Abstract
Thetaaktivitet genereras i septohippocampal systemet och kan spelas in med hjälp av djup intrahippocampal elektroder och implanterbara elektroencefalografi (EEG) Radiotelemetry eller tjuder systemstrategier. Farmakologiskt, är hippocampal theta heterogen (se dualistisk teori) och kan differentieras till typ I och typ II teta. Dessa individuella EEG subtyper är relaterade till specifika kognitiva och beteendetillstånd, såsom upphetsning, prospektering, inlärning och minne, högre integrerande funktioner, etc. I neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, strukturella och funktionella förändringar av septohippocampal systemet kan leda till försämrad thetaaktivitet / svängningar. En standard kvantitativ analys av hippocampus EEG innefattar en fast-Fourier-Transformation (FFT) -baserade frekvensanalys. Men denna procedur inte lämna uppgifter om thetaaktivitet i allmänhet och mycket organiserade theta svängningar i synnerhet. För att erhålla DETAIled information om högt organiserade theta svängningar i hippocampus, har vi utvecklat en ny analytiskt förhållningssätt. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för tids- och kostnadseffektiv kvantifiering av varaktigheten av högt organiserade theta svängningar och deras frekvensegenskaper.
Introduction
Theta aktivitet i hjärnan är relaterat till olika kognitiva och funktionella stater, däribland upphetsning, uppmärksamhet, frivilliga rörelser, undersökande beteende, uppmärksamhet beteende, inlärning och minne, somatosensoriska integration och snabba ögonrörelser (REM) sömn 1, 2. Principiellt kan thetaaktivitet som en rytmisk enhet genereras i olika cerebrala regioner och välorganiserad och synkroniseras som theta svängningar. Nedan kommer vi att fokusera på analys och kvantifiering av theta aktivitet / svängningar som genereras inom septohippocampal systemet 3, 4. Inom septum, GABAergic, glutamaterga och kolinerga neuron projektet till hippocampus och bidra till initiering och underhåll av theta oscillerande beteende. Det pågår en diskussion om huruvida hippocampus theta svängningar initieras i septum, dvs. 5, 6, 7.
Oavsett ursprung, har hippocampus theta svängningar varit i fokus för intresset för år, särskilt i transgena musmodeller. Dessa modeller gör det möjligt att implantation av djupa EEG elektroderna och för registrering av hippocampus theta svängningar under särskilda kognitiva och beteendemässiga uppgifter 8. Hippocampus theta svängningar är heterogen till sin natur. Baserat på den så kallade dualistiska teorin om theta svängningar, kan man skilja mellan atropin känslig typ II theta och atropin okänsliga typ I theta 9, 10, 11. Det senare kan normalt induceras av muskarina M 1 / M
För närvarande tillåter kommersiellt tillgänglig analytisk programvara för snabb FFT-baserad frekvensanalys, t ex analys av effekt (P, mV 2)eller effektspektrumtäthet (PSD, mV 2 / Hz). Makt eller effektspektrumtäthet (PSD) analys av theta frekvensområdet ger endast en global översikt över sin verksamhet. Men för att få en detaljerad inblick i kognitiv och beteenderelaterade theta aktivitet är analysen av högt organiserade theta svängningar obligatorisk. Bedömningen av högt organiserade theta svängningar är av central betydelse när det gäller neurodegenerativa och neuropsykiatriska sjukdomar. De flesta experimentella studier sjuka utförs i transgena musmodeller som använder mycket sofistikerade neurokirurgiska metoder för att spela epidural yta och djup intracerebral EEGs. Dessa tekniker innefattar både begränsningssystem 16 och radiotelemetric inställningar 17, 18. Theta svängningar kan registreras som spontana och beteenderelaterade theta svängningar under långvariga inspelningsförhållanden. Dessutom kan theta oscilleringar vara recorded efter farmakologisk induktion men även efter exponering av djur till beteendemässiga eller kognitiva uppgifter eller sensoriska stimuli, såsom svans nypa.
