Abstract
Theta activiteit gegenereerd in de septohippocampal systeem en kan worden opgenomen met diepe intrahippocampale elektroden en implanteerbare elektro-encefalogram (EEG) of radiotelemetrie tuiersysteem benaderingen. Farmacologisch, hippocampus theta heterogeen (zie dualistische theorie) en kan worden onderverdeeld in type I en type II theta. Deze individuele EEG subtypes zijn aan specifieke cognitieve en gedragstoestanden, zoals opwinding, exploratie, leren en geheugen, hogere integratieve functies, enz neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, structurele en functionele veranderingen van de septohippocampal systeem kan verminderde theta activiteit / oscillaties. Een standaard kwantitatieve analyse van de hippocampus EEG omvat een Fast-Fourier-Transformatie (FFT) gebaseerde frequentieanalyse. Echter, deze procedure niet details over theta-activiteit in het algemeen en goed georganiseerde theta-oscillaties in het bijzonder. Met het oog op het verkrijgen van detaILED informatie over zeer georganiseerde theta oscillaties in de hippocampus, hebben we een nieuwe analytische benadering ontwikkeld. Deze benadering zorgt voor tijd- en kosteneffectieve kwantificering van de duur van goed georganiseerde theta-oscillaties en de frequentiekarakteristieken.
Introduction
Theta activiteit in de hersenen is gerelateerd aan verschillende cognitieve en functionele staten, waaronder opwinding, aandacht, vrijwillige beweging, verkennende gedrag, aandacht gedrag, leren en geheugen, somatosensorische integratie en rapid eye movement (REM) slaap 1, 2. In principe kan theta-activiteit als een ritmische eenheid worden gegenereerd in verschillende cerebrale regio's en is sterk georganiseerd en gesynchroniseerd als theta-oscillaties. Hieronder zullen we ons richten op de analyse en kwantificering van theta-activiteit / trillingen die worden gegenereerd binnen het septohippocampal systeem 3, 4. Binnen het septum, GABAergic, glutamaat, en cholinerge neuronen project om de hippocampus en bijdragen aan de initiatie en onderhoud van theta oscillerende gedrag. Er is een voortdurende discussie over de vraag of de hippocampus theta-oscillaties worden geïnitieerd in het septum, dat wil zeggen, 5, 6, 7.
Ongeacht hun afkomst, hebben de hippocampus theta-oscillaties in het brandpunt van de belangstelling voor de jaren, met name in transgene muismodellen. Deze modellen zorgen voor de inplanting van diepe EEG-elektroden en voor het opnemen van de hippocampus theta-oscillaties onder specifieke cognitieve en gedragsmatige taken 8. Hippocampus theta-oscillaties zijn heterogeen van aard. Op basis van de zogenaamde dualistische theorie van theta-oscillaties, kan men onderscheid maken tussen atropine-gevoelige type II theta en atropine-ongevoelige type I theta 9, 10, 11. Dit laatste kan gewoonlijk worden geïnduceerd door muscarine M 1 / M
Momenteel commercieel beschikbare analytische software maakt een snelle FFT-gebaseerde frequentieanalyse, bijvoorbeeld analyse van vermogen (P, 2 mV)of vermogensspectrum dichtheid (PSD, mV 2 / Hz). Macht of vermogensspectrum dichtheid (PSD) analyse van de theta frequentiebereik geeft slechts een globaal overzicht van haar activiteiten. Echter, teneinde een gedetailleerd inzicht in cognitieve en gedragsgerelateerde theta activiteit, de analyse van zeer georganiseerde theta oscillaties verplicht. De beoordeling van de goed georganiseerde theta-oscillaties is van cruciaal belang op het gebied van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. De meeste experimentele studies ziekte zijn opgenomen in transgene muismodellen met behulp van zeer geavanceerde neurochirurgische benaderingen van epidurale oppervlak en diepe intracerebrale EEGs opnemen uitgevoerd. Deze technieken omvatten zowel tether systemen 16 en radiotelemetric opstellingen 17, 18. Theta-oscillaties kan worden opgenomen als spontaan en gedragsgerelateerde theta-oscillaties onder de langlopende opnameomstandigheden. Bovendien kan theta-oscillaties Reco zijnrded volgende farmacologische inductie, maar ook na de blootstelling van dieren aan gedrags- of cognitieve taken of zintuiglijke prikkels, zoals de staart knijpen.
