Abstract
Theta activité est générée dans le système septohippocampique et peut être enregistré en utilisant des électrodes intrahippocampique profondes et électroencéphalographie implantable (EEG) radiotélémétriques ou système d'attache des approches. Pharmacologiquement, hippocampique thêta est hétérogène (voir la théorie dualiste) et peuvent être différenciées en type I et de type II thêta. Ces sous-types EEG individuels sont liés aux états cognitifs et comportementaux spécifiques, tels que l'excitation, l'exploration, l'apprentissage et la mémoire, les fonctions d'intégration plus élevés, etc. Dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la structure et des altérations fonctionnelles du système septohippocampique peut entraîner une activité thêta avec facultés affaiblies / oscillations. Une analyse quantitative standard de l'EEG hippocampique comprend une rapide transformation de Fourier (FFT) à base de l'analyse de fréquence. Toutefois, cette procédure ne fournit pas de détails sur l'activité thêta en oscillations générales et hautement organisés thêta en particulier. Afin d'obtenir detainformations iLED sur les oscillations thêta hautement organisées dans l'hippocampe, nous avons développé une nouvelle approche analytique. Cette approche permet la quantification de temps et de coût-efficacité de la durée des oscillations thêta fortement organisées et leurs caractéristiques de fréquence.
Introduction
Theta activité dans le cerveau est liée à différents états cognitifs et fonctionnels, y compris l' éveil, l' attention, le mouvement volontaire, comportement exploratoire, le comportement de l' attention, l' apprentissage et la mémoire, l' intégration somatosensoriel, et des mouvements oculaires rapides (REM) dormir 1, 2. Principalement, l'activité thêta comme une entité rythmique peut être produite dans différentes régions cérébrales et est hautement organisée et synchronisée comme thêta oscillations. Ci - dessous, nous allons nous concentrer sur l'analyse et la quantification de l' activité thêta / oscillations qui sont générés dans le système septohippocampique 3, 4. Dans le septum, GABAergique, glutamatergiques, et les neurones cholinergiques projet à l'hippocampe et de contribuer à l'initiation et le maintien du thêta comportement oscillatoire. Il y a une discussion en cours sur l' opportunité oscillations hippocampique thêta sont initiées dans le septum, à savoir, 5, 6, 7.
Quelle que soit leur origine, les oscillations thêta hippocampique ont été au centre d'intérêt pendant des années, en particulier dans les modèles de souris transgéniques. Ces modèles permettent l'implantation d'électrodes EEG profondes et pour l'enregistrement des oscillations thêta hippocampique sous tâches cognitives et comportementales spécifiques 8. oscillations thêta hippocampique sont hétérogènes dans la nature. Basé sur la théorie dite dualiste de thêta oscillations, on peut différencier les atropine-sensibles de type II thêta et atropine insensible type I thêta 9, 10, 11. Ce dernier peut généralement être induite par M muscariniques 1 / M par exemple, l' arécoline, pilocarpine et uréthane. Cependant, l'uréthane est un médicament multi-cibles qui, en plus de l'activation muscariniques, exerce également des effets complexes sur les autres entités du canal ionique. Pour le type II thêta, la voie muscariniques comprend l'activation de M 1 / M 3 et Gq / 11 (Ga) d'activation de la phospholipase C médiée β 04.01 (04.01 PLCβ), inositol trisphosphate ultérieure (InsP 3) , diacylglycerole (DAG), le Ca 2+, et la protéine kinase C (PKC). Le rôle de PLCβ 1 et PLCβ 4 thetagenesis a été validée dans des études de knock-out en utilisant PLCβ1 - / - et PLCβ4 - / - souris présentant une perte complète ou une atténuation significative de thêta oscillation 12, 13, 14. M additionnel 1, M 3 et M 5 cibles en aval (channels / courants) de la cascade de signalisation muscariniques comprennent divers conductances, tels que M-Type K + canal (K M) par l' intermédiaire dépendant de la tension K + canal (K v 7); lent après hyperpolarisation canal K + (Ks AHP); fuite canal K + (K fuite), probablement via TWIK-lié canal K + sensible à l' acide (TASK1 / 3); courant de cations (I CAT), probablement via le canal de fuite Na + (NALCN); et je h via hyperpolarisation et nucléotidiques gated canaux cycliques (HCN). En outre, les récepteurs M 2 / M 4 acétylcholine (CCRS) ont été signalés à interférer avec redresseur entrant K + canal 3.1 (K ir 3.1) et vers l' intérieur redresseur K + canal 3.2 (K ir 3.2) 15.
