Abstract
De release van extracellulaire blaasjes (EV's), met inbegrip van kleine-endosomale afgeleid exosomes (Exos, diameter <100 nm) en een grote plasma-membraan afgeleid microvesicles (MV's, diameter> 100 nm) is een fundamenteel cellulair proces dat zich voordoet in alle levende cellen. Deze vesicles transporteiwitten, lipiden en nucleïnezuren die specifiek zijn voor de oorspronkelijke cel en in vitro studies hebben het belang benadrukt als mediatoren van intercellulaire communicatie. EV met succes geïsoleerd uit verschillende lichaamsvloeistoffen en vooral EV in bloed werden geïdentificeerd als veelbelovend biomarkers voor kanker of infectieziekten. Om de studie van MV subpopulaties in bloed laten presenteren we een protocol voor de gestandaardiseerde isolatie en karakterisering van MV's uit perifere bloedmonsters. MVs gepelleteerd van EDTA-anti-gecoaguleerd plasma-monsters door differentiële centrifugatie en typisch bezitten een diameter van 100-600 nm. Door hun grotere omvang, kunnen zegemakkelijk worden onderzocht door stromingscytometrie, een techniek die routinematig wordt gebruikt in de klinische diagnostiek en in de meeste laboratoria. Verschillende voorbeelden voor kwaliteitscontrole analyses van de geïsoleerde MV krijgt en markers die kunnen worden gebruikt voor het onderscheiden van verschillende MV subpopulaties in bloed wordt gepresenteerd.
Introduction
In de laatste jaren veel in vitro studies hebben aangetoond dat extracellulaire blaasjes (EV's) een belangrijke rol in intercellulaire communicatie spelen. Levende cellen voortdurend werpen blaasjes die verschillen in grootte, inhoud en biogenese. De best bestudeerde EV's zijn exosomes die afkomstig zijn van het endosomale systeem waar ze als intraluminale blaasjes in multivesiculaire lichamen worden opgeslagen. Zodra deze zekering door het plasmamembraan, worden de vesikels opgenomen uitgebracht exosomes (Exos, diameter 30-100 nm 1). Een tweede populatie van EV, die steeds meer aandacht in de afgelopen jaren heeft opgedaan zijn groot microvesicles (MV's, een diameter van 100 - 1000 nm) die rechtstreeks uit knop van het plasmamembraan 2.
Beide typen vesicles zijn omgeven door een lipide dubbellaag en bevatten nucleïnezuren, bijvoorbeeld DNA, mRNA of miRNA 3-5, en een overvloed aan eiwitten die ze kunnen overdragen aan aangrenzende cells. Terwijl in het algemeen de eiwitsamenstelling van de vesicles geeft de toestand van de cel van oorsprong, sommige eiwitten schijnen selectief gericht en verrijkt op EV 1. Een belangrijk onderzoek belang is om EV's van abnormale en zieke cellen te karakteriseren om specifieke EV handtekeningen die het gebruik van elektrische auto's als nieuwe biomarkers kunnen mogelijk te definiëren. Vooral bij kanker, waarbij vaak de tumor zelf niet gemakkelijk toegankelijk, kan vloeibare biopsieën gericht tumorspecifieke EV in bloed zodat controle van de behandeling of reacties te karakteriseren van de primaire tumor zonder dat invasieve procedures 6.
Inderdaad, EVS reeds met succes geïsoleerd uit verschillende lichaamsvloeistoffen zoals urine 7, CSF 8, moedermelk 9 of bloed 10. Verschillende studies die veranderingen in EV telt en samenstelling verschillende menselijke ziekten. Bijvoorbeeld bij sepsis patiënten het aantal pro-coagulant MVSaanzienlijk toegenomen in vergelijking met gezonde individuen 11. Ook bij patiënten met ernstige cerebrale malaria een toename van de totale MV in bloed kan worden waargenomen en tellingen van bloedplaatjes afgeleide MV correleren met coma diepte en trombocytopenie 12. Andere onderzoeken rapporteren verhoogde aantallen endotheel afgeleide blaasjes bij patiënten met systemische lupus erythematosus of hartfalen en bij de laatste, dit correleert met een hogere kans op cardiovasculaire aandoeningen 13,14.