Tidigt metoder för att karakterisera theta svängningar beskrevs av Csicsvari et al. 19. Författarna utformat en halvautomatiskt verktyg för kortsiktiga theta analys (15-50 min) som inte lämpar sig för lång tid EEG inspelningar. Vår metod, som beskrivs här, gör det möjligt att analysera långsiktiga EEG inspelning> 48 timmar 20. Csicsvari et al. 10 hänvisade också till theta-delta-förhållande, men ingen tröskel för bestämning av högt organiserade theta svängningar tillhandahålls. Delta och theta range definitioner matchar våra frekvensområdet definitioner. Eftersom det inte uttryckligen nämns, antar vi att en FFT-baserad metod används av Csicsvari et al. att beräkna effekten av de theta-delta frekvensband. Dettagång tydligt skiljer sig från vår metod, eftersom vi beräknar wavelet-baserad amplituder på ett stort antal frekvensskalor (frekvens steg Δ (f) = 0,05 Hz), vilket resulterar i mycket högre precision. Varaktigheten av den individuellt analyseras EEG-epok liknar vår definition.
Klausberger et al. 21 också utnyttja theta-delta förhållanden för analys av långsiktiga EEG inspelningar. Men det finns tre stora skillnader jämfört med vår strategi: i) EEG epokvaraktigheten är mycket längre, det vill säga, åtminstone 6 s; ii) theta-deltatalet är inställt på 4, vilket är mycket högre än vår tröskel, och förbinds till olika frekvensområdesdefinitioner; och iii) definition strömmen är sannolikt att baseras på en FFT tillvägagångssätt, som saknar hög precision, särskilt för mycket korta tidsfönster (2 s, det vill säga 5 cykler för svängningar med en frekvens på 2,5 Hz). I sådana fall är en wavelet-baserad procedur mer råda.En studie av Caplan et al. 22 enbart beräknad theta makt och bortse från theta-delta effektförhållande. Således Caplan närmar 22 kan inte särskilja mellan kognitiva theta-rika processer som åtföljs av en hög eller låg delta.
I följande protokoll kommer vi att presentera vår analytiska wavelet-baserad metod för att på ett tillförlitligt sätt analysera högt organiserade theta svängningar i hippocampus EEG inspelningar från möss. Eftersom detta förfarande fungerar automatiskt, kan den appliceras på stora datamängder och långsiktiga EEG-mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna i den lokala och institutionella rådet Animal Care (University of Bonn, BfArM, LANUV, Tyskland). Dessutom var alla djurförsök utförs i enlighet med överlägsen lagstiftning, till exempel Europeiska gemenskapernas rådets direktiv av den 24 november 1986 (86/609 / EEG), eller individuella regional eller nationell lagstiftning. Särskild insats gjordes för att minimera antalet djur som används, liksom deras lidande.
1. djurstallar och EEG inspelningsförhållanden
- Hus möss i filter-top burar eller använda individuellt ventilerade burar.
- Överför möss från djuranläggningen till ventilerade skåp i särskilda labb rum som är lämpliga för implanterade djur och telemetriska inspelningar.
- Utför alla djurförsök, inklusive EEG elektrod implantation och efterföljande inspelningar under standardiserade förhållanden (22 ° C temperatur, 12 h / 12 h ljus-mörker-cykel, 50-60% relativ fuktighet, bullerdämpning, etc.) 18.
- Före radiofrekvent sändare implantation hysa djur i grupper om 3-4 i klara typ II polykarbonat burar, med mat och vatten efter behag. Inte isolera enskilda möss, eftersom detta kan orsaka stress och störa efterföljande experiment och resultat.
- Använd inte öppna bostadsförhållanden, men använd ventilerade skåp i stället under experiment och inspelning.
2. Radiotelemetric EEG Elektrod Implantation och EEG Record
- Söva de möss genom att använda injektions narkotika, t.ex. ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, intraperitonealt, ip) och inandning narkotika, t.ex. isofluran 17, 18.
- För isofluran narkos, placera musen i en induktions cHamber med 4-5% isofluran och 0,8-1% syre eller karbogen (5% CO2 och 95% O2).
- Placera ett kisel ansiktsmask på näsan / munnen hos djuret för att styra det önskade djupet av anestesi och undvika försöksledaren exponering för isofluran med användning av ett spolningssystem.
- Använd injicerbara anestetika, t.ex. esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) och xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), om inhalationsanestesi inte är tillgänglig.
- Övervaka djup anestesi genom att kontrollera svansen nypa reflex, fot nypa reflex, och andningsfrekvens. Observera att konstgjord andning via intubation är inte nödvändigt i möss.
- Implantera radiofrekvenssändaren in i en subkutan påse på baksidan av djuret.
- Avlägsna kroppshår från hårbotten och förbehandla det rakade hårbotten med två desinfektionsmedel, dvs., 70% etanol och ett jodbaserat skrubba.