Actuellement, le logiciel d' analyse disponible dans le commerce permet rapide analyse de fréquence FFT, par exemple, l' analyse de la puissance (P, mV 2)ou une densité spectrale de puissance (PSD 2 mV / Hz). Puissance ou de la densité spectrale de puissance (PSD) analyse de la gamme de fréquences thêta ne donne un aperçu global de son activité. Toutefois, afin d'obtenir un aperçu détaillé de l'activité thêta cognitif et lié le comportement, l'analyse des oscillations thêta hautement organisés est obligatoire. L'évaluation des oscillations thêta hautement organisés est d'une importance capitale dans le domaine des maladies neurodégénératives et neuropsychiatriques. La plupart des études sur les maladies expérimentales sont réalisées dans des modèles de souris transgéniques en utilisant des approches neurochirurgicales hautement sophistiqués pour enregistrer surface péridurale et EEGs intracérébrales profondes. Ces techniques comprennent les deux systèmes d'attache 16 et les configurations radiotélémétrique 17, 18. oscillations thêta peuvent être enregistrées comme des oscillations thêta spontanées et liés au comportement dans des conditions d'enregistrement à long terme. En outre, thêta oscillations peuvent être recorded après induction pharmacologique, mais aussi suite à l'exposition des animaux à des tâches comportementales ou cognitives ou aux stimuli sensoriels, tels que la queue de pincement.
Les premières approches pour caractériser thêta oscillations ont été décrites par Csicsvari et al. 19. Les auteurs ont conçu un outil semi-automatisé pour l'analyse de thêta à court terme (15 - 50 min) qui ne convient pas pour les enregistrements EEG de longue date. Notre méthode, décrite ici, permet l'analyse à long terme de l' enregistrement EEG> 48 h 20. Csicsvari et al. 10 également fait référence au rapport thêta-delta, mais pas de seuil pour la détermination des oscillations thêta hautement organisés est fourni. Les définitions de la gamme delta et thêta correspondent à nos définitions de la gamme de fréquence. Comme il est pas explicitement mentionné, nous présumons qu'une méthode FFT est utilisée par Csicsvari et al. pour calculer la puissance des bandes de fréquences thêta-delta. Ceà nouveau se distingue nettement de notre procédé, étant donné que l'on calcule les amplitudes en ondelettes sur un grand nombre d'échelles de fréquence (Δ étapes (f) = 0,05 Hz), ce qui entraîne une précision beaucoup plus élevée. La durée de la période d'EEG individuellement analysées est similaire à notre définition.
Klausberger et al. 21 font également l' utilisation de rapports de thêta-delta pour l'analyse des enregistrements EEG à long terme. Cependant, il y a trois différences majeures par rapport à notre approche: i) la durée de l' époque EEG est beaucoup plus longue, à savoir, au moins 6 s; ii) le rapport thêta-delta est réglé sur 4, ce qui est beaucoup plus élevé que notre seuil, et est lié à des définitions différentes de la gamme de fréquences; et iii) la définition de puissance est susceptible d'être basée sur une approche FFT, qui manque de précision, en particulier pour les très courtes fenêtres de temps (2 s, à savoir, 5 cycles pour oscillations avec une fréquence de 2,5 Hz). Dans un tel cas, une procédure par ondelettes est plus recommandable.Une étude menée par Caplan et al. 22 uniquement calculée puissance thêta , tout en ignorant le rapport de puissance delta thêta. Ainsi, l'approche Caplan 22 ne peut pas différencier entre les processus thêta riches cognitifs accompagnés d'un delta élevé ou faible.