Vooral bij kanker, EV's in het bloed worden momenteel besproken als nieuwe biomarkers met diagnostische en prognostische waarde. Niveaus van expressie MVs tumor-geassocieerde eiwitten zoals MUC1, EGFR of FAK lijkt te zijn verhoogd in het bloed van borstkankerpatiënten 15,16. Ook voor Exos recente studies hebben aangetoond dat bloed afgeleide Exos uitvoering tumorspecifieke antigenen zoals glypican-1 voor pancreaskanker en Del-1 voor borstkanker laten de vroege ziektebescherming met een hoge specificiteit en gevoeligheid 17,18. Bovendien kan serum afgeleide tumor Exos DNA dat kan worden gebruikt voor detectie van mutaties zoals KRAS en p53 die het gebruik ervan in therapie voorspelling 19 suggereert bevatten. Recente ontwikkelingen hebben aangetoond dat de analyse van Exos in het bloed van glioblastoma patiënten met behulp van een specifiek microfluïdische chip zorgt voor de opvolging van de therapie 20. Tezamen bieden deze bevindingen impliceren dat de analyse van de ziekte-specifieke subpopulaties van blaasjes geeft waardevolle informatie over de diagnose, prognose en therapeutische mogelijkheden en succes.
Echter, isolatie en analyse van Exos uit bloed is tijdrovend, vereist speciale laboratoriumapparatuur en dus nog niet geschikt voor routinematige klinische diagnostiek. Daarentegen kan MV sneller worden geïsoleerd en, vanwege hun grotere omvang, kan gemakkelijk worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie zonder te koppelen zij latex kralen als deze nodig zijn voor Exos 18, 21. Dus hier presenteren we een protocol dat kan worden gebruikt voor de isolatie van gestandaardiseerde MV's uit bloedmonsters en de daaropvolgende karakterisatie van MV subpopulaties met flowcytometrie. Dit protocol zal de verdere studie en diepgaande karakterisering van MV profielen in grote groepen patiënten, die met het oog op MV's voor de dagelijkse klinische diagnostiek gebruiken nodig zullen zijn toe te staan.
Protocol
Alle experimenten met inbegrip van menselijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie (goedkeuring nr. 3/2/14). Voor de keuze van patiënten moet worden opgemerkt dat verschillende factoren zoals leeftijd, geslacht, huidige behandelingsregimes en veel meer kunnen MV preparaat in bloed beïnvloeden en dus in aanmerking stand moeten worden genomen om inzameling 22,23 proeven.
1. Bereiding van plasmamonsters
- Gelijkspel 1-2 buisjes bloed per donor door een 21-gauge vlinder naald in een Vacutainer bloedafname buis met EDTA (1,6 mg / ml bloed). Zorg ervoor dat de buis (s) meerdere keren omkeren om een efficiënte bloed antistolling te garanderen.
OPMERKING: De aanbevolen volume bloed voor daaropvolgende flowcytometrie en Western Blot analyse 5-15 ml. Met het oog op MV degradatie en verlies te voorkomen, moeten bloedmonsters worden behandeld <30 minuten na bloedafname. - Bereid plasmamonsters door centrifugeren van de monsters gedurende 15 minuten bij 1200 xg bijkamertemperatuur (RT).
- Breng een ventielfilter om de scheiding van plasma (= bovenlaag) hulp blijft bloedcellen (= onderlaag).
- Breng het plasma in een 15 ml buis.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1500 xg, RT pellet grotere celafval te verwijderen en de resterende bloedplaatjes.
- Breng het supernatant in een 15 ml buis en direct tot MV isolatie of opslag monsters tot 6 maanden bij -20 ° C.
OPMERKING: De gepresenteerde protocol kan ook worden gebruikt voor MV (en Exos) vanaf celkweeksupernatants isoleren. Om dit te doen, kweken cellen bij 60-80% confluentie gedurende 24 - 48 uur in kweekmedium aangevuld met vesicle verarmd FCS en verzamel de bovenstaande vloeistof. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 750 xg, 4 ° C om achtergebleven drijvende cellen te verminderen, vul de supernatant naar een nieuwe buis van 15 ml en centrifugeer weer gedurende 5 minuten bij 1500 xg, 4 ° C tot grotere celafval te pelleteren. Het supernatant kan vervolgens worden gebruikt voor het isoleren van MVzoals beschreven in stap 2,1-2,16.
