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Biology

परिधीय रक्त से अलगाव और Microvesicles की विशेषता

Published: January 6, 2017 doi: 10.3791/55057
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology/Medical Oncology, University Medical Center Göttingen

Abstract

बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) छोटे endosomal व्युत्पन्न exosomes (Exos, व्यास <100 एनएम) और बड़े प्लाज्मा झिल्ली व्युत्पन्न microvesicles (MVS, व्यास> 100 एनएम) सहित की रिहाई के लिए एक मौलिक सेलुलर प्रक्रिया है कि सभी जीवित कोशिकाओं में होता है। ये पुटिकाओं परिवहन प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड मूल के उनके सेल के लिए और इन विट्रो अध्ययन में विशिष्ट कहनेवाला संचार के मध्यस्थों के रूप में उनके महत्व पर प्रकाश डाला है। ईवीएस सफलतापूर्वक विभिन्न शरीर के तरल पदार्थ से पृथक किया गया है और विशेष रूप से रक्त में ईवीएस कैंसर या संक्रामक रोगों के लिए बायोमार्कर का वादा के रूप में पहचान की गई है। आदेश में रक्त में एमवी उप-जनसंख्या के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए, हम परिधीय रक्त के नमूनों से मानकीकृत अलगाव और MVS के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। MVS अंतर centrifugation द्वारा EDTA-anticoagulated प्लाज्मा नमूनों से pelleted कर रहे हैं और आम तौर पर 100 की एक व्यास के अधिकारी - 600 एनएम। उनके बड़े आकार के कारण, वे कर सकते हैंआसानी से फ्लो, एक तकनीक है कि नियमित रूप से नैदानिक ​​निदान में प्रयोग किया जाता है और सबसे प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। पृथक MVS की गुणवत्ता नियंत्रण assays के लिए कई उदाहरण दिया जाएगा और मार्करों है कि रक्त में विभिन्न एमवी उप-जनसंख्या के भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रस्तुत किया जाएगा।

Introduction

पिछले वर्षों में इन विट्रो अध्ययन में कई दिखा दिया है कि बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) कहनेवाला संचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जीवित कोशिकाओं लगातार पुटिकाओं जो आकार, सामग्री और जीवजनन में अलग बहाया। सबसे अच्छा अध्ययन ईवीएस exosomes जो endosomal प्रणाली से उत्पन्न जहां वे Multivesicular निकायों में intraluminal पुटिकाओं के रूप में जमा कर रहे हैं। एक बार प्लाज्मा झिल्ली के साथ बाद फ्यूज, निहित पुटिकाओं exosomes के रूप में जारी किया जाता है (Exos, व्यास 30 - 100 एनएम 1)। जो प्लाज्मा झिल्ली 2 से सीधे बंद कली - EV जो पिछले वर्षों में बढ़ती ध्यान प्राप्त की है के एक दूसरे आबादी बड़े microvesicles (1000 एनएम MVS, व्यास 100) हैं।

पुटिकाओं के दोनों प्रकार के एक लिपिड bilayer से घिरा हुआ है और न्यूक्लिक एसिड होते हैं, जैसे, डीएनए, mRNA या miRNA 3 - 5, और प्रोटीन है जो वे पड़ोसी ग के लिए हस्तांतरण कर सकते हैं की एक बहुतायतएल। जबकि सामान्य में पुटिकाओं की प्रोटीन संरचना मूल के सेल की स्थिति को दर्शाता है, कुछ प्रोटीन चुनिंदा लक्षित और ईवीएस 1 पर समृद्ध होने लगते हैं। एक प्रमुख अनुसंधान ब्याज आदेश विशिष्ट ईवी हस्ताक्षर जो उपन्यास बायोमार्कर के रूप में ईवीएस के उपयोग की अनुमति सकता है परिभाषित करने के लिए असामान्य और रोगग्रस्त कोशिकाओं से ईवीएस को चिह्नित करने के लिए है। विशेष रूप से कैंसर, जिसमें अक्सर ट्यूमर ही आसानी से सुलभ नहीं है, तरल रक्त में ट्यूमर विशिष्ट ईवीएस को निशाना बायोप्सी चिकित्सा प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति या आक्रामक प्रक्रियाओं 6 के लिए आवश्यकता के बिना प्राथमिक ट्यूमर निस्र्पक मदद कर सकता है।