Vroeg zal gaan karakteriseren theta-oscillaties werden beschreven door Csicsvari et al. 19. De auteurs gemaakt van een semi-geautomatiseerd instrument voor kort theta analyse (15-50 min) die niet geschikt voor lange-tijd EEG-registraties. Onze werkwijze beschreven, maakt de analyse van de lange termijn EEG-registratie> 48 uur 20. Csicsvari et al. 10 ook wel de theta-delta ratio, maar geen drempel voor de bepaling van zeer georganiseerde theta oscillaties voorzien. De delta en theta range definities overeen met onze frequentiebereik definities. Aangezien dit niet expliciet vermeld, veronderstellen we dat een FFT-gebaseerde methode wordt gebruikt Csicsvari et al. de kracht van de theta-delta frequentiebanden berekenen. Dezeopnieuw duidelijk van onze werkwijze, omdat we berekenen wavelet-gebaseerde amplitudes op een groot aantal frequentie schalen (frequentiestappen Δ (f) = 0,05 Hz), zodat veel hogere precisie. De duur van de individueel geanalyseerde EEG tijdperk lijkt op onze definitie.
Klausberger et al. 21 Ook het gebruik van theta-delta's maken de analyse van de lange termijn EEG-registraties. Er zijn echter drie belangrijke verschillen ten opzichte van onze werkwijze: i) de Periodeduur EEG is veel langer, dat wil zeggen ten minste 6 s; ii) de theta-delta verhouding op 4, dat is veel hoger dan onze drempel, en is gerelateerd aan ander frequentiebereik definities; en iii) de definitie van vermogen waarschijnlijk gebaseerd op FFT benadering, die een hoge precisie ontbreekt, in het bijzonder voor zeer korte tijdvensters (2 s, dat wil zeggen, 5 cycli trillingen met een frequentie van 2,5 Hz). In dergelijke gevallen is een wavelet-gebaseerde procedure is bevelen.Een studie door Caplan et al. 22 uitsluitend berekende theta vermogen, terwijl het negeren van de theta-delta vermogensverhouding. Dus de Caplan benadering 22 kan geen onderscheid tussen cognitieve theta-rijke processen gepaard met een hoge of lage delta.
In de volgende protocol, zullen we onze analytische wavelet-gebaseerde aanpak te presenteren op een betrouwbare manier te analyseren goed georganiseerde theta-oscillaties in de hippocampus EEG-registraties van muizen. Aangezien deze regeling automatisch werkt, kan worden toegepast om grote hoeveelheden gegevens en langdurige EEG-metingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de lokale en institutionele Raad over Animal Care (Universiteit van Bonn, BfArM, LANUV, Duitsland). Daarnaast werd alle dierproeven uitgevoerd in overeenstemming met superieure wetgeving, bijvoorbeeld de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609 / EEG), of individuele regionale of nationale wetgeving. Specifieke poging werd gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden minimaliseren.
1. Dierlijke Huisvesting en EEG opnameomstandigheden
- Huis muizen in filter-top kooien of gebruik maken van individueel geventileerde kooien.
- Transfer muizen uit het dier mogelijkheid om geventileerde kasten in speciale lab kamers die geschikt zijn voor geïmplanteerde dieren en telemetrische opnames.
- Voer alle dierproeven, waaronder EEG elektrode implantatie en de daaropvolgende opnames, onder gestandaardiseerde omstandigheden (22 ° C temperatuur, 12 uur / 12 uur licht-donker cyclus, 50-60% relatieve vochtigheid, geluidsdemping, etc.) 18.
- Voorafgaand aan radiofrequente zender implantatie huis dieren in groepen van 3-4 in heldere type II polycarbonaat kooien, met voedsel en water ad libitum. Geen individuele muizen niet te isoleren, omdat dit stress veroorzaken en interfereren met daaropvolgende experimenten en resultaten.
- Gebruik geen geopend woonomstandigheden, maar gebruik geventileerde kasten in plaats tijdens het experimenteren en het opnemen.
2. Radiotelemetric EEG Electrode Implantatie en EEG Recordings
- Verdoven de muizen middels injectie narcotica, bijvoorbeeld ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, intraperitoneaal, ip) of inhalatie verdovende middelen, bijvoorbeeld isofluraan 17, 18.
- Voor isofluraan narcose, plaatst u de muis in een inductie cHamber met 4-5% isofluraan en 0,8-1% zuurstof of carbogen (5% CO2 en 95% O2).
- Plaats een silicium gezichtsmasker op de neus / mond van het dier op de gewenste diepte van de anesthesie beheersen en voorkomen experimentator blootstelling aan isofluraan via een scavenging systeem.
- Gebruik injecteerbare anesthetica, bijvoorbeeld esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) en xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), als inhalatie-anesthesie is niet beschikbaar.
- Bewaken van de diepte van de anesthesie door het controleren van de staart knijpen reflex, voet knijpen reflex, en ademhaling. Merk op dat kunstmatige beademing via tracheale intubatie niet nodig bij muizen.
- Implanteer de radiofrequente zender in een subcutane zak op de rug van het dier.
- Verwijder het lichaamshaar van de hoofdhuid en het voorbehandelen van de geschoren hoofdhuid met twee ontsmettingsmiddelen, dat wil zeggen, 70% ethanol en een jodium-gebaseerde scrub.