2. Isolatie van MV's
- Breng het plasmamonster in een geschikte centrifugebuis. Indien nodig, vul buis met PBS om het monster te verdunnen en het voorkomen van instorting van dunwandige buizen tijdens het centrifugeren procedure.
- Centrifugeer 35 minuten bij 14.000 xg, 4 ° C.
- Giet supernatant, houden buizen omgedraaid en op een papieren handdoek. Wacht 3-5 minuten totdat alle resterende supernatant werd in de handdoek gedrenkt en daardoor uit het monster verwijderd.
- Resuspendeer de pellet in MV 1000 pi PBS, overbrengen naar een 1,5 ml buis en centrifugeer gedurende 35 min bij 14.000 xg, 4 ° C in een tafelblad centrifuge.
- Zuig supernatant.
- Resuspendeer de pellet in MV 50-500 pi PBS, afhankelijk van de grootte van de pellet. Alternatief Lyse MV direct, bijvoorbeeld in RIPA buffer (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-deoxycholaat / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7,2)voor daaropvolgende Western Blot analyse. WINKEL MVs bij -20 ° C. Zij zullen stabiel blijven voor enkele maanden, maar vermijd herhaalde vries-dooi-cycli.
- Optioneel: Bepaal de MV eiwitconcentratie met een eiwit assay (bijv Bradford of Lowry methode) om MV opbrengsten beoordelen of dosis MV's voor daaropvolgende experimenten.
- Indien extra Exos worden geïsoleerd uit de plasmamonsters, decanteer het supernatant uit stap 2.3 in een ultracentrifuge buis en centrifugeer gedurende 2 uur bij 110.000 xg, 4 ° C. Decanteer het supernatant zoals beschreven in stap 2.3, resuspendeer pellet Exo in 1000 pi PBS en overbrengen in kleine (1,5 ml) ultracentrifugatie buizen.
- Ultracentrifuge gedurende 2 uur bij 110.000 xg, 4 ° C, aspireren supernatant en resuspendeer pellet Exo in 50-75 pl PBS of RIPA buffer.
3. Karakterisering van MV's door flowcytometrie
- Transfer 15 pi PBS + 1% vesicle verarmd foetaal kalfsserum (FCS) in een flowcytometrie buis.
OPMERKING: bolletjes-verarmde FCS wordt bereid door centrifugeren warmte geïnactiveerd (30 min bij 56 ° C) FCS gedurende 18 uur bij 110.000 xg en het supernatant filtreren door een 0,2 um filter zoals eerder 24 beschreven. - Voeg 5 ug (bij lage opbrengsten 3 ug eveneens van toepassing) van MV in PBS.
- Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke bindingsplaatsen op de MV oppervlak te blokkeren en daardoor achtergrondkleuring te verminderen.
- Voeg een fluorescent gelabeld antilichaam tegen het eiwit-of-interest. Titreer de hoeveelheid antilichaam die voor de kleuring voor gebruik om de optimale concentratie te bepalen en garandeert een lage signaal-ruisverhouding. Zorg ervoor dat ook een buis met ongekleurde MV als negatieve controle en één tube MV's gekleurd met de bijbehorende isotype controle antilichaam bij dezelfde concentratie (bijvoorbeeld als 1 ug antilichaam wordt gebruikt, ook met 1 ug van het isotype controle een includetibody) op de achtergrond kleuring te kwantificeren.
Opmerking: Het is ook mogelijk om multicolor flowcytometrie uitgevoerd door toevoeging van verschillende antilichamen gekoppeld met verschillende fluorochromen. - Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg 250 ul PBS en ga verder met het meten van het monster met behulp van een flowcytometer.
- Indien de monsters niet direct worden gemeten, voeg 150 ul PBS en 50 ui 4% paraformaldehyde (PFA) monsters en opslag vast bij 4 ° C. LET OP: PFA is giftig. Gebruik handschoenen en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Verminder de drempel van de flowcytometer op de laagste waarde mogelijk en zoeken naar de MV bevolking met behulp van een voorwaartse verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) plot in logaritmische schaal. Hek aan de MV bevolking en evalueert het fluorescentiesignaal op overeenkomstige histogram.
4. Karakterisering van MV's door Western Blotting
- Resuspendeer de pellet direct MVeen geschikte lysisbuffer (bijvoorbeeld RIPA buffer).