दरअसल, ईवीएस पहले से ही सफलतापूर्वक मूत्र 7, 8 सीएसएफ, मां के दूध 9 या रक्त 10 सहित विभिन्न शरीर के तरल पदार्थ से पृथक किया गया है। कई अध्ययनों से अलग मानव रोगों में ईवी मायने में परिवर्तन और संरचना की पहचान की। उदाहरण के लिए, पूति रोगियों में समर्थक कौयगुलांट MVS की संख्या हैकाफी स्वस्थ व्यक्तियों 11 की तुलना में वृद्धि हुई है। इसके अलावा गंभीर सेरेब्रल मलेरिया से पीड़ित रोगियों में रक्त में कुल MVS में वृद्धि मनाया जा सकता है और प्लेटलेट व्युत्पन्न MVS की गिनती कोमा गहराई और थ्रोम्बोसाइटोपेनिया 12 के साथ सहसंबंधी। अन्य अध्ययनों, प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष या दिल की विफलता के साथ रोगियों में और बाद के मामले में endothelium व्युत्पन्न पुटिकाओं का ऊंचा संख्या रिपोर्ट इस हृदय की घटनाओं 13,14 के एक उच्च संभावना के साथ संबद्ध।

विशेष रूप से कैंसर, रक्त में ईवीएस वर्तमान में नैदानिक ​​और शकुन मूल्य के साथ उपन्यास बायोमार्कर के रूप में चर्चा कर रहे हैं। ऐसे MUC1, EGFR या FAK के रूप में ट्यूमर जुड़े प्रोटीन व्यक्त MVS के स्तर स्तन कैंसर के रोगियों के रक्त में 15,16 बुलंद होने लगते हैं। इसके अलावा Exos के लिए, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि रक्त प्राप्त इस तरह के Glypican -1 अग्नाशय के कैंसर या डेल -1 स्तन कैंसर के लिए जल्दी रोग डी की अनुमति देने के लिए के रूप में ट्यूमर विशिष्ट एंटीजन ले जाने Exosउच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ 17,18 tection। इसके अतिरिक्त, सीरम व्युत्पन्न ट्यूमर Exos डीएनए जो इस तरह के KRAS और P53 जो चिकित्सा भविष्यवाणी 19 के लिए उनके उपयोग का सुझाव के रूप में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हो सकता है। हाल के अग्रिमों एक विशिष्ट microfluidic चिप का उपयोग कर ग्लियोब्लास्टोमा रोगियों के रक्त में Exos की है कि विश्लेषण चिकित्सा 20 की निगरानी की अनुमति देता दिखाई है। साथ में ले ली, इन निष्कर्षों मतलब है कि पुटिकाओं के रोग विशिष्ट उप-जनसंख्या के विश्लेषण के निदान, रोग का निदान के साथ ही चिकित्सकीय विकल्प और सफलता के बारे में बहुमूल्य जानकारी देता है।

हालांकि, खून से अलगाव और Exos का विश्लेषण, समय लेने वाली है विशेष प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है और इसलिए अभी तक नियमित नैदानिक ​​निदान के लिए अनुकूल नहीं है। इसके विपरीत, MVS बहुत तेजी से अपने बड़े आकार के कारण आसानी से प्रवाह से विश्लेषण किया जा सकता cytometry लेटेक्स मोती करने के लिए उन्हें कुछ करने के लिए आवश्यकता के बिना अलग किया जा सकता है और, यह Exos 18 के लिए आवश्यक है के रूप में21। इस प्रकार, यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि रक्त के नमूनों से MVS के मानकीकृत अलगाव और प्रवाह cytometry द्वारा एमवी उप-जनसंख्या के बाद के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल आगे के अध्ययन और बड़े रोगी समूहों में एमवी प्रोफाइल जो आदेश रोजमर्रा के नैदानिक ​​निदान के लिए MVS का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा की गहराई में लक्षण वर्णन की अनुमति देगा।