- Met behulp van een scalpel, makeneen middellijn incisie op de hoofdhuid van het voorhoofd naar de nucheal regio.
- Vanaf de nuchal insnijding stelt een subcutane zak aan één zijde van de rug van het dier door het uitvoeren van een stompe dissectie behulp chirurgische schaar of een chirurgische sonde.
- Plaats de zender in het subcutane zak en de overtollige lengte deponeren van de flexibele zender leidt naar de zak ook. Besteed extra aandacht aan het voorkomen van besmetting van de operatiewond en zender implantaat. Correct isoleren steriel door niet-steriele gebieden met gordijnen.
- Plaats het proefdier op de stereotaxische frame, bijvoorbeeld een geautomatiseerd 3D stereotaxische apparaat. Bevestig de schedel met behulp van een klem neus en oor bars.
- Voorbehandelen schedel met 0,3% H 2 O 2 verder weefsel uit de schedel verwijderd en de craniale hechtingen en craniometrics oriëntatiepunten, bregma en lambda verlichten.
- Boor de gaten op de coördinaten van de keuze(Zie stap 2.6) met behulp van een high-speed neurochirurgische boor in een druk-vrije modus bij maximale snelheid.
OPMERKING: Drukvrije boren voorkomt de plotselinge doorbraak van de boorkop en beschadiging van de cortex. Voor een craniotomie, is een neurochirurgische high-speed drill aanbevolen. Kies standaardanalysemodus-head diameters van 0,3-0,5 mm, afhankelijk van de elektrode diameter. - Selecteer zorgvuldig de elektrode, gezien de impedantie, diameter, coating, etc.
OPMERKING: Parylene bekleed wolfraam of roestvrij staal elektroden zijn de meest voorkomende. De types elektrode moet worden gekozen op basis van experimentele eisen. Als preventieve manoeuvre steriliseren elektrodetips vóór implantatie met behulp 70% ethanol. Merk op dat de elektrode coating niet toestaat warmtesterilisatie. - Voor intrahippocampale CA1 EEG-registraties, boor een gat stereotaxically op de volgende coördinaten: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (rechter hersenhelft); dorsoventral, 1,3 mm (target regio: cornu ammonis (CA1) piramidale laag). Voor de referentie-elektrode, boor een gat boven de cerebellaire cortex op de volgende stereotactische coördinaten: bregma, -6,2 mm, mediolateral, 0 mm; dorsoventral, 0 mm.
OPMERKING: De cerebellaire elektrode dient als pseudoreference elektrode, zoals het cerebellum is een vrij stille hersengebied. De stereotaxische coördinaten waren afkomstig van een standaard muis hersenen atlas. - Voorafgaand aan het inbrengen van de elektroden verkorten ze de gewenste lengte. Mechanisch knip de extracraniële deel van de elektrode aan de roestvrij stalen spiraal van de zender.
OPMERKING: solderen moet worden vermeden, aangezien deze aanzienlijke ruis introduceren in het systeem. - Bevestig de elektrode naar de verticale arm van het stereotaxische apparaat en plaats de elektrode volgens de bovengenoemde stereotaxische coördinaten.
- Bevestig de elektroden met behulp van glasionomeer cement en wacht tot het cement volledig is uitgehard.
- Sluit de hoofdhuidmet behulp van over-en-over hechtingen met niet-absorbeerbare 5-0 of 6-0 hechtmateriaal.
- Postoperatieve pijn, dienen carprofen (5 mg / kg, subcutaan, sc) eenmaal per dag gedurende 4 achtereenvolgende dagen na implantatie. Merk op dat carprofen moet vóór de initiële incisie (stap 2.2.2) worden geïnjecteerd.
- Laat de dieren om te herstellen voor 10 - 14 dagen na de implantatie voor de opnames en / of injectie experimenten worden gestart.
3. Spontane Opnamen van theta-oscillaties en farmacologische inductie
- Activeer de radiofrequentie zender met behulp van de magnetische schakelaar. Leg het dier met zijn kooi op de ontvanger plaat. Lange termijn op hippocampus EEG-registraties gedurende ten minste 24-48 uur.
LET OP: De analyse van de EEG amplitude en EEG de frequentie karakteristieken van de lange termijn opnames geeft gedetailleerd inzicht in de circadiane afhankelijkheid van theta-oscillaties en hun associatie met specifieke gedrags- encognitieve aandoeningen / taken. combineer altijd EEG-registraties met videobewaking van de proefdieren. - Voor farmacologische inductie van theta-oscillaties, toedienen van een enkele dosis van urethaan (800 mg / kg ip) of een enkele dosis van een muscarine receptoragonisten, zoals pilocarpine (10 mg / kg ip), arecoline (0,3 mg / kg ip) of oxotremorine (0,03 mg / kg ip). Voorbehandelen muizen met N-methylscopolamine (0,5 mg / kg ip) om perifere muscarinische reacties te vermijden. Vers lossen alle drugs in 0,9% NaCl of Ringer-oplossing.