- Med hjälp av en skalpell, görett medellinjesnitt i hårbotten från pannan till nucheal regionen.
- Med början från den NACK incision, förbereda en subkutan påse på en sida av ryggen av djuret genom att utföra en trubbig dissektion med hjälp av kirurgisk sax eller en kirurgisk sond.
- Sätt sändaren i den subkutana påsen och deponera överskottslängd av den flexibla sändaren leder in i påsen också. Ägna särskild uppmärksamhet åt att förhindra kontaminering av operationsområdet och implantat sändare. Korrekt isolera sterilt från icke-sterila områden med draperier.
- Placera försöksdjur på stereotaxic ram, t.ex. en datoriserad 3D stereotaktisk anordning. Fäst skallen med en näsa klämma och örat barer.
- Förbehandla skallen med 0,3% H 2 O 2 för att ta bort ytterligare vävnad från skallen och belysa kraniets suturer och landmärken craniometrics, bregma och lambda.
- Borra hål på koordinaterna för val(Se steg 2,6) med en hög hastighet neuro borra i en tryck fritt läge med maximal hastighet.
OBS: Tryckfritt borrning undviker plötsliga genombrott av borrhuvudet och skada på cortex. För en kraniotomi, är en neurokirurgisk höghastighetsborr rekommenderas. Välj standardborrhuvud diameter på 0,3 - 0,5 mm, beroende på elektroddiameter. - Välj noga elektrod, med tanke på impedans, diameter, beläggning, etc.
NOT: Parylene belagd volfram eller rostfritt stål elektroderna är de vanligaste. Elektrodtyper bör väljas enligt experimentella krav. Som ett förebyggande manöver, sterilisera elektrodspetsarna före implantation med användning av 70% etanol. Notera att elektrodbeläggningen inte tillåter värmesterilisering. - För intrahippocampal CA1 EEG inspelningar, borra ett hål stereotaxically på följande koordinater: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (högra hjärnhalvan); dorsoventral, 1,3 mm (target region: cornu Ammonis (CA1) pyramidal skikt). För referenselektrod, borra ett hål ovanför lillhjärnan cortex på följande stereotaktiska koordinater: bregma, -6,2 mm, mediolateral, 0 mm; dorsoventral, 0 mm.
OBS: Den cerebellär elektroden tjänar som en pseudoreference elektrod, som lillhjärnan är en ganska tyst hjärnregion. De stereotaktiska koordinater erhölls från en standard mushjärna atlas. - Före införandet av elektroderna, förkorta dem till önskad längd. Mekaniskt klippa den extrakraniella del av elektroden till det rostfria stålspiral på sändaren.
OBS: Soldering bör undvikas, eftersom detta kan införa betydande brus i systemet. - Fäst elektroden till den vertikala armen av stereotaxic enheten och sätt elektroden i enlighet med de tidigare nämnda stereotaktiska koordinater.
- Fäst elektroderna med hjälp av glasjonomercement och vänta tills cementen har helt härdad.
- Stänga hårbottenmed hjälp av över-och-over suturer med icke absorber 5-0 eller 6-0 suturmaterial.
- För postoperativ smärthantering, administrera karprofen (5 mg / kg, subkutant, se) en gång om dagen under 4 på varandra följande dagar efter implantation. Observera att karprofen ska injiceras innan det första snittet (steg 2.2.2).
- Tillåta djuren att återhämta sig under 10 - 14 dagar efter implantation före inspelningarna och / eller insprutnings experiment startas.
3. Spontana Inspelningar av Theta Svängningar och Farmakologisk Induktion
- Aktivera radiofrekvenssändaren använder magnetbrytare. Placera djuret med sin hembur på mottagaren plattan. Utför långsiktiga hippocampus EEG inspelningar under minst 24-48 timmar.
OBS: Analysen av EEG amplitud och EEG frekvensegenskaperna hos långsiktiga inspelningar ger detaljerad inblick i dygnsrytm beroendet av theta svängningar och deras association med specifika beteende ochkognitiva förutsättningar / uppgifter. kombinerar alltid EEG inspelningar med videoövervakning av försöksdjur. - För farmakologisk induktion av theta oscillationer, administrera en enda dos av uretan (800 mg / kg ip) eller en enda dos av en muskarin receptoragonister, t.ex. pilokarpin (10 mg / kg ip), arekolin (0,3 mg / kg ip) eller oxotremorin (0,03 mg / kg ip). Förbehandla möss med N-metylskopolamin (0,5 mg / kg ip) för att undvika perifera muskarina reaktioner. Färskt upplösa alla läkemedel i 0,9% NaCl eller Ringer-lösning.