- Indien de MV pellet reeds geresuspendeerd in PBS, verdunnen ten minste 1: 1 in een geschikte lysisbuffer (bijvoorbeeld RIPA buffer).
- Bepaal de eiwitconcentratie van MV monster, bijvoorbeeld door Lowry assay.
- Bereid 10-20 ug MV in 22,5 pl RIPA buffer. Voeg vervolgens 7,5 ul 4 x Laemmli laadbuffer en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
- Belasting monsters op een polyacrylamidegel en het uitvoeren van elektroforese en immunoblotting volgens standaardprotocollen.
- Stuur de eiwitten op het membraan, het uitvoeren van een Ponceau-kleuring als ladingscontrole volgens standaardprotocollen.
- Destain membraan in TBST gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Blok membraan gedurende 30 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur in 5% BSA in TBST.
- Incubeer het membraan met het primaire antilichaam bij 4 ° C overnacht en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was het membraan met TBST 3 x 5 min.
- Incubeer het membraan met het HRP-gekoppeld tweede antilichaam bij een verdunning van 1: 10.000 in 5% BSA. Opmerking: In het geval van een hoge achtergrond signalen, gebruik melkpoeder in plaats van BSA.
- Was het membraan met TBST 3x 5 min.
- Ontwikkelen membraan met een ECL detectie reagens en detecteren signalen op chemiluminescentie films of chemiluminescentie beeldvormingssysteem.
LET OP: Om MV's van Exos discrimineren, eiwitten zoals tubuline, actinine-4 of mitofilin worden gebruikt die moeten vooral aanwezig zijn op MV's 16,25 zijn. Let erop dat de meeste tetraspanine antilichamen (bijvoorbeeld, CD9, CD81), gebruikt als merkers voor Exos, niet onder reducerende omstandigheden kan werken en derhalve worden bereid in niet-reducerende laadbuffer gevolgd door verwarmen gedurende 10 min bij 70 ° C.
Representative Results
Om de opbrengst van MV's die geïsoleerd kunnen worden volgens de methode beschreven protocol kwantificeren berekenden we de hoeveelheid MV's geïsoleerd uit bloedmonsters van 10 donoren. De MV opbrengst, die in een Lowry eiwit-bepaling werd bepaald, varieerde van 10 tot 30 ug met een gemiddelde van 19,2 ug MV's per ml bloed (tabel 1). De deeltjesconcentratie bepaald door het volgen nanodeeltje analyse (NTA) varieerde van 1,66 x 10 9-2,36 10 x 10 met een gemiddelde van 5,9 x 10 deeltjes per 9 ml plasmamonster (tabel 2). Verdere karakterisering van de MV's door transmissie- elektronenmicroscopie bleek een populatie van vesicles met een diameter van> 100 nm die zijn omgeven door een lipide dubbellaag en geen celorganellen (Figuur 1A) bevatten. NTA bevestigd dat de grootte van de geïsoleerde MV's varieerden van 100 tot 600 nm (figuur 1B) en de gemiddelde grootte was 201 MVnm (figuur 1C). Kleuring voor typische MV en Exo markers door Western blotting toonde aan dat de geïsoleerde MV positief voor tubuline en slechts een lichte expressie van CD81 en CD9, terwijl Exos waren negatief voor tubuline en verrijkt CD9 en CD81 (Figuur 2).
Analyse van de geïsoleerde MV met flowcytometrie (Figuur 3A) onthulde een gedefinieerde vesicle populatie die kan worden afgesloten met dezelfde parameters normaal voor MV's geïsoleerd uit celcultuur supernatanten en die duidelijk verschilde van het achtergrondsignaal wordt verkregen door de meting van PBS + 1% blaasjes ontdane FCS zonder toevoeging van MV (Figuur 3B). Om de verschillende MV populaties in het bloed te analyseren, werden gekleurd met MV vastgesteld merkers der bloedcelpopulaties, bijvoorbeeld CD62P voor plaatjes afgeleide MV, CD45 voor leukocyt afgeleide MV, CD235a voorrode bloedcel-afgeleide MV en CD62E voor endotheelcel afgeleide MV (Figuur 4). Deze karakterisatie bleek dat het percentage MV subpopulaties verschillen tussen de onderzochte donor bloedmonsters, terwijl de meerderheid van MV's leek te vergoten bloedplaatjes in alle monsters.