Protocol

मानव विषयों सहित सभी प्रयोगों स्थानीय आचार समिति (अनुमोदन नहीं। 3/2/14) द्वारा अनुमोदित किया गया है। रोगियों के चुनाव के लिए यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह की उम्र, लिंग, वर्तमान चिकित्सा परहेजों और कई और अधिक रक्त में एमवी संरचना को प्रभावित करती है और इसलिए कर सकते हैं के रूप में कई कारकों संग्रह 22,23 नमूने के लिए विचार से पहले में रखा जाना चाहिए।

1. प्लाज्मा नमूनों की तैयारी

  1. EDTA (1.6 मिलीग्राम / एमएल रक्त) युक्त एक Vacutainer रक्त संग्रह ट्यूब में एक 21 गेज तितली सुई के माध्यम से दाता प्रति रक्त के 2 ट्यूबों - ड्रा 1। कुशल रक्त anticoagulation गारंटी करने के लिए ट्यूब (एस) कई बार पलटना लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: - 15 एमएल बाद फ्लो और वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण के लिए रक्त की सिफारिश की मात्रा 5 है। आदेश एमवी गिरावट और नुकसान को रोकने के लिए, रक्त के नमूने <30 मिनट के रक्त वापसी के बाद नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  2. 1200 XG पर 15 मिनट के लिए नमूने centrifuging द्वारा प्लाज्मा के नमूने तैयारकमरे के तापमान (आरटी)।
  3. आदेश में रक्त कोशिकाओं (= निचली परत) शेष से प्लाज्मा (= ऊपरी परत) की जुदाई में मदद करने के लिए एक वाल्व फिल्टर लागू करें।
  4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्लाज्मा स्थानांतरण।
  5. 1,500 XG पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, आरटी बड़ा सेल मलबे गोली और शेष प्लेटलेट्स निकालने के लिए।
  6. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और सीधे -20 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 6 महीने के लिए एमवी अलगाव या दुकान के नमूनों के साथ आगे बढ़ें।
    ध्यान दें: प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी सेल संस्कृति supernatants से MVS (और Exos) को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 24 के लिए 80% confluency - - आदेश में ऐसा करने के लिए, 60 में कोशिकाओं खेती संस्कृति के माध्यम में 48 ज के साथ पुटिका समाप्त एफसीएस पूरक है, और फिर सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। 750 XG पर 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र अवशिष्ट अस्थायी कोशिकाओं व्यय करना, तैरनेवाला एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में बड़ा सेल मलबे गोली 1,500 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फिर से भरें। इस सतह पर तैरनेवाला तो MVS के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता2.16 - 2.1 चरण में वर्णित है।

2. MVS का अलगाव

  1. एक उपयुक्त centrifugation ट्यूब में प्लाज्मा नमूना हस्तांतरण। यदि आवश्यक हो, को आदेश centrifugation प्रक्रिया के दौरान नमूना पतला और पतली दीवारों ट्यूबों के पतन को रोकने के लिए पीबीएस के साथ ट्यूब भरें।
  2. 14,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. छानना सतह पर तैरनेवाला, ट्यूब ऊपर से नीचे कर दिया और एक कागज तौलिया पर डाल रहते हैं। 5 मिनट तक सभी शेष सतह पर तैरनेवाला तौलिया में भिगो कर दिया गया है और इस तरह के नमूने से हटाया - 3 रुको।
  4. 1,000 μL पीबीएस में एमवी गोली Resuspend, एक tabletop अपकेंद्रित्र में 14,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण।
  5. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला।
  6. 50 में एमवी गोली Resuspend - 500 μL पीबीएस, गोली के आकार पर निर्भर करता है। वैकल्पिक रूप से, lyse MVS सीधे, जैसे, RIPA बफर में (150 मिमी NaCl / 0.1% एसडीएस / 0.5% ना deoxycholate / 1% ट्राइटन X-100/50 मिमी Tris, पीएच 7.2)बाद में वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण के लिए। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर MVS। वे कई महीनों के लिए स्थिर बने हुए हैं, लेकिन बार-बार फ्रीज पिघलना चक्र से बचना होगा।
  7. वैकल्पिक: आदेश एमवी पैदावार का आकलन या बाद के प्रयोगों के लिए MVS खुराक में एक प्रोटीन परख के साथ एमवी प्रोटीन एकाग्रता (जैसे, ब्रैडफोर्ड या लौरी विधि) निर्धारित करते हैं।
  8. अतिरिक्त Exos प्लाज्मा नमूनों से अलग किया जा करने के लिए कर रहे हैं, 110,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक ultracentrifugation ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 2.3 कदम से सतह पर तैरनेवाला छानना। 2.3 कदम के रूप में वर्णित सतह पर तैरनेवाला छानना, 1000 μL पीबीएस में Exo गोली resuspend और छोटे (1.5 एमएल) ultracentrifugation ट्यूबों में हस्तांतरण।
    1. 75 μL पीबीएस या RIPA बफर - 110,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस, 50 में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend Exo गोली में 2 घंटे के लिए ultracentrifuge।