OBS: Högre doser av muskarina receptoragonister kan leda till krampinduktion hos försöksdjur. anser också att de doser som anges här representerar landmärken som kräver tidigare studier dos-effekt i mus linje under utredning. Observera att uretan är en mutagen och carcinogen som kräver lämpliga försiktighetsåtgärder vid lagring och hantering. - Injicera atropin (50 mg / kg, ip) för att differentiera atropin känslig typ IIfrån atropin okänsliga typ I Theta svängningar.
OBS: atropin dosen är återigen art- och stamberoende och kräver förhandsutvärdering dos-effekt. Den optimala tidpunkten för atropin injektion beror på farmakodynamiken av muskarina receptoragonister. För identifiering av typ II theta är atropin injektion rekommenderas 1 timme efter uretan administration. - Försök att undvika den senare tillämpningen av flera läkemedel, som systemisk läkemedelsadministrering förändrar globala transkriptionella och translation mönster, som påverkar efterföljande EEG inspelningar. Notera att kortvarig theta svängningar kan också induceras genom sensoriska stimuli, såsom bak- eller tass-klämmande.
- Utdrag / export representant EEG dataset av pre-fas (baslinje) och efter injektionen fasen från den totala EEG inspelningen som ASCI eller TXT-filer, med tanke på farmakokinetiken för de läkemedel som använts och de krav som den individuella studieprotokollet.
4.Validering av EEG Elektrodplacering
- Avliva djuren genom att placera dem i en inkubationskammare och införa 100% koldioxid. Använda en fyllningshastighet av 10-30% av kammarvolymen per minut med koldioxid tillsätts till den befintliga luften i inkubationskammaren; detta kommer att resultera i snabb medvetslöshet med minimal stress för djuren.
- Ta musen från kammaren när andningsstillestånd inträffar och en bleka ögonfärg kvarstår 2-3 minuter.
- Skär elektroderna av rostfritt stål och explantera radiofrekvenssändaren. Decapitate musen med sax eller en giljotin och ta bort hjärnan från neurocranium genom försiktig manipulation med kirurgiska saxar och tänger.
- Fixa hjärnorna i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7,4) över natten. För kryoskydd, överföra hjärnor att 30% glukos och förvara dem vid 4 ° C tills vidare bearbetning.
OBS: Paraformaldehyd anses farligt i den 2012 OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Vidta nödvändiga försiktighetsåtgärder: Använd personlig skyddsutrustning, säkerställa en lämplig ventilation och undvika dammbildning. Dessutom, ta bort tändkällor och vidta förebyggande åtgärder mot statisk elektricitet. Paraformaldehyd bör inte släppas ut i miljön. - Montera den extraherade hjärnan på vävnaden innehavaren av en kryostat med hjälp av ett lim och skär hjärnorna i 40 - 75 pm coronal skivor. Montera skivorna på objektglas och färga dem med Nissl blå med standard histologiska förfarandet; detta förfarande kommer att visualisera grenkanal som återspeglar den tidigare elektroden position. Observera att det även är möjligt att skära koronala skivor från den nativa hjärnan med användning av en vibroslicer
- Införliva endast de djur som uppfyller korrekta EEG elektrodplaceringskriterier; för CA1-regionen, bör spetsen på den djupa elektroden vara lokaliserad inne i CA1 pyramidal skiktet.
- Spela CA1 intrahippocampal EEGs med en lämplig samplingshastighet utan a priori filter cut-off.
OBS: Samplingshastigheten, som är sändare specifika, bestämmer den övre frekvensen gränsen för EEG-analys. - Bearbeta inspelade data med en analysmjukvara. Programtid frekvens analyser och beräkningar med skräddarsydda rutiner för adekvat kontroll av analysmetoder (Figur 5) 20.
- Skär den inspelade EEG i sektioner med en längd av en timme vardera. Använd snabba datorprocessorer, eftersom beräkningstiden är hög. Dessutom använder sig av programvara som kan parallellisera computing på flera kärnor 20.
6. EEG Data Analysis
- Analysera datasegment med hjälp av en komplex Morlet wavelet att beräkna både frekvens och amplitud av svängningar.