Figuur 1: Maat Verdeling van de MV's geïsoleerd uit perifeer bloed. A, Isolated MV's werden zichtbaar gemaakt door transmissie elektronenmicroscopie. B Representatieve nanodeeltjes tracking-analyse (NTA) van MV illustreert de grootteverdeling van de vesicles. C, De gemiddelde MV grootte van 10 onafhankelijke voorbereidingen werd gemeten met NTA (gemiddelde). Klik hier om al te bekijkenArger versie van deze figuur.
Figuur 2: Karakterisering van geïsoleerde MV's van Western Blotting. Differentiële eiwitexpressie op de geïsoleerde MV's en Exos uit twee donoren werd gevisualiseerd door Western Blotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van de MV's door middel van flowcytometrie. A, MV's worden eerst gevisualiseerd op vooruit (FSC) versus sidescatter (SSC) percelen tot poort op de respectievelijke MV bevolking. Vervolgens worden deze MV kenmerk voor het antigeen van belang door gebruik van fluorescent gelabelde antilichamen die zijn gericht tegen het antigeen. B, Typisch FSC versus SSC percelen voor de MV's geïsoleerd uit het plasma van twee donoren. Als vergelijking, een typische grafiek voor tumor-cellen afgeleide MV's van A549 longkankercellen geïsoleerd uit celcultuur supernatant en een negatieve controle met alleen PBS + 1% vesicle verarmd zonder FCS MV's worden rechts weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van geïsoleerde MV's door middel van flowcytometrie. MV's uit drie donoren werden gekarakteriseerd voor expressie van gevestigde markers bloedcellen (rood) door flowcytometrie. De respectievelijke isotype controles worden grijs weergegeven.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Monster | MV / ml bloed [ug] |
| # 1 | 29.4 |
| # 2 | 10.3 |
| # 3 | 15.2 |
| # 4 | 31.1 |
| # 5 | 18.8 |
| # 6 | 22.7 |
| # 7 | 19.1 |
| # 8 | 18.7 |
| # 9 | 15.0 |
| # 10 | 11.9 |
Tabel 1: MV Protein Opbrengst uit perifere bloedmonsters.
| Monster | MV / ml plasma [count deeltje] |
| # 1 | 6.42E + 09 |
| # 2 | 2.36E + 10 |
| # 3 | 1.88E + 09 |
| # 4 | 6.51E + 09 |
| # 5 | 3.48E + 09 |
| # 6 | 4.57E + 09 |
| # 7 | 2.09E + 09 |
| # 8 | 1.66E + 09 |
| # 9 | 2.54E + 09 |
| # 10 | 6.20E + 09 |
Tabel 2: MV Particle Opbrengst uit perifere bloedmonsters.
Discussion
Recente studies EV in bloed aangetoond dat EV samenstelling en tellingen veranderen tijdens de oorzaak van verschillende ziekten. Daarom is de analyse en verdere karakterisatie van deze EV's van groot belang voor hun potentieel gebruik als ziekte biomarkers voor diagnose en prognose verder te beoordelen of de therapie te evalueren reacties. Het protocol hier geïntroduceerde maakt de isolatie van vesicles met een diameter tot 600 nm die geen celorganellen bevatten. Deze waarnemingen zijn in lijn met de huidige definitie van MV's en uitsluiting van de aanwezigheid van apoptotische lichamen 2. Met behulp van Western blotting, waren we aantonen dat de geïsoleerde MV's tonen een hoge expressie van tubuline, terwijl de tetraspanins CD9 en CD81 die vaak als Exo merkers werden slechts licht uitgedrukt. Dit bevestigt dat de MV's verschillen van Exos en past de recente grondige karakterisering en vergelijking van beide EV bevolkingsgroepen door proteomics 25.
