Summary
連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。
Abstract
この方法では、連続した凍結切片は、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いて、遺伝子発現のための組織の組織学とRNAの濃縮のための両方の顕微鏡アプリケーションを可能にするために収集されます。典型的には、それがバッファボリュームは、効率的な研削用途には低すぎるかもしれないので、まだ十分な機械的破壊することなく、小さな骨格筋サンプルの適切な均質化を達成するために挑戦され、緩衝剤の筋限界浸透の密集組織構造は、最終的に低いRNA収量を引き起こします。ここで報告されたプロトコルに従うことにより、30μmのセクションでは、収集され、バッファへの浸透のために露出表面積を増加させ、凍結切片およびその後の針均質化が筋肉を混乱させる機械的にできるようにプールしました。技術の主要な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットです。しかし、高品質のRNAをプールし、Mの小さなサンプルから得られますuscle凍結切片は、多くの異なる骨格筋および他の組織のために、この方法は、アクセス可能にします。測定は直接実験的不確実性を低減し、のための小さな組織を供給するのに必要な複製の動物実験を低減するためにアプリケーション間で比較することができるように、また、この技術は、単一の骨格筋の隣接領域からの一致分析（ 例えば、組織の組織病理学および遺伝子発現）を可能にします複数のアプリケーション。
Introduction
この技術の目的は、単一の小さな骨格筋ソース組織からアクセスでき、そのような組織学および遺伝子発現など異なるモダリティ、ことで、複数の実験的な分析を行うことです。顕微鏡アプリケーションを注意深く凍結保存中に氷晶アーチファクトの形成を制限するように制御されなければならないサンプルの保存方法に最も敏感です。したがって、この方法の開発は、部分的に免疫蛍光顕微鏡法および遺伝子発現の両方のための原料物質分析として-140℃の液体窒素冷却2-メチルブタン浴中で樹脂を埋め込んで被覆された凍結前脛骨（TA）筋に基づいています。
多様な技術的アプローチのために同一の原料物質を使用する必要性は、左右の筋肉が異なる条件、実験の1つずつの制御を表す筋肉内注射に基づく実験のために特に重要です。例えば、筋肉再生の研究で一μSCLEは反対側の筋肉がビヒクル注射対照1として機能する広範な組織の損傷を引き起こす毒素を注射します。同様に、筋疾患の遺伝子治療研究は、典型的には、反対側2の空ベクター、無関係ベクターまたはビヒクル対照と比較する筋肉内注射による遺伝子治療ベクターの検証で始まります。したがって、別のアプリケーションに各TA筋を供給することは不可能です。
この問題に対処するための一般的な戦略は次のとおりです。私は）ii）の追加のマウスを使用すること、またはiii）は、各アプリケーションのための筋肉の一部を遮断するために、アプリケーションごとに異なる筋肉群を使用します。しかし、筋群の間に実質的な差異は、それが困難な別個のアプリケーションからのデータを比較することを可能にする、追加の動物は費用を増加させ、他の選択肢が存在する場合、不十分正当化されます。異なるアプリケーションを調達するために解剖した後に筋肉を割ると、最良の選択肢の私ですnは多くの場合。しかし、筋肉片は、しばしば均質2-5のために液体窒素または機械的な粉砕技術の下で粉砕を使用するには小さすぎます。筋肉は、細胞外マトリックス及び収縮タンパク質を充填した高度に構造組織であるため、不十分な機械的な均質化は、その後のDNA、RNAまたはタンパク質の低い収率をもたらします。ここでの詳細な方法は、複数のアプリケーションで使用するための1つのソース筋からの組織の少量を可能にし、凍結切片と針粉砕を含めることは、より良好なRNAの収量のための機械的均質化を向上させます。
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Protocol
すべての動物の手順は、動物使用プロトコルA2013 07から016（Beedleといったロック）の下でジョージア制度動物実験委員会の大学によって承認されました。
未固定の骨格筋の1凍結保存
- 準備
- 約（ソースマウスや筋肉を特定し、非常に浅いカットを作るために2メチルブタンに耐性のある先端の細いマーカーでコルクに書き込み、かみそりの刃で小さな四角形（X 1センチメートル約1cm）にコルクをカット上面全体の1ミリメートル）。組織を配向するために使用するカットにプラスチック製のカバースリップを挿入します。コルクを凍結保存するすべての組織のための準備ができるまで繰り返します。
- 液体窒素、2-メチルブタン、包埋樹脂、低温温度計、コルク、解剖ツール、および研究のマウスを入手します。
注意：液体窒素を加熱した場合に爆発する可能性が圧縮ガスです。 niの液体取り扱いの際白衣、低温手袋、保護面を着用トローゲン;皮膚や目に接触はやけどや凍傷を起こすことがあります。 2-メチルブタンは可燃性、毒性、健康と環境の危険です。個人用保護具（白衣、手袋、安全メガネ）を着用し、ドラフト内で在庫コンテナを開き、しっかりと閉じることができ、別の容器に（典型的には200〜400ミリリットル）を凍結するために必要な少量を転送、および吸入を避けます。 - 麻酔下で安楽死の承認方法でマウスを安楽死させます。簡単に言えば、マウス後20秒ペダル反射をチェックするために移動を停止するまで待って、イソフルラン気化器からの酸素中の2.5％イソフルラン吸入室にマウスを挿入します。ペダル反射が負の場合、頸椎脱臼6によって研究マウスを安楽死させます。