OBS: Denna wavelet (t.ex. Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 jag π c x) exp (-x 2 / b), där b är den parameter bandbredd, c mittfrekvensen, och i den imaginära enheten) har ofta tillämpats i litteraturen för att studera EEG uppgifter, eftersom det garanterar optimal upplösning i både frekvens och tid 23, 24. - Använd en frekvensinställning parameter bandbredd och centrum som särskilt vikter frekvensupplösningen för att skilja de frekvensskillnader på 0,1 Hz nivå samtidigt inte försumma en tillräcklig tidsupplösning.
OBS: Neuronala processer i gamma-bandet är kortvariga 25, och detta kan också gälla för thetavågor. Således måste analytiskt förhållningssätt överväga tillräcklig tidsupplösning. - Analysera EEG-data i frekvensområdet av 0,2-12 Hz, med en stegstorlek på 0,1 Hz, således även den typiska delta, denTA, och alfa frekvensområden.
- Inrätta ett automatiserat, komplexa analysverktyg för utarbetandet av theta frekvens arkitektur, som kan ersätta en vanlig visuell inspektion av theta svängningar; Detta förfarande kallas metoden theta detektion (TDM).
- Beräkna kvoten av den maximala amplituden i theta frekvensområde (3,5 till 8,5 Hz) och den maximala amplituden i den övre deltafrekvensområdet (2-3,4 Hz) under tidsfönster av 2,5 s vardera.
OBS: Värdet av denna kvot fungerar som en åtgärd för att avgöra om en theta svängning skett. Definitionen av theta frekvensområdet kan variera beroende på funktionsläge och neuroanatomiska kretsar / system som skall analyseras. - Klassificera ett segment som en "theta oscillerande epok," om den beräknade kvoten under detta segment är över 1,5.
OBS: Detta garanterar att den maximala theta amplituden är åtminstone 50% högre än amplituden i den övre delta bandet under tillhörande 2,5-s EEGsegmentet. Observera att förhållandet kan behöva anpassas beroende på linjen och / eller arter som används. Ett intervall på 2,5 s representerar en minimal varaktighet för en theta svängning förhindrar falskt positiva upptäckter av vissa bullriga epoker, och ligger inom intervallet definitionerna av andra publikationer 19, 26. Den övre delta frekvensområdet fungerar som en kontroll frekvensband eftersom fysiologiskt relevant deltaaktiviteten visas under icke-theta epoker, till exempel under långsam våg sömn, som i hög grad dämpas under theta aktivitet. - Upprepa denna procedur för varje 1 timme sektion; Därför, varje avsnitt består av 1440 EEG segment med längder på 2,5 s vardera.
- Statistiskt utvärdera data från de identifierade theta svängnings epoker.
- Beräkna statistiken för den totala varaktigheten tider detekterade theta epoker; distinkta eller fördefinierade grupper; cykler, såsom ljus / mörker; och andras parametrar.
OBS: StatiSTICS kan inkludera t-test, ANOVA, eller MANOVA, beroende på den rörliga, antalet grupper, villkoren, etc. - Beräkna statistik amplituden hos de detekterade theta epoker, men bara i theta frekvensområdet (3,5-8,5 Hz).
- Utvärdera statistiken över frekvensen av de detekterade theta epoker, men bara i theta frekvensområdet (3,5-8,5 Hz).
OBS: theta frekvensen av en theta epok definieras som den frekvens som tillhör den maximala theta amplituden hos en theta epok.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Theta aktivitet kan registreras i ett brett spektrum av centrala nervsystemet (CNS) regioner. Här presenterar vi en analys av theta svängningar från mus hippocampus. Sådana svängningar kan uppstå under olika beteendemässiga och kognitiva tillstånd. Det rekommenderas starkt att analysera theta svängningar under både spontana långsiktiga, uppgiftsrelaterat kortsiktiga och farmakologiskt inducerade betingelser.
Figur 1 visar en representativ intrahippocampal CA1 inspelning under kontrollbetingelser. Om djuret är inte i ett spontant "theta tillstånd", den intrahippocampal EEG kännetecknas ofta av stora oregelbundna amplitud (LIA) aktivitet. Administration av muskarina agonister (t.ex. arekolin, pilokarpin, eller uretan) resulterar i högt organiserade theta svängningar som kan blockeras av atropin (50 mg / kg, ip, Figur 1).
(Figur 2). Baserat på denna klassificering, är det möjligt att kvantifiera den totala varaktigheten theta svängningar i spontana betingelser eller specifika beteende- och kognitiva uppgifter.