OPMERKING: Hogere doseringen van muscarine receptor agonisten kan resulteren in beslag inductie bij proefdieren. Ook van mening dat de doseringen hier gegeven vertegenwoordigen mijlpalen dat voorafgaand dosis-effect studies in de muis lijn in onderzoek vereisen. Merk op dat urethaan is mutageen en kankerverwekkend is dat de nodige voorzorgsmaatregelen bij opslag en handling nodig. - Injecteer atropine (50 mg / kg, ip) te differentiëren atropine-gevoelige type IIvan atropine-ongevoelige type I theta-oscillaties.
LET OP: De atropine dosering is weer soort- en stam-afhankelijk en vereist evaluatie voorafgaande dosis-effect. Het optimale tijdstip van atropine injectie hangt de farmacodynamiek van muscarine receptoragonisten. Voor identificatie van het type II theta wordt atropine injectie aanbevolen 1 uur na toediening urethaan. - Probeer om de verdere toepassing van verschillende drugs te vermijden, zoals systemische toediening van geneesmiddelen wijzigt mondiale transcriptie en translatie patronen, die de daaropvolgende EEG-registraties te beïnvloeden. Merk op dat kortdurend theta-oscillaties kan ook worden geïnduceerd door zintuiglijke prikkels, zoals staart- of poot-knijpen.
- Extract / export representatieve EEG datasets van de voorfase (baseline) en de na-injectiefase van de totale EEG-registratie als ASCI of TXT bestanden, gelet op de farmacokinetiek van het toegediende geneesmiddelen en de eisen van de individuele onderzoeksprotocol.
4.Validatie van EEG Elektrodeplaatsing
- Euthanaseren dieren door deze in een incubatiekamer en introduceren 100% kooldioxide. Gebruik een vulsnelheid van 10-30% van het kamervolume per minuut met kooldioxide toegevoegd aan de bestaande lucht in de incubatiekamer; Dit zal resulteren in een snelle bewusteloosheid met minimale belasting van de dieren.
- Verwijder de muis uit de kamer een keer ademhalingsstilstand voordoet en een vervaagde oogkleur blijft voor 2-3 min.
- Snijd de roestvrijstalen elektroden en explantatie de radiofrequentie zender. Onthoofden de muis met een schaar of een guillotine en verwijder de hersenen van de neurocranium door zachte manipulatie met chirurgische schaar en pincet.
- Bevestig de hersenen in 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (pH 7,4) gedurende de nacht. Voor cryoprotection, breng de hersenen tot 30% glucose en bewaar ze bij 4 ° C tot verdere verwerking.
LET OP: Paraformaldehyde wordt als gevaarlijk beschouwd door de 2012 OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Neem de nodige voorzorgsmaatregelen: Persoonlijke beschermingsmiddelen gebruiken, zorgen voor passende ventilatie en vermijd stofvorming. Bovendien, verwijder ontstekingsbronnen en neem voorzorgsmaatregelen tegen statische ontladingen. Paraformaldehyde mag niet worden vrijgegeven in het milieu. - Monteer de uitgepakte hersenen op het weefsel houder van een cryostaat met behulp van een kleefstof en snijd de hersenen in 40-75 um coronale plakjes. Monteer de plakjes op glasplaatjes en vlekken op hen Nissl blauw met behulp van standaard histologische procedure; Deze procedure zal de branche kanaal dat de vorige elektrode positie weerspiegelt visualiseren. Merk op dat het ook mogelijk coronale plakjes van de hersenen met een natieve vibroslicer
- Nemen alleen de dieren die voldoen aan de juiste plaatsing van de elektroden EEG criteria; voor de regio CA1, moet het uiteinde van de diepe elektrode gelokaliseerd in het CA1 pyramidale laag.
- Record CA1 intrahippocampale EEGs met een geschikte sampling rate zonder a priori filter cut-off.
NB: De sampling rate, die zender-specifieke, bepaalt de bovengrens van de frequentie van de EEG analyse. - Verwerk de geregistreerde gegevens met analysesoftware. Programma tijd-frequentie analyses en berekeningen met op maat gemaakte procedures voor de adequate controle van analysemethoden (Figuur 5) 20.
- Snijd de EEG opgenomen in secties met een lengte van elk 1 uur. Gebruik snelle computer processors, omdat de rekentijd is hoog. Bovendien, gebruik maken van software die computers kunnen in parallel op meerdere kernels 20.
6. EEG Data Analysis
- Analyseer gegevenssegmenten met een complex Morlet wavelet om zowel de frequentie als de amplitude van de oscillaties te berekenen.