注：安楽死の方法は、機関の倫理委員会による承認を必要とします。 - 遠位後肢を覆う皮膚を削除し、うまくポイントdisseと足首の上に遠位前方の腱を切っctionはさみ。細かい鉗子で遠位腱をつかみ、ゆっくりと筋肉を解放するために横方向の筋膜を切断しながらアップし、膝に向かって引っ張ります。膝から垂直筋を引き出し、TA筋7を切除する最終的なカットをします。
注：TA筋は、ここでは例として使用されますが、ユーザの実験的な目標に適切であれば、任意のマウス骨格筋や心臓がこのプロトコルでTAの代わりに用いることができます。唯一の制限は、組織は、その深さ全体に急速凍結保存を達成するのに十分に小さくなければならないということです。 1センチメートル×1 cmで最大の組織サイズが推奨されます。 - 反対側の脚に繰り返し、収集すべき他の組織を解剖します。凍結保存の前に組織の劣化を制限するために可能な限り迅速に解剖を行います。
- オリエントその前標識されたコルクでの横断切片のための各筋肉。コルクに触れ遠位腱と筋肉の内線のトップとコルクに垂直な筋肉スタンド離れて終わる、カバーガラスによって直立開催。
- 好ましくは5分以内に、解剖後できるだけ早く組織学的分析のために全ての組織を凍結保存間違いなくソース動物の安楽死以来経過していない15分以上の時間。
- 低温保存
- 解剖の終了前に凍結保存槽に5分間の冷却を開始します。約3cmの深さに開いた金属ビーカーに2-メチルブタンを注ぎます。 2〜4センチの深さまで断熱容器に液体窒素を注ぎます。液体窒素中に2-メチルブタンのビーカーを設定します。窒素が沸騰し始めます。 2-メチルブタンビーカーにはね窒素を避けてください。
注意：ヒュームフードまたは換気の良い場所でバスを凍結する準備します。 - 温度を監視し、さらに冷却を確実にするためにフォークで頻繁に攪拌して2-メチルブタンに低温温度計を挿入します。 2-MEまで撹拌を続け、クールthylbutaneは、必要に応じて、外槽に新たな液体窒素を添加すること、-140℃に達します。
注：-140°Cは横紋筋で氷の結晶のアーティファクトを最小限に抑えるために最適な温度です。他の組織は、異なる温度で最高の凍結保存することができる（ 例えば、脳、-90°C）。 - それはコルクを満たしているとすぐに-140℃で2-メチルブタンにコルクをドロップし、筋肉の50％ - のみ下35への埋め込み樹脂を適用します。急速凍結バッチ当たり最大8の組織のために繰り返します。組織が固化2-メチルブタンに凍結しないことを確実にするためにビーカーの底を掻き取り、30秒間攪拌します。
- フォークを使用して、2-メチルブタンから各組織のコルクを引っ張ってスプーンや大規模な鉗子をスロット。迅速に、カバースリップを削除ビーカーに過剰の2-メチルブタンをオフに軽くたたく、その後、外窒素浴に組織コルクをドロップします。ビーカー内の残りのすべてのコルク栓のために繰り返します。
- 液体窒素中またはドライアイス上で転送サンプルストレージのための-80℃の冷凍庫。
- 任意の組織が凍結保存のために残っている場合、繰り返しは、1.2.4に1.2.3を繰り返します。 -140°Cまで、必要に応じて再クール外槽へのビーカーや液体窒素に追加の2-メチルブタンを追加します。有害廃棄物として使用される2-メチルブタン廃棄してください。
- 解剖の終了前に凍結保存槽に5分間の冷却を開始します。約3cmの深さに開いた金属ビーカーに2-メチルブタンを注ぎます。 2〜4センチの深さまで断熱容器に液体窒素を注ぎます。液体窒素中に2-メチルブタンのビーカーを設定します。窒素が沸騰し始めます。 2-メチルブタンビーカーにはね窒素を避けてください。
2.組織学およびRNAアプリケーションのための凍結切片を収集
- 準備。
- 化学天秤でのDNase / RNaseフリーオートクレーブ処理チューブを事前に重量を量ります。その後、予冷するクライオスタット室に移動します。チューブは、収集するすべてのプールされた凍結切片試料の準備ができるまで繰り返します。
- 骨格筋切片の場合は、クライオスタットチャンバの温度は、その内部サーモスタットにより-21〜-22°Cがあることを確認します。チャンバー内に切断される組織との任意の容器を移し、容器（複数可）が開く前に少なくとも15分間、クライオスタットの温度に平衡化することができます。
- 新しい使い捨てクライオスタットブレードを挿入します。代わりに、のddH 2 Oですすぎ、RNaseを除染液でスプレー、既存のブレードを取り外し、冷却するクライオスタット内に再挿入します。 70％エタノールでクリーンな組織をスプレーし、慎重にブレードとブレードクランププラットフォームを拭いてください。
- RNアーゼ除染溶液でクリーンな組織をスプレーし、クライオスタットブラシで汚れを拭き取ってください。 ddH 2 Oで組織をスプレーし、再びブラシを拭いてきれいな表面にクライオスタット室でそれらを設定します。
注意：使用されていないクライオスタットブレードはナイフガードでカバーされるべきです。また、RNアーゼ除染液は毒性があり、冷たいクライオスタットチャンバ内の沈殿物を形成するために凍結します。そのため、取り扱いに注意しクライオスタット室での使用を避けます。
- RNアーゼ除染溶液でクリーンな組織をスプレーし、クライオスタットブラシで汚れを拭き取ってください。 ddH 2 Oで組織をスプレーし、再びブラシを拭いてきれいな表面にクライオスタット室でそれらを設定します。
- クライオスタットチャンバ内には、ダイムサイズのドロップ温かい試料チャック上に樹脂を埋め込む（約300μl）を配置し、ダウン樹脂の上部、プレスで組織コルクを設定し、FRにチャックを設定レールまたは利用可能な場合、高速凍結要素上をeezing。