3. से फ्लो द्वारा MVS की विशेषता

  1. स्थानांतरण 15 μL पीबीएस + 1% पुटिका समाप्त भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) एक प्रवाह cytometry ट्यूब में।
    नोट: पुटिका समाप्त एफसीएस गर्मी निष्क्रिय (30 मिनट 56 डिग्री सेल्सियस पर) 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से 110,000 XG पर 18 घंटे के लिए एफसीएस centrifuging और सतह पर तैरनेवाला filtrating के रूप में पहले 24 में वर्णित द्वारा तैयार की है।
  2. 5 माइक्रोग्राम प्रति पीबीएस में MVS के (कम पैदावार 3 माइक्रोग्राम भी लागू कर रहे हैं के मामले में) जोड़ें।
  3. एमवी सतह पर unspecific बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक करने के लिए और इस तरह की पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के क्रम में आरटी पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
  4. प्रोटीन के हित के खिलाफ एक fluorescently लेबल एंटीबॉडी जोड़ें। धुंधला क्रम में इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण और एक कम संकेत करने वाली शोर राशन की गारंटी के लिए उपयोग करने से पहले के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की राशि titrate। यकीन भी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बेदाग MVS के साथ एक ट्यूब और एक ही एकाग्रता में मिलान निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ दाग (जैसे, यदि एंटीबॉडी की 1 ग्राम के लिए किया जाता है, यह भी एक निर्धारण नियंत्रण के 1 ग्राम का उपयोग MVS की एक ट्यूब में शामिल करने के लिए सुनिश्चित करेंtibody) पृष्ठभूमि धुंधला यों की।
    नोट: यह भी अलग अलग fluorochromes करने के लिए मिलकर कई एंटीबॉडी जोड़कर cytometry बहुरंगा प्रवाह प्रदर्शन करने के लिए संभव है।
  5. अंधेरे में आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 250 μL पीबीएस जोड़ें और नमूना एक प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग करने का माप के साथ आगे बढ़ें।
    1. मामले में है कि नमूने तुरंत नहीं मापा जा सकता, 150 μL पीबीएस और 50 μL 4% paraformaldehyde (पीएफए) 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने और दुकान को ठीक करने के लिए जोड़ें। चेतावनी: पीएफए ​​विषैला होता है। दस्ताने और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का प्रयोग करें।
  7. संभव सबसे कम मूल्य के लिए प्रवाह की दहलीज को कम करने और एक आगे तितर बितर (एफएससी) बनाम ओर तितर बितर (एसएससी) लघुगणक पैमाने में भूखंड का उपयोग कर एमवी आबादी के लिए खोज करते हैं। गेट एमवी आबादी पर और एक इसी हिस्टोग्राम में फ्लोरोसेंट संकेत का मूल्यांकन।

पश्चिमी सोख्ता द्वारा MVS की विशेषता 4.