LET OP: Deze wavelet (bijvoorbeeld, Ψ (x) = (π b)(- 02/01) exp (2 i π c x) exp (-x 2 / b), waarbij b is de parameter bandbreedte, c het centrum frequentie, en i de denkbeeldige eenheid) is al vaak toegepast in de literatuur te studeren EEG data, zoals het garandeert optimale resolutie, zowel in frequentie en tijd 23, 24. - Gebruik een bandbreedte parameter en het centrum frequentie-instelling die in het bijzonder gewichten de frequentie resolutie om de frequentie verschillen op het 0,1-Hz niveau te onderscheiden, terwijl nog steeds niet voldoende tijdsresolutie verwaarlozen.
OPMERKING: neuronale processen in de gamma band zijn kortdurend 25, en dit kan ook opgaan voor theta ritmes. Zo moet de analytische benadering overwegen adequate tijdsresolutie. - Analyseer de EEG data in het frequentiegebied van 0,2-12 Hz, met een stapgrootte van 0,1 Hz, dus ook de typische delta, deta, en alfa frequentiebereiken.
- Opzetten van een geautomatiseerd, complexe analyse-instrument voor de uitwerking van de theta frequentie architectuur, die een standaard visuele inspectie van theta-oscillaties kan vervangen; Deze procedure wordt de theta detectiewerkwijze (TDM) genoemd.
- Bereken het quotiënt van de maximale amplitude in het frequentiegebied theta (3,5-8,5 Hz) en de maximale amplitude in het hogere frequentiebereik delta (2-3,4 Hz) tijdvensters voor elke 2,5 s.
OPMERKING: De waarde van het quotiënt dient als een maatregel om te bepalen of een theta oscillatie opgetreden. De definitie van de theta frequentiebereik kan variëren afhankelijk van de bedrijfstoestand en neuroanatomisch schakelingen / systeem worden geanalyseerd. - Classificeren een segment als een "theta oscillerende tijdperk," als de berekende verhouding in dit segment is dan 1,5.
Opmerking: Dit garandeert dat de maximale amplitude theta ten minste 50% hoger is dan de amplitude van de bovenste delta band tijdens de gerelateerde 2,5-s EEGsegment. Merk op dat de verhouding nodig aangepast afhankelijk van de lijn en / of soorten gebruikt. Een interval van 2,5 s vertegenwoordigt een minimale duur van een theta oscillatie voorkomt vals-positieve detecties van bepaalde luidruchtige tijdperken, en ligt binnen het bereik definities van andere publicaties, 19, 26. Het bovenste delta frequentiegebied dient als controle frequentieband omdat tijdens niet-theta tijdperken fysiologisch relevante delta activiteit weergegeven, bijvoorbeeld tijdens slow-wave sleep, die zeer tijdens theta activiteit getemperd. - Herhaal deze procedure voor elke sectie 1 uur; Daarom, elk deel bestaat uit 1.440 EEG segmenten met een lengte van elk 2,5 s.
- Statistisch evalueren van de gegevens van de geïdentificeerde theta oscillatie tijdperken.
- Bereken de statistieken van de totale duur tijden gedetecteerde theta tijdperken; onderscheiden of vooraf gedefinieerde groepen; cycli, zoals licht / donker; en andere parameters.
LET OP: StatiStokjes kan t-test, ANOVA, of MANOVA, afhankelijk van de variabele, het aantal groepen, de voorwaarden, etc. omvatten - Bereken de statistieken van de amplitude van het gedetecteerde theta tijdperken, maar alleen in de theta frequentiebereik (3,5-8,5 Hz).
- Evalueer de statistieken van de frequentie van de gedetecteerde theta tijdperken, maar alleen in de theta frequentiebereik (3,5-8,5 Hz).
OPMERKING: De theta frequentie van een theta tijdvak wordt gedefinieerd als de frequentie die behoren tot de maximale amplitude van een theta theta tijdperk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Theta activiteit kan worden opgenomen in een breed scala van het centrale zenuwstelsel (CNS) regio's. Hier presenteren we een analyse van theta-oscillaties van het murine hippocampus. Dergelijke oscillaties kunnen optreden tijdens verschillende gedrags- en cognitieve toestanden. Het wordt sterk aangeraden om theta-oscillaties zowel onder spontane lange termijn, taakgerichte op korte termijn, en farmacologisch geïnduceerde omstandigheden te analyseren.
Figuur 1 illustreert een representatief intrahippocampale CA1 opname onder controle omstandigheden. Als het dier niet in een spontane "theta staat," de intrahippocampale EEG wordt vaak gekenmerkt door grote onregelmatige-amplitude (LIA) activiteit. Toediening van muscarine receptoragonisten (bijv arecoline, pilocarpine of urethaan) resulteert in sterk georganiseerde theta-oscillaties die kunnen worden geblokkeerd door atropine (50 mg / kg, ip, figuur 1).