- 包埋樹脂が固化（白）した後、組織の下位35％の周りに、コルクの上に追加の埋め込み樹脂を追加し、より良い組織を安定化させるために、高速凍結のために包埋樹脂に熱抽出を押してください。樹脂が完全に硬化することを可能にするために、切片の前に5分間待ってください。
- 試料クランプは、その最も後退した位置、ブレードから最も離れていることを確認してください。試料クランプに組織標本チャックを挿入します。
- 凍結切片の準備。
- 、ブレードキャリアホルダーを緩め10°（または使用される刃のキャリアのための適切な角度）に刃の逃げ角を設定して、再度締めます。ブレーキを解除し、ブレードに向けて筋肉を下げるためにハンドホイールを回します。組織と刃の間の最短距離を推定し、その後離れて刃から組織を移動し、ハンドホイールブレーキを従事。
- 高さ調整LEVEを緩め組織の端が刃からより約2 mm以下である場合にrは、それぞれ、前後に刃キャリアを移動し、またはブレードは、組織を打つ場合。締め、ブレードから距離を確認するために、再度組織を下げます。ブレードは視覚推定による組織の末端から1〜2mm程度になるまで調整を繰り返します。
- ブレードに向けて組織を下げて、横断面のための組織の角度を評価します。ハンドホイールをロックし、試料クランプレバーを放します。試料クランプは、左または右組織の水平方向がブレードに対して垂直になるまで押し込みます。
- 試料がクランプアップまたはダウン組織切片は、筋肉の長軸に対して垂直になるように「y」の向きを調整するためにプッシュします。試料クランプレバーを締めます。
- それだけで、ブレードに接触するまで試料を進めるためにコースや細かいフィードフォワードを使用してください。特定の組織の深さからセクションを求める場合は、（ゼロにセクションの厚さの合計をリセット組織のトップ）。
- 30ミクロンで切片厚とトリミング機能にクライオスタットを設定します。カットし、組織収集のための事前に選択された深さに到達するまでのセクションを破棄し（ 例えば、上から400ミクロン）。
- RNA抽出のための凍結切片を収集します。
- セクションを収集するためのチューブを開き、ブレードキャリアの近くに配置します。それはブレードから切断されているように各セクションをピックアップし、チューブに凍結切片を転送するために事前に冷却し、クリーンブラシを使用してください。プールされたセクションでは、30 mgの重量を量るか、所望の組織の深さに到達するまで繰り返します。
注： - 40mgの成体マウスの前脛骨筋の場合は、約400〜4,000ミクロンの組織の深さからのコレクションは、典型的には25が得られます。セクションが付着して金属表面に凝集する傾向があるとして、収集チューブにセクションを転送するために金属鉗子を使用することは推奨されません。 - 樹脂を埋め込みは筋肉の凍結切片を囲む場合は、ハンドブレーキをロックしにカミソリの刃を使用します筋肉の上部の周りに薄い層のみが存在するまで、樹脂の小片を剃り落とします。常に筋肉から離れて角度を付け刃で樹脂をカット。
注：樹脂を埋め込むの薄層は、実質的に下流のRNA調製物を損ないません。厚い包埋樹脂が存在する場合は、収集管に凍結切片を移動する前に離れて筋肉からそれをいじめるためにブラシを使用しています。 - また、コレクションチューブにバルク中の刃キャリアと移転に関するセクションをプールします。
注：ただし、この方法は遅くなる傾向があり、セクションは、後の工程で針均質化の効率を低下させることができ、付着して一緒に凝集しやすくなります。 - 迅速分析天びんやレコード管重量にプールし凍結切片チューブを配置します。直ちに-20℃に近い部分の温度を維持するために、コールドクライオスタット室にチューブを返します。プールされたセクションの重量を計算します。
注：RNAの単離が広告を発生しますifferent日、使用するまで-80℃でプールされた凍結切片チューブを格納します。
- セクションを収集するためのチューブを開き、ブレードキャリアの近くに配置します。それはブレードから切断されているように各セクションをピックアップし、チューブに凍結切片を転送するために事前に冷却し、クリーンブラシを使用してください。プールされたセクションでは、30 mgの重量を量るか、所望の組織の深さに到達するまで繰り返します。
- 組織学のための凍結切片を収集します。
- 細かい切片化し、使用の矢印は7ミクロン（または他の適切なセクションの厚さ、典型的には6〜10μm程度）にクライオスタット切片厚を設定するための切片厚ボタンを押してください。
注：薄肉部（6〜10μm）をその染色試薬は、組織切片の深さに浸透できることを確認するために、組織学的用途のために使用されるべきです。薄切片は、凍結切片中の任意の深さから採取することができるが、組織の深さとともに増加包埋樹脂は、組織学的染色を損なわないため、より深いセクションが好ましいです。 - 一貫性のある、でも、組織表面を得るために、4〜7のセクションをカットし、捨てます。組織の深さをメモします。
- セクションをカットし、ブレードキャリアの表面上に向けます。迅速かつ優しく温かい（室温）顕微鏡スライドに触れることによって、セクションをピックアップ刃キャリア上のセクションに。室温にスライドを返します。目的のスライドの数が得られるまで続けます。最終的な組織の深さをメモします。
注：各組織のための第二（重複）のセクションを収集することをお勧めします。 - 完全な切片では、ハンドホイールブレーキを従事一番奥の位置に検体を返し、組織チャックを削除します。試料チャック上の組織コルクを保持埋め込む樹脂を溶融するためにクライオスタット熱要素を使用します。 、組織コルクを削除する組織と乾燥、およびストレージに戻ります。