  1. एमवी गोली सीधे Resuspend मेंएक उपयुक्त lysis बफर (जैसे, RIPA बफर)।
    1. एक उपयुक्त lysis बफर (जैसे, RIPA बफर) में 1: मामले में एमवी गोली पहले से ही पीबीएस में resuspended गया है, यह कम से कम 1 पतला।
  2. एमवी नमूने के प्रोटीन एकाग्रता, जैसे, लौरी परख द्वारा निर्धारित करते हैं।
  3. 22.5 μL RIPA बफर में MVS के 20 माइक्रोग्राम - 10 तैयार करें। फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7.5 μL 4x Laemmli लोडिंग बफर और गर्मी जोड़ें।
  4. एक polyacrylamide जेल पर लोड नमूने और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार वैद्युतकणसंचलन और immunoblotting प्रदर्शन करते हैं।
  5. झिल्ली पर प्रोटीन स्थानांतरित करने के बाद, मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक रक्तवर्ण रंग धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए TBST में Destain झिल्ली।
  7. TBST में 5% BSA में 30 मिनट के लिए 1 घंटे के लिए आरटी पर के लिए ब्लॉक झिल्ली।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते रातोंरात या आरटी पर 2 घंटे के लिए।
  9. TBST 3 एक्स 5 मिनट के साथ झिल्ली धो लें।
  10. 1 के एक कमजोर पड़ने पर एचआरपी-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते:% 5 में 10,000 बीएसए। नोट: उच्च पृष्ठभूमि संकेतों के मामले में, दूध बीएसए के बजाय पाउडर का उपयोग करें।
  11. TBST 3x 5 मिनट के साथ झिल्ली धो लें।
  12. एक ईसीएल पता लगाने अभिकर्मक के साथ झिल्ली का विकास करना और chemiluminescence फिल्मों या एक chemiluminescence इमेजिंग सिस्टम पर संकेतों का पता लगाने।
    नोट: आदेश Exos से MVS भेदभाव करने में, ट्यूबिलिन की तरह प्रोटीन, actinin -4 या mitofilin इस्तेमाल किया जा सकता है, जो मुख्य रूप से MVS 16,25 पर मौजूद होना चाहिए। ध्यान है कि सबसे tetraspanin एंटीबॉडी (जैसे, CD9, CD81), Exos के लिए मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है, को कम करने की शर्तों के तहत काम नहीं करते और इसलिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गैर को कम करने लोडिंग बफर 10 मिनट के लिए हीटिंग के द्वारा पीछा में तैयार किया जाना चाहिए भुगतान करते हैं।

Representative Results

आदेश MVS कि वर्णित प्रोटोकॉल के बाद अलग किया जा सकता की उपज यों के लिए, हम 10 दाताओं के रक्त के नमूने से अलग MVS की राशि की गणना की। एमवी उपज है, जो एक प्रोटीन परख में मूल्यांकन किया गया था, एमएल रक्त प्रति 19.2 माइक्रोग्राम MVS (तालिका 1) का एक मतलब के साथ 30 माइक्रोग्राम प्रति अप करने के लिए 10 से लेकर। कण एकाग्रता nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) द्वारा निर्धारित 1.66 x 10 9 से 2.36 x 10 10 प्रति एमएल प्लाज्मा नमूना 5.9 एक्स 10 9 कणों (तालिका 2) का एक मतलब के साथ तक बताया गया। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा MVS के आगे लक्षण वर्णन एक व्यास> 100 एनएम के साथ पुटिकाओं कि एक लिपिड bilayer से घिरे थे और किसी भी सेल अंगों (चित्रा 1 ए) को शामिल नहीं किया था की आबादी का पता चला। NTA पुष्टि की है कि पृथक MVS का आकार 600 एनएम (चित्रा 1 बी) और मतलब एमवी आकार अप करने के लिए 100 से लेकर 201 थाएनएम (चित्रा 1 सी)। पश्चिमी सोख्ता द्वारा ठेठ एमवी और Exo मार्करों के लिए धुंधला प्रदर्शन किया है कि पृथक MVS ट्यूबिलिन के लिए सकारात्मक थे और केवल, CD9 और CD81 की एक छोटी सी अभिव्यक्ति से पता चला है, जबकि Exos ट्यूबिलिन के लिए नकारात्मक रहे थे और CD9 और CD81 (चित्रा 2) में समृद्ध है।