För att analysera en 30-min EEG segmentet (som för farmakologisk uretan / atropin theta dissektion), vi först utföra en tidsfrekvensanalys för ett frekvensområde av 0,2 till 12 Hz, som visar amplitud (mV) i en färg- kodad mode (Figur 3 A). Som blir uppenbart i figur 3 A, med hög amplitud theta aktivitet, vilket bekräftas av en visuell inspektion av EEG (vita pilar), åtföljs av en låg amplitud i deltat frekvensområdet. Därefter maximala amplituder avtheta (3,5-8,5 Hz) och delta (2-3,4 Hz) frekvensområden ritas (Figur 3 B). Systematiska korrelationsstudier avslöjade att förhållandet mellan maximal theta amplitud till maximum delta amplitud som överstiger 1,5, vilket indikerar högt organiserade theta oscillationer (Figur 3 C).
Figur 4 visar hur uretan kan inducera hippocampus theta svängningar (vita cirklar i Figur 4 II). Uretan är en multi-mål läkemedel som kan utlösa typ II theta på grund sin agonistiska verkan på muskarinreceptorer. Efter en atropin injektion (Figur 4 III), dessa typ II theta svängningar (atropin känsliga theta svängningar) avskaffas. Det är viktigt att tänka på att de muskarina receptoragonister, förutom atropin, har individuella farmakokinetiska egenskaper som påverkar tids egenskaper theta förekomst och theta blockad. Det bör noteras att atropin-okänslig typ I theta förblir unaffected genom muskarina receptorantagonister.
En sammanfattning av hela theta detektering och kvantifiering verktyget visas i fig 5. Det resulterar i beräkningen av amplitud, frekvens, och summan / medelvärde theta varaktighet. I motsats till tidigare beskrivna tekniker, gör det användningen av en wavelet-baserad metod med hög precision. Den analytiska verktyg som beskrivs här har flera tillämpningsområden. Theta svängningar genereras i septohippocampal systemet och ofta försämras av neurodegenerativa processer, t.ex. i Alzheimers sjukdom. Ett stort antal musmodeller av Alzheimers sjukdom har beskrivits som varierar i homologi, isomorfi och förutsägbarhet. Vissa av dessa modeller har rapporterats att uppvisa en minskning av theta-aktivitet, medan andra har visat att visa en ökning av theta-aktivitet, anledningen till vilken återstår att bestämma. Vi tillämpade framgångsrikt theta detekterings tool beskrivs här för att karakterisera förändrad theta oscillerande arkitektur i 5XFAD modell av Alzheimers sjukdom 8. Det kan emellertid även tillämpas vid epilepsi forskning och neuropsykiatriska sjukdomar.
Figur 1: Theta Svängningar i C57Bl / 6-möss. Radiotelemetric intrahippocampal CA1 inspelning enligt spontana betingelser (I) och efter uretan injektion (800 mg / kg, ip, II). Efter uretan injektion högt organiserade theta svängningar blir synliga, som kan blockeras av atropin (50 mg / kg, ip). Denna siffra har ändrats från referens 20, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En Wavelet-baserad analys av en djup CA1 EEG Inspelning från en C57Bl / 6 mus. (A och B) Två 2,5-s EEG epoker skildras, visuellt klassificeras som icke-theta och theta segment, respektive. (C och D) Tidsfrekvensanalys av CA1 EEG segment som visas i A och B i intervallet 0,2 till 12 Hz, med amplituden är färgkodade. Analys tids-frekvens i C uppvisar oregelbundna, fluktuerande theta arkitektur om frekvenser och tid, medan ett segment med starkt synkroniserade theta svängningar kännetecknas av en vanlig, icke-fluktuerande hög amplitud theta av en nästan konstant frekvens av 6 Hz. Förhållandet mellan högsta theta till maximum delta amplitud är 1,25 i C och 4,67 i D, klart klassificera