- 残りの各組織のためのステップ2.1.2から繰り返します。最後の組織がマウントされた後、スライドを20分間乾燥することができます。その後、組織学的または免疫蛍光染色のためのスライドを使用するか、または必要になるまでスライドボックス内で-80℃で凍結します。
- 細かい切片化し、使用の矢印は7ミクロン（または他の適切なセクションの厚さ、典型的には6〜10μm程度）にクライオスタット切片厚を設定するための切片厚ボタンを押してください。
プールされた凍結切片から3. RNAの単離
- RNA抽出
- 氷にプールされた凍結切片のチューブ（複数可）を移動します。すぐに追加50 mgの凍結切片の重量当たり約1ミリリットルの試薬の比で有機RNA抽出試薬、チューブ当たり、通常、600μlの。
注意：RNA単離試薬は、毒性、腐食性、および刺激性です。安全な取り扱いについては、製造元の指示に従ってください。 - 18ゲージ針を用いて1mlシリンジを使用して、RNA抽出液を上に描画し、すべての組織は、溶液中に懸濁されるまで、チューブの壁をすすぎます。針の均質化の間に気泡を最小限に抑えるようにしてください。
- 管壁に付着した塊状凍結切片と作品をマッシュアップし、分散させるために針の先端を使用してください。粉砕物は5打のための針を介して上下にサンプルを通過させることにより均質化し、次いで、氷にサンプルを返します。すべての塊を破壊し、針を介して簡単にサンプルを渡す必要があるとして、両方が3〜5倍、または何度でもステップ繰り返します。
- 18ゲージの針を外し、22ゲージの針に交換してください。慎重TR5打のためのサンプルをiturate、その後、氷にサンプルを返します。非常に微細に分散した組織ホモジネートを達成するための磨砕を3〜4回繰り返します。
注：組織粒子は、サンプルを描画するときに針をブロックするために開始した場合、注射器からのすべてのサンプルを追放し、さらに均質化のための18ゲージの針に戻します。 25または26ゲージ針を有する追加の粉砕工程は、最大収率を得るために添加することができます。サンプルこぼれの危険性があるのでしかし、針が目詰まりすることがあります。 - 室温に氷から試料を移動させます。分子複合体を破壊するために5分間インキュベートします。
- ヒュームフードでは、使用されるRNA単離試薬（ステップ3.1.1）、チューブあたり典型的には60μlに1ミリリットルあたり1ブロモ-3-クロロペンタン（BCP）の0.1ミリリットルを追加します。 （ない渦を行う）15秒間手で激しくチューブを振ります。 2〜3分間、室温でサンプルをインキュベートします。その後、12,000×gで4℃で15分間遠心操作します。
注意： - 慎重に上部の水相（無色）を含むRNAを収集し、清潔なチューブに移します。 （DEPC水で）70％の同量のエタノールを加え、ボルテックスで混合します。最大10分間室温でインキュベート。
注：中間相間および下フェノールBCP相を製造業者の指示に従って、それぞれ、ゲノムDNAおよびタンパク質のために処理するか、適切な廃棄のためにフェノールBCP有害廃棄物容器に収集することができます。
- 氷にプールされた凍結切片のチューブ（複数可）を移動します。すぐに追加50 mgの凍結切片の重量当たり約1ミリリットルの試薬の比で有機RNA抽出試薬、チューブ当たり、通常、600μlの。
- RNA精製。
- 8マイナーなバリエーションと結合サンプル、洗浄および溶出のための製造元の指示に従ってください。例えば：
- ステップ3.2.4のための-は暖かい事前に37℃の浴やインキュベーターにDNアーゼ/ RNaseフリー水の分量を置きます。
- 15秒間のサンプル上記の3.1.8から精製カラムや遠心にRNAサンプルを追加します。室温で12,000×gで。同じカラムおよび再遠心分離にバックを通る流れを注ぎます。 RNA結合を最大化するためにさらに1回繰り返し、その後を通じて、最終的な流れを捨てます。
- 製造元の指示8に記載の洗浄手順を実行します。 12,000×gで15秒間のカラムに洗浄バッファー700μlの（なしエタノール）、スピンを適用し、フロースルーを捨てます。
- 12,000×gで15秒間の列に（エタノールで）洗浄緩衝液500μl、スピンを追加し、フロースルーを捨てます。このステップを1回繰り返します。
- 膜を乾燥させるために12,000×gで1分間空の列をスピン。
- クリーンのRNase、DNaseをフリーチューブにスピンカラムを移します。カラム・メンブレンの中央に（3.2.1から）予め温めておいたのDNase / RNaseフリー水40μlのを追加します。室温では、2分間インキュベートした後、12,000×gで2分間遠心します。
注：40μlの溶出量は、元の1mgあたり約1.3マイクロリットルでありますプールされた凍結切片の30 mgのための組織。異なる出発組織重量に応じて溶出量を調整したが、32μlの下に減少しません。第二の溶出は、元の組織1mgあたり約0.7マイクロリットルを用いて、総RNAの収量を増加させるために添加することができます。 - 分光光度計、電気泳動、および/またはバイオアナライザーによって濃度および純度のためのRNA（カラム溶出）を分析します。このような定量的PCR 4のための逆転写などの下流の用途に必要とされるまで-80℃でRNAを保管してください。
注：DNase処理は、下流アプリケーションでのRNAを使用する前に、推奨されます。この処理は、任意の下流のアプリケーションの最初のステップとして、洗浄ステップの前に、カラム溶出後に、この特定のポイントで、またはRNAのアリコートに、いくつかのRNA精製カラム上で行うことができます。 RNAは、数年間は安定していなければなりません。