से फ्लो (चित्रा 3 ए) द्वारा पृथक MVS के विश्लेषण से एक परिभाषित पुटिका आबादी है कि एक ही मापदंड सामान्य रूप से सेल संस्कृति supernatants से अलग MVS के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का उपयोग कर gated का पता चला और कहा कि पीबीएस के माप से प्राप्त की पृष्ठभूमि संकेत से स्पष्ट रूप से अलग था + 1% पुटिकाओं समाप्त MVS (चित्रा 3 बी) के अलावा बिना एफसीएस। आदेश में अलग एमवी आबादी रक्त में मौजूद का विश्लेषण करने के लिए, MVS, विभिन्न रक्त कोशिका आबादी के लिए स्थापित मार्कर के साथ दाग थे जैसे, प्लेटलेट व्युत्पन्न MVS के लिए, ल्युकोसैट व्युत्पन्न MVS के लिए, के लिए CD62P CD45 CD235aलाल रक्त कोशिका व्युत्पन्न MVS और CD62E endothelial सेल व्युत्पन्न MVS (चित्रा 4) के लिए। उनकी यह खासियत पता चला कि एमवी उप-जनसंख्या के प्रतिशत की जांच की दाता रक्त के नमूनों के बीच मतभेद है, जबकि MVS के बहुमत लग रहा था सभी नमूनों में प्लेटलेट्स द्वारा बहाया जा सके।

आकृति 1
चित्रा 1: परिधीय रक्त से अलग MVS के आकार के वितरण। ए, पृथक MVS संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना थे। बी, पुटिकाओं के आकार के वितरण को दर्शाता हुआ MVS के प्रतिनिधि nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)। सी, 10 स्वतंत्र तैयारी से मतलब एमवी आकार NTA (मतलब) द्वारा मापा गया था। अल देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की arger संस्करण।

चित्र 2
चित्रा 2: पश्चिमी सोख्ता द्वारा पृथक MVS की विशेषता। पृथक MVS और दो दाताओं से Exos पर अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी सोख्ता द्वारा कल्पना की गई थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: से फ्लो द्वारा MVS का विश्लेषण। ए, MVS पहले संबंधित एमवी आबादी पर फाटक के आगे (एफएससी) बनाम sidescatter (एसएससी) भूखंडों पर कल्पना कर रहे हैं। बाद में, इन MVS द्वारा ब्याज की प्रतिजन के लिए विशेषता है प्रतिजन के खिलाफ निर्देशित fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग। बी, दो दाताओं के प्लाज्मा से अलग MVS के लिए एसएससी भूखंडों बनाम ठेठ एफएससी। तुलना के रूप में, केवल पीबीएस + 1% पुटिका समाप्त एफसीएस MVS बिना उपयोग कर A549 फेफड़ों के कैंसर के सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के साथ ही एक नकारात्मक नियंत्रण से अलग कक्षों से ट्यूमर सेल व्युत्पन्न MVS के लिए एक विशिष्ट साजिश सही पर दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: से फ्लो द्वारा पृथक MVS की विशेषता। तीन दाताओं से MVS स्थापित रक्त कोशिका मार्कर (लाल) से फ्लो द्वारा की अभिव्यक्ति के लिए विशेषता थे। संबंधित निर्धारण नियंत्रण ग्रे में दिखाया जाता है।http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूना MVS / एमएल रक्त [माइक्रोग्राम]
# 1 29.4
# 2 10.3
# 3 15.2
# 4 31.1
# 5 18.8
# 6 22.7
# 7 19.1
# 8 18.7
# 9 15.0
# 10 11.9

तालिका 1: परिधीय रक्त के नमूनों से एमवी प्रोटीन उपज।

नमूना MVS / एमएल प्लाज्मा [कण गिनती]
# 1 6.42E + 09
# 2 2.36E + 10
# 3 1.88E + 09
# 4 6.51E + 09
# 5 3.48E + 09
# 6 4.57E + 09
# 7 2.09E + 09
# 8 1.66E + 09
# 9 2.54E + 09
# 10 6.20E + 09