(Figuur 2). Op basis van deze classificatie is het mogelijk om de totale duur van theta-oscillaties onder spontane of specifieke gedrags- en cognitieve taken kwantificeren.
Teneinde een 30-min EEG segmenten ervan (als farmacologische urethaan / atropine theta dissectie), we eerst een tijd-frequentie-analyse uit te voeren voor een frequentiegebied van 0,2-12 Hz, waarbij de amplitude (mV) in een kleuren- weergegeven gecodeerde mode (Figuur 3 A). Zoals in Figuur 3 A duidelijk wordt, high-amplitude theta activiteit, die wordt bevestigd door visuele controle van de EEG (witte pijlen) wordt vergezeld van een lage amplitude in de delta frequentiebereik. Vervolgens wordt de maximale amplitudes van detheta (3,5-8,5 Hz) en delta (2-3,4 Hz) frequentiebereiken worden uitgezet (figuur 3 B). Systematische correlatie studies bleek dat de verhouding van de maximale amplitude theta delta maximum amplitude dan 1,5, wat aangeeft goed georganiseerde theta-oscillaties (figuur 3 C).
Figuur 4 laat zien hoe urethaan hippocampus theta-oscillaties kan induceren (witte cirkels in figuur 4 II). Urethaan is een multi-drug target dat type II theta kunnen leiden vanwege de agonistische werking op muscarine-receptoren. Na een injectie atropine (figuur 4 III), worden deze type II theta oscillaties (atropine-gevoelige theta oscillaties) afgeschaft. Het is belangrijk om te overwegen dat de muscarine receptoragonisten, naast atropine, hebben farmacokinetische eigenschappen dat de tijd kenmerken van theta voorkomen en theta blokkade beïnvloeden. Opgemerkt wordt dat atropine ongevoelige type I theta unaff blijftected door muscarine receptorantagonisten.
Een overzicht van de gehele theta detectie en kwantificering gereedschap is in Figuur 5. Het resulteert in de berekening van de amplitude, frequentie en som / gemiddelde theta duur. In tegenstelling tot eerder beschreven technieken, maakt gebruik van een wavelet-gebaseerde benadering met hoge precisie. De analyse-instrument hier beschreven heeft verschillende toepassingsgebieden. Theta-oscillaties worden gegenereerd in het septohippocampal systeem en worden vaak aangetast door neurodegeneratieve processen, bijvoorbeeld bij de ziekte van Alzheimer. Talrijke muismodellen van de ziekte van Alzheimer zijn beschreven die variëren in homologie isomorfisme en voorspelbaarheid. Sommige van deze modellen werd gemeld dat een vermindering theta activiteit vertonen, terwijl andere werden naar een toename theta activiteit geven, blijft de reden waarom te bepalen. Wij hebben met succes toegepast theta detectie tool hier beschreven karakteriseren veranderde theta oscillerende architectuur in de 5XFAD model van de ziekte van Alzheimer 8. Het kan echter ook worden toegepast bij epilepsie onderzoek en neuropsychiatrische aandoeningen.
Figuur 1: Theta oscillaties in C57BL / 6 muizen. Radiotelemetric intrahippocampale CA1 opnamen bij spontane voorwaarden (I) en na injectie urethaan (800 mg / kg, ip, II). Na injectie urethaan, goed georganiseerde theta-oscillaties zichtbaar, die kan worden geblokkeerd door atropine (50 mg / kg, ip). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie-20, met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een Wavelet-gebaseerde analyse van een Deep CA1 EEG Opnemen van een C57BL / 6 muis. (A en B) Twee-2,5 s tijdperken EEG zijn afgebeeld, visueel als niet-theta en theta segmenten, respectievelijk. (C en D) tijd-frequentieanalyse van het CA1 EEG segmenten getoond in A en B in het traject van 0,2-12 Hz, de amplitude kleurcode. De tijd-frequentieanalyse in C vertoont onregelmatige, fluctuerende theta architectuur over frequentie en tijd, terwijl een segment met zeer gesynchroniseerde theta oscillaties wordt gekenmerkt door een regelmatige, niet-fluctuerende hoge amplitude theta van een nagenoeg constante frequentie van 6 Hz. De verhouding van de maximale theta maximale delta amplitude 1,25 C en 4,67 in D, duidelijke indeling
