1 궤적 10q21.3) | NG_012975.1 | GAAAACAGG GCAGCAAGAAG | CAGACAGCAT GGAGGTGAGA | (125) | 40초 94 ° C에서 45 회 1 분 54 ° C 다음 90 초간 95 ° C. |
표 1. 프라이머 시퀀스 및 분석 조건.
| 견본 | HER2 | 이력서 (%) | BCAS1 | 이력서 (%) | ㄴ -MYC | 이력서 (%) | AR | 이력서 (%) | STOX1 | 이력서 (%) | |||||
| Repli - 케이트 1 * | Repli - 케이트 2 * | Repli - 케이트 1 * | Repli - 케이트 2 * | Repli - 케이트 1 * | Repli - 케이트 2 * | Repli - 케이트 1 * | Repli - 케이트 2 * | Repli - 케이트 1 * | Repli - 케이트 2 * | ||||||
| 1 | 0.0 | 0.0 | | 0.1 | 0.1 | 3.4 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | 0.6 | 0.5 | 29.1 | 0.6 | 0.8 | 4.5 | |
| 이 | 2.6 | 2.7 | 2.3 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.5 | 28.6 | 0.1 | 0.1 | 22.0 | 2.6 | 3.0 | 6.1 |
| 삼 | 0.4 | 0.2 | 17.0 | 0.1 | 0.1 | 5.9 | 2.6 | 3.2 | 11.6 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.7 | 1.2 | 23.1 |
| 4 | 0.0 | 0.0 | NE | 1.1 | 1.0 | 3.0 | NE | 0.0 | NE | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | NE |
| (5) | 2.5 | 3.1 | 9.8 | 0.1 | 0.1 | 14.0 | NE | 0.0 | NE | 0.1 | 0.0 | 27.1 | 0.0 | 0.0 | NE |
각각의 유전자 표 2. 실시간 PCR 재현성.
* 결과는 NG / μL로보고
CV, 변동 계수; NE, 평가가 없습니다
| UCF의 DNA 무결성을위한 유전자 | 지용이함 | 암 환자 (N) | 컨트롤 (N) | 잘라 (NG / μL) | 감도 율 (95 % CI) | 특이성 레이트 (95 % CI) | 참고 |
| MYC HER2 BCAS1 | 방광암 | (52) | (46) 증상이있는 개인 (32) 건강한 사람 | 0.1 | 0.73 (0.61-0.85) | 0.83 (0.72-0.94) | Casadio V 등. 2013 (9) |
| MYC HER2 BCAS1 | 전립선 암 | (29) | 25 건강한 사람 | 0.04 | 0.79 (0.62-0.90) | 0.84 (0.65-0.94) | Casadio V 등. 2013 (8) |
| C-MYC AR BCAS1 | 전립선 암 | 67 | 비뇨 생식 기관의 양성 질환 64 명 | 0.04 | 0.58 (0.46-0.73) | 0.44 (0.30-0.58) | Salvi에 S 등. 2015 (7) |
전립선과 방광 암의 조기 진단을 위해 그 결과를 표 3. 요약.
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Discussion
UCF DNA 무결성 분석은 소변에서 DNA의 무결성을 평가하기위한 새로운 비 침습적 방법이다. 이는 최근 블래 9 전립선 암 7,8의 조기 진단을 위해 제안되었다. 장점과 UCF DNA 무결성 검사의 단점의 숫자는 함께 앞으로의 전망과 함께, 여기에 설명되어 있습니다.
접근법의 주된 장점은 저렴하고 비 침습적 방법 및 분자 생물학 기술의 기본 지식을 필요로하는 생체의 잠재적 공급원으로 소변을 연구하기위한 간단한 프로토콜을 제공하는 것이다. 시험은 수행하는 신속하고, 2 작업 일 후에 사용할 수있는 결과, (도. 1)는 쉽게 의사의 도움없이 해석 될 수있다. DNA 만 분리 공정 및이 실시간 PCR들의 구성되는 방식은 또한 좋은 비용 편익 비를 갖는다. 정밀도면에서는 UCF의 DNA 무결성 검출에서 높은 감도 (73 %)와 특이도 (84 %)을 갖증상이있는 환자 9 방광암. 마지막으로, 상기 방법은가요 성이고, 제안 된 유전자는 쉽게만큼 그들은 BP 250 이상이기 때문에, 관심있는 다른 유전자로 치환 될 수있다.
시험은 많은 제한이있다. 첫째, DNA 분광 정량화 방법은 흔히 부정확하며 다른 더 정확 형광 방법 (예를 들어, 큐 비트 또는 picogreen)로 대체 될 수있다. 자주 낮은 280 분의 260과 230분의 260 비율에 의해 입증으로 DNA 품질, 또한 오히려 좋지 않습니다. 또한, 우리의 연구 중 하나에서, 매우 낮은 특이성 (44 %)는 아마도 순환에 더 손상 DNA 방출 양성 염증성 괴사 세포의 결과였다 비뇨 관 (7)의 양성 질환을 가진 환자에 비해 전립선 암 환자들에서 관찰되었다. 양성 질환 모두 전립선 암 환자들과 개인들은 U의 염증 성분을 가질 수 있기 때문에, 중대한 문제rinary 세포. 따라서, 전립선 암의 조기 진단의 컨텍스트 내에서, UCF DNA 무결성 분석 결과가 잘못 될 수있다.
UCF의 DNA 무결성은 비뇨 생식기 계통의 양성 질환과 전립선이나 방광 암, 건강하고 증상이있는 개인, 환자와 환자 314 소변 샘플에서 평가 하였다. 더 큰 케이스 시리즈에 대한 전향 적 연구가 더 비뇨 생식기 계통의 암에 대한 조기 진단 마커로이 방법의 역할을 정의 할 필요가있다.
작은 암에 대한 생체의 근원으로 UCF의 DNA의 주제에 게시되었지만,이 분야에 대한 관심이 증가하고있다. 최근 Togneri 등. 4 건의 방광암 환자의 소변 상등액으로부터 추출 무 세포 DNA 소변 펠렛으로부터 분리 세포 DNA보다 높은 종양 게놈 부담을 보였다하는 흥미로운 논문을 발표하는 무 세포 분획의 연구소변에서 DNA의 비뇨기과 암을 특성화하는 것이 유용 할 수 있습니다.
우리의 경험에서, UCF DNA 무결성 검사는 전립선 암에 대한 좋은 초기 진단 테스트로 증명하지 않았다. 종래의 소변 세포학과 조합하여 사용될 때 반대로 그것은 방광 암의 조기 진단을위한 마커로서 전위 보였다. 더 큰 미래의 케이스 시리즈에 대한 확증 연구는 현재 계획되고있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 mL tubes | |||
| incubator | |||
| -80 °C freezer | |||
| -20 °C freezer | |||
| 10 μL pipette | |||
| 20 μL pipette | |||
| 200 μL pipette | |||
| 1,000 μL pipette | |||
| pipette tips (10; 20; 200; 1,000) | |||
| 1.5 mL tubes | |||
| 50 mL tubes | |||
| 15 mL tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 mL) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10 mL) | Qiagen | 19133 |
References
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