Figur 3: En Wavelet-baserad Theta Detection Tool. (A) Tid-frekvensanalys av en 30 min EEG-segment (ej visad) som har registrerats efter uretan administrering. Den komplexa Morlet wavelet-baserad analys utfördes i området av 0,2 till 12 Hz, med amplituden (mV) är färgkodade. (B) Den här bilden visar den maximala amplituden för theta frekvensbandet (3,5-8,5 Hz, grön) och den övre delta bandet (2-3,4 Hz, röd) för 30 minuters EEG segmentet. (C) Denna figur illustrerar förhållandet mellan den maximala theta amplitud(grönt i B) och den maximala delta amplitud (rött i B). Observera att högt synkroniserade theta svängningar korrelerar med suprathreshold förhållanden i C. Denna siffra omtryckt från referens 20, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Wavelet-baserad analys av farmakologiskt-inducerade, välorganiserat Theta svängningar. Representativ 30-min EEG-segment (ej visade) är analyseras i frekvensområdet 0-12 Hz med amplituden (mV) är färgkodade. En uretan injektion vid 800 mg / kg, ip, resulterade i den fragmenterade förekomsten av högt organiserade theta svängningar, med en övervägande frekvens av ca 6 Hz (vita cirklar). Efter en påropine injektion vid 50 mg / kg, ip, dessa theta oscillationer avskaffas. Denna siffra trycktes från referens 20, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: flödesschema som åskådliggör kvantifiering av lång organiserade Theta Svängningar Recorded från Murine CA1. Typ II theta oscillationer kan analyseras med användning av en kontroll inspelning (fas), en post-injektion (t.ex., uretan, arekolin, eller pilokarpin) fas och en post-atropin fas (A1). 30 min EEG segment (A2) från varje fas är tids frekvens analyseras i intervallet 0,2 till 12 Hz med hjälp av en wavelet-baserad metod (B1 och B2). Nästa, theta segmentet detektering initieras (C1), vilket ger en närmare titt på de tidsfrekvensegenskaperna hos theta intervallet (3,5-8,5 Hz, C2) och den övre delta intervallet (2-3,4 Hz, C3) för EEG epoker som är 2,5 s vardera (C4 och C5). Därefter amplitud analyseras över theta och deltafrekvensområde som visar de maximala värden (C6 och C7). Om den maximala amplituden av theta / delta överstiger 1,5 är 2,5 s EEG segment klassificeras som en epok av högt organiserade theta svängning (C8), med en definierad amplitud och frekvens (D1-D3). Detta verktyg theta upptäckt möjliggör kvantifiering av theta svängning arkitektur (E1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Theta verksamhet är av central betydelse i systemisk neurofysiologi. Det kan observeras i olika hjärnregioner, i synnerhet i hippocampus, där det är relaterat till specifika beteendemässiga och kognitiva tillstånd. Dessutom kan hippocampus theta vara farmakologiskt differentieras till atropin känslig typ II och atropin okänsliga typ I theta. Typ I tros vara relaterad till förflyttning, såsom promenader eller springer 27, 28, 29, 30, 31, medan kan observeras typ II under alert-orörlighet tillstånd 27, 28, 29, 30. Alert-orörlighet tillstånd kan induceras av en gles och slumpmässiga tonen eller taktila stimuli, till exempel 32. Typ II theta är också relaterad till passive hela kroppen rotation 14. Under paradoxal sömn, både atropin känsliga och atropin resistenta thetavågor finns 33. Den vilande-orörlighet tillstånd kännetecknas av stora oregelbundna aktivitet (LIA) 27.
I allmänhet kan theta svängningar registreras under spontana förhållanden, men även efter farmakologisk induktion (t.ex. genom tillämpning av muskarina receptoragonister, såsom uretan, pilokarpin, arekolin, oxotremorin, etc.). Observera att farmakodynamiskt, är uretan en multi-mål läkemedel som kan förbättra typ II theta men hämmar också typ I theta. Däremot pilokarpin, arekolin, och oxotremorin selektivt inducera typ II theta. Beroende på farmakokinetiken för de muskarina agonister som används, det tar en varierande mängd tid tills theta svängningar uppstår. Typ II kan blockeras effektivt av atropin. Kritiskt, dovise muskarina agonister och antagonister att framkalla och blockera typ II theta svängningar är art- och dragberoende. Således är det absolut nödvändigt att utföra dos-effektstudier att riva upp den optimala dosen för induktion av teta svängningar och för deras blockering för en specifik vetenskaplig fråga. Kortvarig theta svängningar kan också induceras genom sensoriska stimuli, såsom bak- eller tass-klämmande.
Det finns olika metoder att karakterisera theta aktivitet i allmänhet. FFT-baserade metoder, vilket resulterar i kontinuerliga eller diskontinuerliga (frekvensband relaterade) kraftspektrum täthet (PSD) analys / tomter eller i en maktanalys för enskilda frekvensband, är standardmetoder som ger värdefull information om frekvensegenskaper.