तालिका 2: परिधीय रक्त के नमूनों से एमवी कण उपज।

Discussion

रक्त में ईवीएस पर हाल के अध्ययनों से दिखा दिया है कि ईवी संरचना और मायने रखता है कई बीमारियों का कारण दौरान बदल जाते हैं। इसलिए, विश्लेषण और इन ईवीएस के आगे लक्षण वर्णन आगे निदान और रोग का निदान के लिए रोग बायोमार्कर के रूप में अपनी क्षमता का उपयोग आकलन करने के लिए या चिकित्सा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए उच्च ब्याज की हैं। प्रोटोकॉल हम यहाँ पेश अप करने के लिए 600 एनएम जो किसी भी सेल organelles शामिल नहीं है की एक व्यास के साथ पुटिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। इन टिप्पणियों MVS की वर्तमान परिभाषा के साथ लाइन में हैं और apoptotic निकायों 2 की उपस्थिति को बाहर। पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करना, हम दिखाना है कि पृथक MVS ट्यूबिलिन के एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाने में सक्षम थे, जबकि tetraspanins CD9 और CD81 है कि अक्सर Exo मार्कर के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं केवल थोड़ा व्यक्त किया गया। इस बात की पुष्टि करता है कि MVS Exos से अलग और प्रोटिओमिक्स 25 द्वारा हाल ही में गहराई लक्षण और दोनों ईवी आबादी की तुलना करने के लिए फिट बैठता है।

सामग्री "> रक्त के नमूनों के अधिग्रहण के दौरान यह आदेश एमवी गिरावट को रोकने के लिए venipuncture और प्लाज्मा तैयारी के बीच के समय को रखने के लिए के रूप में कम संभव के रूप में महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, रक्त के नमूनों की लंबे समय तक भंडारण बढ़ाया एमवी के कारण रक्त कोशिकाओं की सक्रियता को ले जा सकता है apoptosis जो apoptotic निकायों की रिहाई में परिणाम बहा और अंततः। एमवी अलगाव के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण विचार। प्लाज्मा प्रोटीन या छोटे Exos साथ एमवी तैयारी के संदूषण को रोकने के लिए है, इसलिए, यह नीचे कताई के बाद संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है पर 14,000 एक्स जी MVS। चूंकि गोली सामान्य रूप से दिखाई दे रहा है और कसकर ट्यूब की दीवार से जुड़ी है, सतह पर तैरनेवाला आसानी से एक विंदुक टिप के साथ हटाया जा सकता है। Exos के विपरीत है जो उच्च गति ultracentrifugation और तैयारी के दौरान समुच्चय के रूप में लिए जाते हैं अक्सर resuspend करने के लिए मेहनत कर रहे हैं, इस समस्या MVS के साथ नहीं होती है।

हमारे अध्ययन से पता चलता है कि यह possi हैएमवी उप-जनसंख्या से फ्लो द्वारा रक्त में मौजूद चिह्नित करने के लिए ble। हालांकि सबसे प्रवाह cytometers का पता लगाने सीमा के आसपास 200 - 300 एनएम, MVS reproducibly दाता के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण का एक ही मापदंड और फाटकों कि स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि संकेतों से उनकी भेद अनुमति के साथ सेल संस्कृति के नमूनों में मापा गया। यह माप है कि पीबीएस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किसी भी दूषित कणों कि प्रवाह cytometry (चित्रा 3) के दौरान एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण बन सकता शामिल नहीं करता है से पहले सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुछ छोटे MVS एक प्रवाह cytometric दृष्टिकोण में कब्जा नहीं किया जा सकता है, हम सभी प्रमुख रक्त कोशिका आबादी (जैसे, प्लेटलेट्स, लाल रक्त कोशिकाओं, ल्यूकोसाइट्स, endothelial कोशिकाओं) से MVS का पता चला। 29 - हमारे विश्लेषण में हम अलग रक्त कोशिकाओं है कि पहले MVS 26 पर पाया गया के लिए मानक मार्कर का इस्तेमाल किया। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आदेश प्रवाह cytometry द्वारा सर्वोत्तम संभव परिणाम प्राप्त करने के लिए, टी मेंवह राशि और सभी एंटीबॉडी की एकाग्रता एक एमवी नमूना ब्याज की प्रतिजन व्यक्त पर titrated किया जाना चाहिए। रक्त में विशिष्ट एमवी उप-जनसंख्या उच्च विशिष्टता के साथ की पहचान की जाएगी, तो यह संबंधित MVS पर दो अलग अलग एंटीजन वर्तमान के खिलाफ डबल धुंधला प्रदर्शन करने के लिए और केवल सभी डबल सकारात्मक MVS पर विचार बाद के विश्लेषण के लिए 23 संभव है। वर्तमान में, वहाँ स्वस्थ व्यक्तियों 23,30 के रक्त में एमवी उप-जनसंख्या का एक मानक सीमा को परिभाषित करने के लिए प्रयास कर रहे हैं। इन अध्ययनों से पता चला है कि पहले से ही प्लेटलेट व्युत्पन्न MVS खून जो हमारी टिप्पणियों के साथ पत्राचार में है में MVS की सबसे बड़ी आबादी का गठन।