content "> Tijdens verkrijging van bloedmonsters, is het essentieel om de tijd tussen venapunctie en plasma preparaat zo kort mogelijk teneinde MV straling beschermd blijven. Bovendien kan langdurige opslag van bloedmonsters leiden tot de activering van bloedcellen veroorzaken verhoogde MV vergieten en uiteindelijk apoptose die resulteert in het vrijkomen van apoptotische lichamen. Een andere belangrijke overweging voor MV isolatie om verontreiniging van MV preparaten voorkomen met plasmaproteïnen of kleiner Exos. Daarom is het essentieel om zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk na stoppen met draaien verwijderen MVS bij 14.000 x g. Aangezien de pellet normaal toegankelijk en stevig aan de wand van de buis, de bovenstaande vloeistof worden gemakkelijk verwijderd met een pipet tip. In tegenstelling tot Exos die de neiging hebben om aggregaten te vormen bij de bereiding van hoge snelheid ultracentrifugatie en zijn vaak moeilijk te mengen, doet dit probleem zich niet voor bij MV's.Onze studie toont aan dat het mogeble naar MV subpopulaties aanwezig in het bloed door middel van flowcytometrie karakteriseren. Hoewel de detectiegrens van de meeste stromingscytometers ongeveer 200-300 nm, werden MV reproduceerbaar gemeten donor en celkweek monsters met dezelfde parameters van de analyse en poorten die duidelijk stonden hun onderscheid met achtergrondsignalen. Het is belangrijk om te controleren voor de metingen die de PBS voor de analyses geen contaminerende deeltjes die een hoge achtergrond tijdens flowcytometrie (Figuur 3) kan veroorzaken. Hoewel sommige kleinere MV's niet kunnen worden meegenomen in een flow cytometrische benadering gedetecteerd we MV's van alle belangrijke bloedcelpopulaties (bijvoorbeeld bloedplaatjes, rode bloedcellen, leukocyten, endotheelcellen). In onze analyses gebruikten we standaard merkers voor de verschillende bloedcellen die eerder zijn gevonden MV's 26-29. Opgemerkt wordt dat, om een optimaal resultaat te verkrijgen door middel van flowcytometrie, tHij hoeveelheid en concentratie van antilichaampjes worden getitreerd op MV monster expressie het antigeen van belang. Indien specifieke MV subpopulaties in het bloed moeten worden geïdentificeerd met een hogere specificiteit, is het mogelijk om dubbele kleuring uit te voeren tegen twee verschillende antigenen aanwezig zijn op de respectievelijke MV's en alleen rekening houden met alle dubbele positieve MV's voor de daaropvolgende analyses 23. Momenteel zijn er pogingen om een standaard reeks MV subpopulaties in bloed van gezonde individuen 23,30 definiëren. Deze studies hebben al aangetoond dat bloedplaatjes afkomstige MV's vormen de grootste bevolking van MV's in het bloed, die in overeenstemming met onze observaties.
Een voordeel van stromingscytometrie MV monsters kenmerkend is dat deze methode is wel bekend voor diagnostische doeleinden in de meeste klinische centra die de mogelijke toepassing van MV's als biomarkers bij dagelijkse klinische diagnostiek mogelijk maken. Eerdere studies op EV's in het bloed die meestal focused op kleinere Exos, beroepen op sorteerinstallatie procedures om selectief analyseren de gewenste Exo doelgroep 31,32 of vereisen een tijdrovende (2 dagen) isolatiewerkwijze met koppeling van Exos aan korrels vóór de analyse 18 Latex. Onze eigen ongepubliceerde waarnemingen suggereren dat de flowcytometrische analyse van de MV's uit volbloed voorbereidingen van de detectie van MV's zoals tumor afgeleide MV's zonder een dergelijke selectieprocessen zelfs mogelijk.
Bij elkaar genomen, het protocol hier gepresenteerde maakt de snelle isolatie van MV's uit perifere bloedmonsters met standaard lab-apparatuur en de daaropvolgende karakterisering met behulp van flowcytometrie en Western Blotting. Het hele proces kan worden uitgevoerd in ongeveer 2 uur die eventuele studies naar MV profielen in het bloed van patiënten die nodig zijn om het potentieel van MV de ziekte biomarkers beoordelen vergemakkelijkt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
| For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
| CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5 µl for staining |
| CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5 µl for staining |
| CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8 µg for staining |
| CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1 µg for staining |
| CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
| ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56 °C) |
| filter 0.22 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| 4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
| microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
| milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
| multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
| PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
| perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
| Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
| rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
| rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
| tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
| tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
| tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
| Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5,000 in 5%BSA in TBST |
| ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
| ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
| valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 | |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
- Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
- Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
- Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
- Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
- Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
- Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
- Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
- Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
- Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
- Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
- Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
- Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
- Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
- Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
- Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
- Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
- Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
- Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
- Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
- Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