免疫Stainin 4.組織学的解析筋肉凍結切片のグラム
- シンプルな免疫蛍光プロトコル。
- 各スライド上のセクションのグループを一周するように疎水性のペンを使用してください。静かな組織に触れないように注意しながら、丸で囲んだ領域に（大きな表面積のために500μlのまでの小面積では約80μl）をPBSをドロップします。室温で5分間インキュベートします。
注：凍結したスライドを使用する場合は、-80℃の冷凍庫からスライドを削除し、20〜30分解凍し、乾燥し、その後、上記のように進行し、室温でインキュベートします。少なくとも2つのスライドが必要とされている：1つの実験のスライドを一次および二次抗体中でインキュベートします。一次抗体のための1つの制御スライドは、「二次のみ "コントロールを除外されています。 - PBSを捨てるために、スライドをヒント。丸で囲んだ領域へのPBS（ブロッキング溶液）中の5％ロバ血清を追加します。筋肉切片が乾燥しないように注意してください。湿度チャンバー内で数時間、室温で30分間インキュベートする（または）。
- 筋肉再生を分析するために、一次抗体溶液を準備します。 eMHC抗体（1：40）とColVI抗体（：千1）で、ブロッキング溶液混ぜます。それぞれ、小、中、または大規模なスライド領域のために、300μlあるいは500μLを約150μlのを準備します。 5秒間ボルテックスし、次いで沈殿物をペレット化するために15,000×gで2分間遠心します。
- 実験的なスライドの場合は、ブロッキング溶液を注ぎ出し、その後、4.1.3からの一次抗体溶液を追加するスライドを傾けます。二次制御スライドのために、ブロッキング溶液を注ぎ出し、その後、新鮮なブロッキング溶液（抗体なし）を追加するスライドを傾けます。 4℃で一晩湿度チャンバ内のスライドをインキュベートします。
注：スライド上に抗体溶液をピペットときは、必ず一次抗体溶液管の上部から液体を引き出し、チューブの底に沈殿物を妨害することはありません。 - ヒントソリューションをオフに注ぐためにスライド。洗浄するために、各スライドの円で囲んだ領域にPBSの滴下を追加し、先端が降り注ぎますオフ、その後、より多くのPBSを追加し、3〜5分間インキュベートします。合計3回の洗浄のために繰り返します。
注記：洗浄時間が非常に柔軟であり、必要に応じて20分まで延長することができます。一般に、溶液の変化の数が時間よりも重要です。 - DAPI核の10,000希釈：マウスIgG1（eMHC）とウサギIgG（ColVI）と1を検出するために、赤と緑の蛍光団結合二次抗体の1：500希釈を使用して（二次制御スライドを含む）すべてのスライドのための二次抗体溶液を準備します染色。
- 例えば、DAPIの1:10希釈液を作るためのddH 2 Oの9μlのDAPIの1μLを混合します。その後、500μlの最終容量、ブロッキング溶液の447.5μlに1時10分DAPIの1.0μlの1.0 +抗マウスIgG1-赤μlの抗ウサギIgG-緑+ 0.5μlを添加します。渦は、任意の沈殿物をペレット化するために15,000×gで2分間混合し、遠心分離します。
注：理想的には、すべての二次抗体は、同じ宿主種からでなければなりません。
- 例えば、DAPIの1:10希釈液を作るためのddH 2 Oの9μlのDAPIの1μLを混合します。その後、500μlの最終容量、ブロッキング溶液の447.5μlに1時10分DAPIの1.0μlの1.0 +抗マウスIgG1-赤μlの抗ウサギIgG-緑+ 0.5μlを添加します。渦は、任意の沈殿物をペレット化するために15,000×gで2分間混合し、遠心分離します。
- 最後のPBS洗浄を捨てるためにスライドをヒント。全ての組織をカバーするために、二次抗体溶液を加えます。光から保護し、30分間室温でインキュベートするスライドをカバーしています。
注：すべての二次抗体は、二重標識実験で他の種と最小の交差反応性を持つように検証する必要があります。 - 4.1.5で説明したようにスライドを洗浄します。最後の洗浄後、PBSをオフに注ぎ、組織のスライドを設定するには、スライドを傾けます。一辺に沿ってメディアをマウント水溶液の3〜4滴を追加します。
- ちょうど取り付けメディアの外縁にカバーガラスのエッジを設定します。鉗子を使用して、ゆっくりと組織に向かってカバーガラスを下げ、その後、カバースリップを解放し、静かに所定の位置に、それをタップします。最後に、そっとそれを安定化させるためにカバースリップの各コーナーを押してください。
- 使用するまで4℃で光とストアからスライドを保護します。
注：長期保存のために、目の縁に沿ってマニキュアの薄い層を適用します乾燥からスライドを防ぐために、電子カバースリップ。
- 各スライド上のセクションのグループを一周するように疎水性のペンを使用してください。静かな組織に触れないように注意しながら、丸で囲んだ領域に（大きな表面積のために500μlのまでの小面積では約80μl）をPBSをドロップします。室温で5分間インキュベートします。
- 組織学的評価。
- 画像適切なフィルタを落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いてスライドをeMHC（赤）を検出します。 ColVI（緑）。典型的には20X対物レンズ1,5を用いて、核（青）をDAPI染色しました。
- 実験のスライドからの蛍光シグナルがeMHCとColVI検出4の特異性を実証するために、二次制御スライドと異なっていることを確認してください。