Dans le protocole suivant, nous présenterons notre approche basée sur les ondelettes analytiques pour analyser de manière fiable oscillations thêta hautement organisées en enregistrements EEG hippocampiques de souris. Étant donné que cette procédure fonctionne automatiquement, il peut être appliqué à de grands ensembles de données et les mesures EEG à long terme.
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Protocol
Tout l'expérimentation animale a été réalisée selon les directives du Conseil local et institutionnel de protection des animaux (Université de Bonn, BfArM, LANUV, Allemagne). En outre, toute expérimentation animale a été réalisée conformément à la législation supérieure, par exemple, des Communautés européennes Directive du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609 / CEE), ou de la législation régionale ou nationale individuelle. effort particulier a été fait pour réduire au minimum le nombre d'animaux utilisés, ainsi que leurs souffrances.
1. animaux Logement et EEG Conditions d'enregistrement
- souris Maison à filtre-top cages ou utilisent des cages individuellement ventilées.
- Transfert des souris de l'installation de l'animal à des armoires ventilées dans des salles spéciales de laboratoire qui sont appropriés pour les animaux implantés et les enregistrements télémétriques.
- Effectuer toute expérimentation animale, y compris électrode EEG implantation et les enregistrements suivants, dans des conditions normalisées (22 ° C temtempérature, cycle de 12 h / 12 h de lumière-obscurité, 50-60% d' humidité relative, l' atténuation du bruit, etc.) 18.
- Avant émetteur radiofréquence implantation, les animaux de maison en groupes de 3 - 4 en clair de type II cages en polycarbonate, avec de la nourriture et de l' eau ad libitum. Ne pas isoler les souris individuelles, car cela peut causer du stress et interférer avec l'expérimentation et les résultats ultérieurs.
- Ne pas utiliser des conditions d'ouverture de logement, mais utiliser des armoires ventilées à la place lors de l'expérimentation et l'enregistrement.
2. radiotélémétrique EEG Electrode Implantation et EEG Recordings
- Anesthetize les souris en utilisant des narcotiques d'injection, par exemple, ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, par voie intrapéritonéale, ip) ou de stupéfiants par inhalation, par exemple, isoflurane 17, 18.
- Pour narcose isoflurane, positionner la souris dans une induction chambre avec 4-5% d' isoflurane et de 0,8 à 1% d' oxygène ou de carbogène (5% de CO 2 et 95% O 2).
- Placer un masque de silicium sur le nez / bouche de l'animal pour contrôler la profondeur de l'anesthésie désirée et éviter l'exposition à l'isoflurane expérimentateur en utilisant un système de balayage.
- Utiliser des anesthésiques injectables, par exemple, esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) et xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), si l' anesthésie par inhalation ne sont pas disponibles.
- Surveiller la profondeur de l'anesthésie en vérifiant le pincement réflexe de la queue, les pieds pincement réflexe, et le taux de respiration. Notez que la respiration artificielle par intubation trachéale est pas nécessaire chez les souris.
- Implanter l'émetteur radiofréquence dans une poche sous - cutanée sur le dos de l'animal.
- Enlever les poils du cuir chevelu et prétraiter le cuir chevelu rasé avec deux désinfectants, soit 70% d' éthanol et d' un gommage à base d' iode.
- L'utilisation d'un scalpel, faireune incision médiane sur le cuir chevelu du front à la région nucheal.
- A partir de l'incision nucale, préparer une poche sous-cutanée d'un côté du dos de l'animal en effectuant une dissection en utilisant des ciseaux chirurgicaux ou une sonde chirurgicale.
- Insérez l'émetteur dans la poche sous-cutanée et déposer l'excès de longueur de l'émetteur souple conduit dans la poche ainsi. Portez une attention particulière à la prévention de la contamination du site chirurgical et l'implant de l'émetteur. Bien isoler stérile des zones non-stériles en utilisant des rideaux.