Figuur 3: Een Wavelet-based Theta Detection Tool. (A) tijd-frequentieanalyse van een 30 min EEG segment (niet getoond) die is opgenomen na toediening urethaan. Het complex Morlet wavelet-gebaseerde analyse werd uitgevoerd in het gebied van 0,2-12 Hz, met de amplitude (mV) waarbij kleurcode. (B) Deze afbeelding toont de maximale amplitude van de theta frequentieband (3,5-8,5 Hz, groen) en de bovenste delta band (2-3,4 Hz, rood) voor de 30-min EEG segment. (C) Deze figuur toont de verhouding van de maximale amplitude theta(groen B) en de maximale amplitude delta (rood B). Merk op dat zeer gesynchroniseerde theta-oscillaties correleren met suprathreshold verhoudingen in C. Dit cijfer werd herdrukt uit Reference 20, met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Wavelet-gebaseerde analyse van farmacologisch geïnduceerde, goed georganiseerde theta-oscillaties. Representatieve 30-min EEG segmenten (niet getoond) worden geanalyseerd in het frequentiegebied van 0-12 Hz en de amplitude (mV) waarbij kleurcode. Een urethaan injectie met 800 mg / kg, ip, resulteerde in het ontstaan van gefragmenteerde goed georganiseerde theta-oscillaties met een overheersende frequentie van ongeveer 6 Hz (witte cirkels). Na een opropine injectie met 50 mg / kg, ip, worden deze theta-oscillaties opgeheven. Dit cijfer werd herdrukt uit Reference 20, met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Flow diagram dat de kwantificering van goed georganiseerde theta-oscillaties Geregistreerd van het Muizen CA1. Type II theta-oscillaties kunnen worden geanalyseerd met een controle opname (fase), een post-injectie (bijvoorbeeld, urethaan, arecoline of pilocarpine) fase en een post-atropine fase (A1). 30 min EEG segmenten (A2) van elke fase zijn time-frequentie in het bereik geanalyseerd 0,2-12 Hz met behulp van een wavelet-gebaseerde benadering (B1 en B2). Vervolgens theta Segment detectie wordt gestart (C1), het geven van een kijkje op de time-frequentie kenmerken van theta bereik (3,5-8,5 Hz, C2) en de bovenste delta bereik (2-3,4 Hz, C3) voor EEG tijdperken 2,5 s ieder die (C4 en C5). Vervolgens wordt de amplitude geanalyseerd via theta en delta frequentiebereik die de maximale waarden (C6 en C7). Indien de maximale amplitude van theta / delta dan 1,5, wordt de 2,5 s EEG segment aangemerkt als een periode van goed georganiseerde theta oscillatie (C8), met een bepaalde amplitude en frequentie (D1-D3). Deze theta detectieprogramma maakt de kwantificering van theta oscillatie architectuur (E1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Theta activiteit is van cruciaal belang bij systemische neurofysiologie. Het kan worden waargenomen in verschillende hersengebieden, met name in de hippocampus, waar het relateert aan gedrags- en cognitieve toestanden. Bovendien kan hippocampale theta farmacologisch worden onderscheiden in atropine-gevoelige type II en atropine-ongevoelige type I theta. Type I wordt gedacht gerelateerd te zijn aan beweging, zoals wandelen of hardlopen 27, 28, 29, 30, 31, terwijl type II in de melding-immobiliteit state 27, 28, 29, 30 kan worden waargenomen. Alert-immobiliteit toestanden kunnen worden veroorzaakt door onregelmatige en willekeurige toon of tactiele stimuli, bijvoorbeeld 32. Type II theta heeft ook betrekking op passive hele lichaam rotatie 14. Tijdens paradoxale slaap, zowel atropine-gevoelige en atropine resistente theta ritmes aanwezig zijn 33. De rust-immobiliteit toestand wordt gekenmerkt door grote onregelmatige activiteit (LIA) 27.
In het algemeen kan theta-oscillaties worden onder omstandigheden spontaan, maar ook na farmacologische inductie (bijvoorbeeld via de toepassing van muscarine receptoragonisten, zoals urethaan, pilocarpine, arecoline, oxotremorine, etc.). Merk op dat, farmacodynamisch, urethaan is een multi-drug target dat type II theta kan verbeteren maar remmen ook type I theta. Daarentegen pilocarpine, arecoline en oxotremorine selectief induceren type II theta. Afhankelijk van de farmacokinetiek van de muscarine agonisten gebruikt, duurt het een variabel bedrag van tijd totdat theta-oscillaties optreden. Type II kunnen effectief worden geblokkeerd door atropine. Kritisch, de dowijzen van muscarine agonisten en antagonisten te induceren en blok type II theta-oscillaties zijn soort- en stam-afhankelijk. Het is dus absoluut noodzakelijk dosis-effect studies uitgevoerd om de optimale dosis te ontrafelen voor de inductie van theta-oscillaties en hun blokkade voor een specifieke wetenschappelijke vraag. Kortdurend theta-oscillaties kan ook worden geïnduceerd door zintuiglijke prikkels, zoals staart- of poot-knijpen.