注：eMHC正再生繊維は筋肉の損傷後に可変筋ジストロフィーのマウスでは約2〜7日から見えるはずです。コラーゲンVIは、筋線維、血管、および神経を周囲の細胞外マトリックスおよび周囲および筋外膜のより大きい結合組織束中に存在します。 DAPI核染色は、筋線維の再生を示す末梢核対中心核を有する繊維、および私の存在を同定するのに有用です細胞をnfiltrating。壊死性または負傷した繊維が原因で損傷した筋膜を通して繊維に浸透し、内因性IgGの検出にマウスIgG二次抗体と弱く染色することができます。 - 再生を定量化するために、画像全体の各蛍光フィルターと重なる顕微鏡写真を撮ります。場所ごとにeMHC、ColVIとDAPI画像をマージした後、セクション全体の1,5のマップを再構築するために画像の位置を合わせます。
- 解析ソフトウェアを使用して、eMHC陽性線維の数と最近の再生（100 *（＃eMHC +繊維/＃総繊維））を計算するために、総繊維の本数を数えます。また、（100 *（＃CN +繊維/＃総繊維））1,5より長い期間にわたって再生を測定するために、総繊維のうち、中央に有核繊維の数を数えます。
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Representative Results
筋肉凍結切片のRNAは、品質が高く、ほとんどのアプリケーションのための十分な収量を提供します
分析は、16骨格筋のRNA調製物を、8匹の対照マウスからプールした前脛骨（TA）筋の19.4〜41ミリグラムを用いて、 表1に示します。どちらの左（L）と右（R）TAの筋肉がメソッドを使用して、筋肉の損傷を引き起こすことが3日、生理食塩水または10μMのカルジオトキシンの25μlに縦筋肉内注射後に採取した筋肉で再生実験で調製したが、以前に1を報告しました 。 表1に示すように 、筋肉凍結切片のRNAのためのA260 / 280比は、典型的には、これらの代表的なサンプル中の2以上の近くにあります。 「純粋な」RNAは2.2 2.0〜A260 / 280 1.8のA260 / 280を有すると考えられているように、凍結切片のRNAサンプルの純度は9優れています。全RNAの回収は、一般的にオベました最下流のアプリケーションのために十分な材料を提供し、組織を開始1mg当たりの総RNAのμgの1を超えると0.18の収率でサンプルあたりrの10μgの。特に、RNA濃度、抽出した全RNA、および3日後に毒素傷害TA筋から始まる組織1mg当たりのRNA収量は、生理食塩水を注射したTAからよりも有意に高かったです。これは、筋肉の構造が広範囲の損傷によって、および/または筋再生3日に遺伝子の転写および/またはRNA安定性の増加があることが破壊されたときに改善された均質化が存在することを示唆しています。試料は18ヶ月間-20℃で保存した後のRNAの質の持続性は、単純な1×TAE /筋肉凍結切片のRNAの1マイクロリットルの1.5％アガロースゲル電気泳動によって評価しました。著名な18Sおよび28S rRNAバンドはあっても、次善の貯蔵条件（ 図1A）の下で、依然として高いRNAの品質を実証するサンプルで明らかです。
筋肉凍結切片のRNA下流のアプリケーションをサポートしています
プールされた凍結切片サンプルあたり1μgのRNAは、DNA分解酵素で処理し、オリゴdTプライマーから逆転写しました。 RNase処理の後、cDNAを逆転写の総容量は30μlでした。過剰増幅したシンプルな非定量的PCRは、cDNAの生存能力を確認するために実行されました。筋原性制御因子4（MRF4）、筋分化にアップレギュレートする転写因子は、標準的なPCRを用いて鋳型を2μlから、5'-CTACATTGAGCGTCTACAGGACCおよびアンチセンス5'-CTGAAGACTGCTGGAGGCTG 10を感知する 、以前に報告されたマウスのプライマーを用いて増幅しました。 RTのddH 2 O（なしRNA鋳型と逆転写）、またはのddH、（RNAが含まれていますが、無逆転写酵素）が左と右のTA cDNAサンプルの両方から234 bpのMRF4フラグメントの堅牢、特定の増幅があったが、RT-ありません2 O PCRコントロール（ 図1B）。同じ試料は、相対的な増幅およびリアルタイムPCRシステム上の受動蛍光リファレンスを使用してMRF4とmOaz1基準制御4定量化のために3回行いました。 MRF4はΔΔCT法4により算出し、生理食塩水を注射した左TA、と比較して毒素を注射した右TAで0.097倍で発現されました。これは3日、成熟した筋肉繊維11の損失による毒素損傷後の低MRF4式の以前の報告と同様です。定量的PCRのために凍結切片のRNAの整合性を比較するために、Ct値はmOaz1参照遺伝子について比較しました。平均Ctは36.332±3.61 RT-対照試料中のSD（N = 4）であったのに対し、6サンプルから、mOaz1転写物は、17.242±1.483 SDの平均Ctを用いて検出しました。サンプル全体のmOaz1のCt信号のタイトなグループ分けは、TA筋の凍結切片から単離されたRNAは、下流のRNA発現解析で期待どおりに実行することを示唆しています。