- Placez l'animal expérimental sur le cadre stéréotaxique, par exemple, un dispositif stéréotaxique 3D informatisé. Fixer le crâne à l'aide d'une pince de nez et barres d'oreilles.
- Prétraiter le crâne avec 0,3% de H 2 O 2 pour enlever les tissus plus loin du crâne et pour éclairer les sutures crâniennes et craniometrics points de repère, bregma et lambda.
- Les trous de forage aux coordonnées de choix(Voir étape 2.6) à l'aide d'une perceuse neurochirurgicale à grande vitesse dans un mode sans pression à la vitesse maximale.
REMARQUE: perçage sans pression évite la percée soudaine de la tête de forage et des dommages au cortex. Pour une craniotomie, une perceuse à haute vitesse neurochirurgicale est recommandé. Choisir des diamètres standards tête de forage de 0,3 - 0,5 mm, selon le diamètre de l'électrode. - Sélectionnez soigneusement le type d'électrode, compte tenu de l'impédance, le diamètre, revêtement, etc.
NOTE: tungstène Parylène revêtu ou en acier inoxydable électrodes sont les plus courantes. Les types d'électrodes doivent être choisis en fonction des exigences expérimentales. Comme une manoeuvre préventive, stériliser pointes d'électrodes avant l'implantation en utilisant 70% d'éthanol. A noter que le revêtement d'électrode ne permet pas la stérilisation à la chaleur. - Pour intrahippocampique enregistrements EEG CA1, percer un trou stéréotaxique aux coordonnées suivantes: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (hémisphère droit); dorso-ventral, 1,3 mm (target région: corne d'Ammon (CA1) couche pyramidale). Pour l'électrode de référence, percer un trou au-dessus du cortex cérébelleux aux coordonnées stéréotaxiques suivantes: bregma, -6.2 mm, mediolateral, 0 mm; dorso-ventral, 0 mm.
NOTE: L'électrode cérébelleuse sert d'électrode de pseudoreference, le cervelet est une région du cerveau plutôt silencieux. Les coordonnées stéréotaxiques ont été calculées à partir d'un atlas du cerveau de souris standard. - Avant l'insertion des électrodes, à les raccourcir la longueur requise. fixer mécaniquement la partie extracrânienne de l'électrode à l'hélice de l'émetteur en acier inoxydable.
REMARQUE: Soudage doit être évitée, car cela peut introduire un bruit considérable dans le système. - Fixer l'électrode à la branche verticale du dispositif de stéréotaxie, et insérer l'électrode selon les coordonnées stéréotaxiques ci-dessus.
- Fixer les électrodes en utilisant le verre ionomère et attendre jusqu'à ce que le ciment a complètement durci.
- Fermez le cuir cheveluen utilisant plus-et-plus de sutures avec des non-absorbable 5-0 ou 6-0 matériel de suture.
- Pour la gestion de la douleur postopératoire, administrer carprofène (5 mg / kg, par voie sous-cutanée) une fois par jour pendant 4 jours consécutifs après l'implantation. Notez que carprofène doit être injecté avant l'incision initiale (étape 2.2.2).
- Permettre aux animaux de récupérer pendant 10 - 14 jours post-implantation avant les enregistrements et / ou des expériences d'injection sont démarrés.
3. Les enregistrements spontanés de Theta Oscillations et Pharmacological Induction
- Activez l'émetteur radiofréquence en utilisant le commutateur magnétique. Placer l'animal avec sa cage sur la plaque réceptrice. Effectuer des enregistrements EEG hippocampique à long terme pendant au moins 24-48 h.