Er zijn verschillende benaderingen van theta-activiteit te karakteriseren in het algemeen. -FFT gebaseerde benaderingen, wat resulteert in continue of discontinue (frequentieband-gerelateerde) vermogensspectrum dichtheid (PSD) analyse / percelen of in een power-analyse voor de individuele frequentiebanden, zijn standaard benaderingen die waardevolle informatie over de frequentie eigenschappen.
Echter, om een complexere inzicht theta nastreefde aanvullende aanpak lijkt noodzakelijk. Met name zou men geïnteresseerd in de verschillende orgaansystemen zijnizational staten theta en de frequentie daarvan, die niet direct en nauwkeurig door de voornoemde procedures worden beoordeeld. Daarentegen zijn de nieuwe analytische techniek hier voorgestelde wavelet-gebaseerde en in staat evalueren goed georganiseerde, kort theta-oscillaties. Ze komen niet overeen met standaard theta macht, die ook van mening is paroxysmale, discontinue theta-activiteit. De focus ligt op specifieke tijd-frequentie-eigenschappen te wekken in de EEG data die typisch zijn voor theta tijdperken zijn. Zo is de nieuwe methode voorkomt vals-positieve classificaties van theta tijdperken. De geautomatiseerde procedure staat garant voor de evaluatie van de langdurige EEG data sets en bevat daarom betrouwbare statistische vergelijkingen van fysiologische cycli (licht / donker-cyclus of circadiane ritmiek) tijdens langdurige studies.
Dit protocol is van bijzonder belang bij de analyse van EEG gegevens verkregen van dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekten, met name in het kenmersatie van goed georganiseerde theta architectuur in de septohippocampal en andere neurale systemen. Complex en hoge precisie-theta-analyse zou kunnen helpen om EEG vingerafdrukken die als EEG biomarkers in de toekomst kan dienen te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 407-418 (1969).
- Kahana, M. J., Seelig, D., Madsen, J. R.
- Varga, V., et al. The presence of pacemaker HCN channels identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol. 586, 3893-3915 (2008).
- Takano, Y., Hanada, Y. The driving system for hippocampal theta in the brainstem: an examination by single neuron recording in urethane-anesthetized rats. Neurosci Lett. 455, 65-69 (2009).
- Goutagny, R., Manseau, F., Jackson, J., Danik, M., Williams, S. In vitro activation of the medial septum-diagonal band complex generates atropine-sensitive and atropine-resistant hippocampal theta rhythm: an investigation using a complete septohippocampal preparation. Hippocampus. 18, 531-535 (2008).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28, 4096-4107 (2008).
- Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29, 8094-8102 (2009).
- Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plast. 2015, 781731 (2015).
- Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33, 325-340 (2002).
- Buzsaki, G., et al. Hippocampal network patterns of activity in the mouse. Neuroscience. 116, 201-211 (2003).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nat Neurosci. 16, 130-138 (2013).
- Shin, J.
- Shin, J., et al. Phospholipase C beta 4 in the medial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors. J Neurosci. 29, 15375-15385 (2009).
- Shin, J., Kim, D., Bianchi, R., Wong, R. K., Shin, H. S. Genetic dissection of theta rhythm heterogeneity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18165-18170 (2005).
- Brown, D. A., Adams, P. R. Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current in a vertebrate neurone. Nature. 283, 673-676 (1980).
- Senkov, O., Mironov, A., Dityatev, A. A novel versatile hybrid infusion-multielectrode recording (HIME) system for acute drug delivery and multisite acquisition of neuronal activity in freely moving mice. Front Neurosci. 9, 425 (2015).
- Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plast. 2016, 8213878 (2016).
- Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), (2016).
- Csicsvari, J., Hirase, H., Czurko, A., Buzsaki, G. Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron. 21, 179-189 (1998).
- Muller, R., et al. Atropine-sensitive hippocampal theta oscillations are mediated by Cav2.3 R-type Ca2+ channels. Neuroscience. 205, 125-139 (2012).
- Klausberger, T., et al. Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in vivo. Nature. 421, 844-848 (2003).
- Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
- Montgomery, S. M., Buzsaki, G. Gamma oscillations dynamically couple hippocampal CA3 and CA1 regions during memory task performance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14495-14500 (2007).
- Kronland-Martinet, R., Morlet, J., Grossman, A. Analysis of sound patterns through wavelet transform. Int J Pattern Recognit Artif Intell. 1, 29 (1987).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12, 1491-1493 (2009).
- Bland, B. H. The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms. Prog Neurobiol. 26, 1-54 (1986).
- Leung, L. S. Generation of theta and gamma rhythms in the hippocampus. Neurosci Biobehav Rev. 22, 275-290 (1998).
- Shin, J., Talnov, A. A single trial analysis of hippocampal theta frequency during nonsteady wheel running in rats. Brain Res. 897, 217-221 (2001).
- Shin, J. A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis. Biosystems. 67, 245-257 (2002).
- Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital. Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).
- Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).
- Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior. Brain Res. 124, 544-549 (1977).