同腹仔対照マウスから7μmの前脛骨筋切片の間接的免疫蛍光染色の例には、3日間毒素注入後の再生繊維（ 図2）を検出することが示されています。両方のセクションは、より少ない近位筋の表面から4.5 4.6ミリメートルの深さのRNA分析のために使用される領域から150ミクロンよりも筋から収集しました。胚性ミオシン重鎖（eMHC、赤）の再生繊維、コラーゲンVIを検出する（、緑ColVI）は筋線維の概要を説明し、DAPIの汚れが濃縮された核浸潤（青信号）4.領域は毒素損傷の部位を示すプロトコルに従って、青色の核、eMHC正新たに再生筋細胞の活性化によって明らかなように。この例のようなセクション全体マップはembryoniの割合を計算することにより、再生の定量のために使用されています以前に1報告されているように、Cミオシン重鎖を発現する繊維（赤、新たに再生）または集中有核繊維。特に、 図2AのTA筋で驚くほど小さなダメージがあります。注射の間に変化があるが、図2（b）に示すように 、代表的な毒素の注射は、筋区画1のはるかに大きな割合に影響を与えます。したがって、この組織学的分析は、 図2Aの毒素損傷は最小限であり、隣接する筋肉凍結切片のRNAサンプルからの遺伝子発現データを解釈するための重要なツールを提供することを示唆しています。全筋肉が標準研削方法によって、RNA調製のために使用された場合、このサンプルの予想外に小さな損傷領域は、下流分析をゆがめることになる異常値になるだろう。代わりに、同じ筋肉から組織学的定量化をペアリングすることは、隣接するセクションからの傷害の程度を直接測定することができます。これは、院生の使用を可能にシオン/除外基準は、傷害のサイズに応じて分析最小損傷閾値またはRNAの正常化を満たす分析全てのサンプルは、下流のRNAに含まれていることを確認します。
図1：プールされた筋肉凍結切片からのRNAの品質評価。 A）18Sおよび28SリボソームRNAバンドは、RNA調製した後、プール筋肉凍結切片を18ヶ月からのRNAに顕著です。逆転写次MRF4用B）非定量的PCR。 DNAラダーの200と300 bpのバンドが示されています。 RT-は、RNAテンプレートが、無逆転写酵素で逆転写反応を。 RT-H 2 O、のddH 2 O、無RNA鋳型と逆転写。これらの実験では、H 2 O、のddH 2 Oで鋳型なしPCR制御は、毒素は、右の前脛骨（RTA）および生理食塩水WAに注入しましたSは、左（LTA）に注入しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：筋肉再生の研究のための組織学的マップのサンプル。 、B）の3日間、貧困層の例（A）と、通常の（B）毒素誘導傷害を示す毒素注射後、単一の前脛骨筋切片のマップを作成。各セクションマップの白い四角で囲まれた領域は、高倍率の表示、レッド、胚性ミオシン重鎖のためのはめ込み画像として表示されます。緑、コラーゲンVI、細胞外マトリックスタンパク質、ブルー、DAPI核染色。スケールバーは100μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。。
表1： プール筋肉凍結切片からの代表的なRNA収量と純度の測定。十六前脛骨（TA）筋を凍結切片試料をRNAのために処理した切片とプールしました。精製されたRNA（1μl）をnanospectrophotometerで分析しました。カラム統計はスプレッドシートで行った、グループの比較は、統計ソフトウェアを用いて行きました。
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Discussion
余分な樹脂は、プールされた凍結切片のコレクションが遅くなりますし、RNA単離に樹脂汚染を埋め込む増加させることができるので、この方法で最良の結果を達成するために、組織の凍結保存中に筋肉の下3分の1または半分に制限された樹脂を埋め込む保ちます。また、針の均質化中細心の注意は、収量を最大化し、針を目詰まりの可能性を最小限にすることが重要です。プロトコルは、針がブロックされ、目詰まりを取り除くために高圧が必要になった場合、サンプルの損失から保護するために、ルアーロックシリンジを使用して変更することができます。 25または26ゲージ針を有する付加的な針の均質化ステップは、さらにRNAの収量を増強するために、より微細な組織懸濁液を製造するために添加することができます。クロロホルムは、BCPの代わりに用いることができるが、これは、BCPとして推奨されていないRNA 12の有機抽出の際、水相中のゲノムDNA汚染の低いレベルで毒性が低く、その結果です。増加均質化はあまり効率的であるように、30ミクロン以上のプールされた凍結切片のセクション厚さも推奨されません。
RNA収量が所望のレベル以下である場合に、様々な戦略は、次のような回収増大させるために使用することができる：i）が可能な収率を増加させるために出発物質のミリグラム量を増加します。 ⅱ）組織の機械的均質化を改善するために、30ミクロン以下のセクションの厚さを減らします。 iii）の機械的および化学的な組織破壊を改善するために、有機抽出試薬のサンプルのインキュベーション及び針均質化の持続時間を増加させます。組織塊が残っている場合およびiv）、より厳密なニードル均質化第二抽出工程を行います。あるいは、そのような高いプロテオグリカン含量13のサンプルのための付加的な相分離及び沈殿工程のような組織特異的な考慮事項が存在し得ます。 RNAカラム精製の間に、より大きな溶出ボリュームを使用し、2回目の溶出を実施することができ、MAトータルRNA回収をximizeが、RNA濃度を犠牲に。ポストカラムアルコール沈殿は、低濃度のこの変更に懸念がある場合は、RNAを濃縮するために使用することができます。 RNAの分解は低温室、凍結切片14のRNase阻害剤を添加し、そして頻繁なニードル均質化工程を行い、切開、RNアーゼ暴露を最小限にするクライオスタット表面とツールのより厳密な洗浄中に凍結保存する時間を短縮する、という問題である場合RNaseを含まない溶液の交換は、それぞれ予防またはRNアーゼへの曝露を最小限にし、切断活性を低減するのを助けることができます。簡単に切開した後、RNase阻害剤で組織を浸すことが可能であるが、凍結保存の前に、さらなるサンプルの劣化を低減することができます。しかし、予備実験は、どのような治療は、凍結保存中に氷の結晶や他のアーティファクトを増加させないことを確実にするために実行する必要があります。