NOTE: L'analyse de l'EEG amplitude et des caractéristiques de fréquence EEG d'enregistrements à long terme fournit un aperçu détaillé de la dépendance circadien des oscillations thêta et leur association avec des comportements et spécifiquescognitifs conditions / tâches. Toujours combiner les enregistrements EEG avec une surveillance vidéo des animaux de laboratoire. - Pour l'induction pharmacologique de thêta oscillations, administrer une dose unique d'uréthane (800 mg / kg par voie intrapéritonéale) ou d'une dose unique d'un muscariniques agonistes des récepteurs, par exemple la pilocarpine (10 mg / kg ip) arécoline (0,3 mg / kg par voie intrapéritonéale) ou oxotrémorine (0,03 mg / kg par voie intrapéritonéale). Prétraitez souris avec N-méthyl-scopolamine (0,5 mg / kg ip) pour éviter des réactions muscariniques périphériques. Fraîchement dissoudre tous les médicaments dans 0,9% de solution de NaCl ou Ringer.
NOTE: des doses plus élevées d'agonistes des récepteurs muscariniques pourraient entraîner la saisie induction des animaux de laboratoire. Voir également que les doses indiquées ici représentent des repères qui nécessitent des études dose-effet avant dans la ligne de la souris à l'étude. Notez que l'uréthane est un mutagène et cancérigène qui nécessite des précautions appropriées dans le stockage et la manutention. - Injecter atropine (50 mg / kg, ip) pour différencier atropine-sensible de type IIde type atropine insensible I theta oscillations.
NOTE: La dose d'atropine est à nouveau l'espèce et la souche-dépendante et nécessite une évaluation préalable dose-effet. Le moment optimal de l'injection d'atropine dépend de la pharmacodynamie des agonistes des récepteurs muscariniques. Pour l'identification de type II thêta, l'injection d'atropine est recommandé 1 h après administration d'uréthane. - Essayez d'éviter l'application ultérieure de plusieurs médicaments, comme l'administration systémique de la drogue modifie les modes de transcription et de traduction globaux qui influent sur les enregistrements EEG ultérieurs. Notez que de courte durée thêta oscillations peut aussi être induite par des stimuli sensoriels, tels que ou paw-coffre à bagages pincement.
- Extrait / séries de données représentatives à l'exportation EEG de la pré-phase (ligne de base) et la phase post-injection de l'enregistrement total EEG sous forme de fichiers ASCI ou TXT, compte tenu de la pharmacocinétique des médicaments appliqués et les exigences du protocole de l'étude individuelle.
4.Validation de l'EEG Placement des électrodes
- Euthanize animaux en les plaçant dans une chambre d'incubation et d'introduire 100% de dioxyde de carbone. Utiliser un taux de 10 à 30% du volume de la chambre par minute avec du dioxyde ajoutée à l'air existant dans la chambre d'incubation de carbone de remplissage; cela se traduira par une perte de conscience rapide avec un minimum de stress aux animaux.
- Retirez la souris de la chambre une fois arrêt respiratoire et la couleur des yeux fanée persiste pendant 2-3 min.
- Couper les électrodes en acier inoxydable et explantation l'émetteur radiofréquence. Décapitez la souris à l'aide de ciseaux ou d'une guillotine et retirer le cerveau du neurocrâne par manipulation douce avec des ciseaux et des pinces chirurgicales.
- Fixer les cerveaux dans 4% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4) pendant une nuit. Pour cryoprotection, transférer le cerveau à 30% de glucose et de les stocker à 4 ° C jusqu'à ce que le traitement ultérieur.
NOTE: Le paraformaldéhyde est considéré comme dangereux par l'OSHA 2012 Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Prenez les précautions nécessaires: utiliser un équipement de protection individuelle, d'assurer une ventilation adéquate, et d'éviter la formation de poussière. En outre, éliminer les sources d'ignition et de prendre des mesures de précaution contre les décharges statiques. Paraformaldéhyde ne doit pas être libéré dans l'environnement. - Monter le cerveau extrait sur le support de tissu d'un cryostat au moyen d'un adhésif, et couper le cerveau en 40 - 75 um tranches coronales. Monter les tranches sur des lames de verre et de les colorer avec Nissl bleu en utilisant la procédure histologique standard; cette procédure visualiser le canal de dérivation qui reflète la position de l'électrode précédente. On notera qu'il est également possible de découper des tranches coronales du cerveau natif à l'aide d'un vibroslicer
- Incorporer uniquement les animaux qui répondent aux critères EEG corrects de placement d'électrode; pour la région CA1, la pointe de l'électrode profonde doit être localisée à l'intérieur de la couche CA1 pyramidale.