प्रवाह cytometry एमवी नमूनों को चिह्नित करने का एक फायदा यह है कि इस विधि को पहले से ही अच्छी तरह से सबसे नैदानिक ​​केन्द्रों में नैदानिक ​​प्रयोजनों जो रोजमर्रा नैदानिक ​​निदान में बायोमार्कर के रूप में MVS के संभावित उपयोग की अनुमति होगी के लिए स्थापित किया गया है। रक्त में ईवीएस पर पिछले अध्ययनों जो ज्यादातर ध्यान केंद्रित किया हैएड छोटे Exos पर, या तो विशिष्ट छँटाई प्रक्रियाओं पर भरोसा चुनिंदा वांछित Exo लक्ष्य आबादी 31,32 का विश्लेषण करने के लिए या एक समय लेने वाली (2 दिन) अलगाव Exos के युग्मन के साथ इस प्रक्रिया की आवश्यकता विश्लेषण 18 से पहले मोती लेटेक्स करने के लिए। हमारी अपनी अप्रकाशित टिप्पणियों का सुझाव है कि पूरे रक्त की तैयारियों से MVS के प्रवाह cytometric विश्लेषण भी इस तरह के किसी भी तरह के चयन प्रक्रिया के बिना ट्यूमर व्युत्पन्न MVS के रूप में MVS का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

साथ में ले ली, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ परिधीय रक्त के नमूनों से MVS के तेजी से अलगाव की अनुमति देता है और उनके बाद लक्षण वर्णन प्रवाह cytometry और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर। पूरी प्रक्रिया में लगभग 2 घंटे, जो मरीजों के खून में एमवी प्रोफाइल है कि रोग बायोमार्कर के रूप में MVS की क्षमता का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
butterfly needle (21 gauge) Hospira Deutschland GmbH 490P29201
Bovine serum albumin Fraction V Roth 8076.3 For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PE Beckman Coulter A07792 use 5 µl for staining
CD45-FITC Beckman Coulter 7782 use 5 µl for staining
CD62E-PE Biolegend 336008 use 0.8 µg for staining
CD62P-PE Biolegend 304905 use 0.1 µg for staining
CD81 antibody Biolegend 349501 1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibody Immunotools 21270091 1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit II Bio-Rad 5000112
ECL detection reagent GE Healthcare RPN2232
EDTA vacutainers for blood collection Sarstedt 01.1605.001
FACSCanto II BD Biosciences
fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated (30 min, 56 °C)
filter 0.22 µm Sarstedt 83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody santa cruz sc-2005 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody santa cruz sc-2004 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 Roth K929.1
microfuge SIGMA 1-15K Sigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) BioRad 170-6404
multifuge 3 L-R Heraeus
NanoSight LM10 NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500
perfusor syringe 50 mL Braun 8728844F
Ponceau-S staining solution PanReac AppliChem A2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL) Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL) Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) BD Biosciences 352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL) Beckman Coulter 344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) Beckman Coulter 343778
Tubulin antibody Millipore 05-829 1:5,000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter
ultracentrifuge TL-100 Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15 Sarstedt 53,428

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References

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परिधीय रक्त से अलगाव और Microvesicles की विशेषता
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Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (119), e55057, doi:10.3791/55057 (2017).

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