胚一方、ミオシン重鎖/コラーゲンVI間接免疫蛍光法は、損傷の筋肉分析のための一例として、ここで使用される、薄凍結切片を顕微鏡に取り付けられた後で免疫蛍光技術を含む凍結切片上で実施することができる任意の関連する組織学的染色のために使用することができ、これらの実験からスライド-fixationおよびヘマトキシリン/エオシン染色。確かに、ここで提供される単純な免疫プロトコルへの適応が必要になることがあります。例えば、マウス一次抗体（ 例えば、eMHC）を検出するために使用した抗マウス二次抗体は、標的組織における内因性のマウス免疫グロブリンを検出することができます。このような内因性抗体は、典型的には、バックグラウンドの免疫蛍光染色を引き起こして負傷したか、ジストロフィー筋損傷や壊死性筋線維に蓄積されます。 （省略一次抗体との）二次制御スライドは常に染色の特異性を評価するために検討すべきです。内因性抗体の背景に問題がある場合は、事前にブロックのステップがあるべきです内因性マウス免疫グロブリン15の検出を防止または最小限にするためのプロトコルに加えました。
この方法の主な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットを行い、時間がかかり、あります。例えば、技術の専門家は、約9〜10時間でプールされた凍結切片および顕微鏡スライドのための16の筋肉（全16組織の重複部分を有する8スライド）まで処理することができました。凍結切片にする初心者のために、2〜4サンプルからプールされた凍結切片の回収が合理的にクライオスタット訓練し、1つまたは2つのプラクティスセッションの後に習得することができ、その代わりに、組織学のために品質の凍結切片を得ることはより多くの経験をしました。したがって、機器、時間、または訓練の要因は、手動乳棒ホモジナイザーで十分に均質化することができますより柔らかい組織のため、この方法はあまり有用で行うことができます。
非クライオスタット均質化法と比較して、横紋筋のRNAの調製sが筋肉16と、より最近では0.27筋17の1mg当たり1.08μgのRNAへの0.05〜0.7μgのRNAを事前ミリグラムのRNAの収量と筋肉生検から報告されています。したがって、ここで説明する手法は、対になった組織を可能にする追加の利点と同じくらい良いか非クライオスタットの方法よりも優れたRNA収量を提供するのと同じサンプルの連続した領域から分析します。特に、以前の研究では、椎体組織中で均質化するために凍結切片に使用され、同様に凍結切片の組織は、RNA単離の13のための均質化の効率を増強することを見出しました。この技術は、ウシ骨格筋サンプルで試験したときに、試料調製当たりの平均RNA収量は、ここで報告された13の正常範囲の低い端で、4.09±0.36μgのありました。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、凍結切片からのRNA抽出のための組織の収集のための別の代替です。レーザーキャプチャは、このプールされた凍結切片法におけるよりも優れていますそれは特異性が部分から細胞の必要なサブセットのみを収集することができますし、それは、厚さ50μmの18までの単一の組織切片上で行うことができます。しかし、微小解剖サンプルの回収困難と適切な機器であることができるが、研究者にプールされた凍結切片の均質化がよりアクセスしやすく、広く利用可能ではありません。両方の方法が利用可能である場合にサブ領域分析はそれほど重要であり、RNAの高い量が必要な場合にプールされた凍結切片の均質化が最良であるが、唯一の小さなRNAの量を必要とするアプリケーションのための組織のサブ領域を分析するための設定は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを好むだろう。
組織およびRNA単離方法は、ここでの焦点であるが、プールされた凍結切片法を容易にウェスタンブロット分析、または酵素活性の測定のためにタンパク質溶解物を調製するために適合されています。例えば、心臓からのプールされた凍結切片は、ウェスタンブロットのために可溶化した4 Aを分析ND TAからプールされた凍結切片は、ミトコンドリア機能5のコハク酸脱水素酵素活性アッセイのために均質化しました。あるいは、ゲノムDNAおよびタンパク質画分を、単一のクライオスタットセッションの後、単一の組織からのゲノムDNA、タンパク質、RNA、および組織学的測定値を導出する可能性を提供し、RNA単離の後、有機抽出中に他の相から分離することができます。
全体として、この方法の主な利点は、単一の組織から別の試料調製を必要とする複数の分析手法を可能にすることによって、実験的な柔軟性を高めることです。この方法は、筋肉と乳棒ベースの組織の均質化の効率を低下させる大規模な細胞内又は細胞外構造を持つ他の組織に最も適切です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 ml syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a Luer-Lok syringe is recommended (e.g., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process; e.g., ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
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