Men för att uppnå en mer komplex inblick i theta arkitektur, ytterligare tillvägagångssätt verkar vara nödvändig. Framför allt kan man vara intresserad av de olika organizational tillstånd theta och deras frekvenser, som inte kan bedömas direkt och korrekt av ovan nämnda förfaranden. I motsats, den nya analysteknik som presenteras här är wavelet-baserad och kan utvärdera högt organiserade, kortsiktiga theta svängningar. De motsvarar inte standard theta kraft, som också anser paroxysmal, diskontinuerliga thetaaktivitet. Fokus är att framkalla specifika tidsfrekvensegenskaper i EEG data som är typiska för theta epoker. Således förhindrar den nya metoden falskt positiva klassificeringar av theta epoker. Den automatiserade förfarandet garanterar utvärdering av långvariga EEG dataset och omfattar därför tillförlitliga statistiska jämförelser av fysiologiska cykler (ljus / mörk cykel eller dygnsrytm rhythmicity) under långtidsstudier.
Detta protokoll är av särskild betydelse i analysen av EEG-data som erhållits från djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar, särskilt i kännesering av högt organiserade theta arkitektur i septohippocampal och andra neurala system. Komplexa och hög precision theta analys kan hjälpa till att avgöra EEG fingeravtryck som kan fungera som EEG biomarkörer i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 407-418 (1969).
- Kahana, M. J., Seelig, D., Madsen, J. R.
- Varga, V., et al. The presence of pacemaker HCN channels identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol. 586, 3893-3915 (2008).
- Takano, Y., Hanada, Y. The driving system for hippocampal theta in the brainstem: an examination by single neuron recording in urethane-anesthetized rats. Neurosci Lett. 455, 65-69 (2009).
- Goutagny, R., Manseau, F., Jackson, J., Danik, M., Williams, S. In vitro activation of the medial septum-diagonal band complex generates atropine-sensitive and atropine-resistant hippocampal theta rhythm: an investigation using a complete septohippocampal preparation. Hippocampus. 18, 531-535 (2008).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28, 4096-4107 (2008).
- Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29, 8094-8102 (2009).
- Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plast. 2015, 781731 (2015).
- Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33, 325-340 (2002).
- Buzsaki, G., et al. Hippocampal network patterns of activity in the mouse. Neuroscience. 116, 201-211 (2003).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nat Neurosci. 16, 130-138 (2013).
- Shin, J.
- Shin, J., et al. Phospholipase C beta 4 in the medial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors. J Neurosci. 29, 15375-15385 (2009).
- Shin, J., Kim, D., Bianchi, R., Wong, R. K., Shin, H. S. Genetic dissection of theta rhythm heterogeneity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18165-18170 (2005).
- Brown, D. A., Adams, P. R. Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current in a vertebrate neurone. Nature. 283, 673-676 (1980).
- Senkov, O., Mironov, A., Dityatev, A. A novel versatile hybrid infusion-multielectrode recording (HIME) system for acute drug delivery and multisite acquisition of neuronal activity in freely moving mice. Front Neurosci. 9, 425 (2015).
- Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plast. 2016, 8213878 (2016).
- Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), (2016).
- Csicsvari, J., Hirase, H., Czurko, A., Buzsaki, G. Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron. 21, 179-189 (1998).
- Muller, R., et al. Atropine-sensitive hippocampal theta oscillations are mediated by Cav2.3 R-type Ca2+ channels. Neuroscience. 205, 125-139 (2012).
- Klausberger, T., et al. Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in vivo. Nature. 421, 844-848 (2003).
- Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
- Montgomery, S. M., Buzsaki, G. Gamma oscillations dynamically couple hippocampal CA3 and CA1 regions during memory task performance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14495-14500 (2007).
- Kronland-Martinet, R., Morlet, J., Grossman, A. Analysis of sound patterns through wavelet transform. Int J Pattern Recognit Artif Intell. 1, 29 (1987).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12, 1491-1493 (2009).
- Bland, B. H. The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms. Prog Neurobiol. 26, 1-54 (1986).
- Leung, L. S. Generation of theta and gamma rhythms in the hippocampus. Neurosci Biobehav Rev. 22, 275-290 (1998).
- Shin, J., Talnov, A. A single trial analysis of hippocampal theta frequency during nonsteady wheel running in rats. Brain Res. 897, 217-221 (2001).
- Shin, J. A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis. Biosystems. 67, 245-257 (2002).
- Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital. Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).
- Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).
- Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior. Brain Res. 124, 544-549 (1977).