- Enregistrement CA1 de EEGs intrahippocampique avec un taux d'échantillonnage approprié, a priori, aucune coupure du filtre.
NOTE: Le taux d'échantillonnage, qui est spécifique à l'émetteur, détermine la limite de fréquence supérieure de l'analyse de l'EEG. - Traiter les données enregistrées avec un logiciel d'analyse. Analyses Programme temps-fréquence et des calculs avec des procédures sur mesure pour le contrôle adéquat des méthodes d'analyse (figure 5) 20.
- Couper l'EEG enregistré en sections d'une longueur de 1 h chacun. Utilisez des processeurs informatiques rapides, puisque le temps de calcul est élevé. En outre, utiliser un logiciel qui peut paralléliser informatique sur plusieurs noyaux 20.
6. Analyse des données EEG
- Analyser les segments de données en utilisant un complexe Morlet ondelettes pour calculer la fréquence et l'amplitude des oscillations.
NOTE: Ce ondelettes (par exemple, Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 i π c x) exp (-x 2 / b), où b est le paramètre de largeur de bande, c la fréquence centrale, et i l'unité imaginaire) a souvent été appliquée dans la littérature pour étudier EEG données, car elle garantit une résolution optimale de la fréquence et le temps 23, 24. - Utilisez un réglage de la fréquence des paramètres de bande passante et le centre qui en particulier les poids de la résolution de fréquence de distinguer les différences de fréquence au niveau de 0,1 Hz, tout en ne négligeant pas une résolution temporelle suffisante.
REMARQUE: les processus neuronaux dans la bande gamma sont de courte durée 25, et cela peut aussi être vrai pour thêta rythmes. Ainsi, l'approche analytique doit tenir compte de la résolution temporelle adéquate. - Analyser les données EEG dans la plage de fréquences de 0,2 à 12 Hz, avec une taille de pas de 0,1 Hz, incluant donc le delta typique, leta, et la fréquence alpha gammes.
- Mettre en place, un outil d'analyse complexe automatisé pour l'élaboration de l'architecture de fréquence thêta, qui peut remplacer une inspection visuelle standard thêta oscillations; Cette procédure est appelée la méthode de détection de thêta (TDM).
- Calculer le quotient de l'amplitude maximale dans la plage de fréquences de thêta (3,5 à 8,5 Hz) et l'amplitude maximale dans la plage de fréquence delta supérieure (2 à 3,4 Hz) pour les fenêtres de temps de 2,5 s chacune.
NOTE: La valeur de ce quotient sert de mesure de décider si une oscillation thêta est survenue. La définition de la gamme de fréquences thêta peut varier en fonction de l'état et neuroanatomique circuit / système fonctionnel à analyser. - Classez un segment comme une «époque oscillatoire thêta," si le rapport calculé au cours de ce segment est supérieur à 1,5.
NOTE: Ceci garantit que l'amplitude de thêta maximale est d'au moins 50% de plus que l'amplitude dans la bande delta supérieure au cours de la connexes de 2,5 s EEGsegment. Notez que le rapport pourrait avoir besoin d'adaptation en fonction de la ligne et / ou des espèces utilisées. Un intervalle de 2,5 s représente une durée minimale pour une oscillation thêta, empêche les détections faussement positives de certaines époques bruyantes, et se trouve dans les définitions de la gamme d'autres publications 19, 26. La gamme de fréquence delta supérieure sert de bande de fréquence de contrôle parce que l'activité delta physiologiquement pertinente apparaît au cours des époques non-thêta, par exemple, pendant le sommeil lent, qui est fortement atténué pendant l'activité thêta. - Répétez cette procédure pour chaque section 1 h; par conséquent, chaque section se compose de 1.440 segments EEG avec des longueurs de 2,5 s chacun.
- évaluer statistiquement les données des thêta époques d'oscillation identifiés.
- Calculer les statistiques des durées totales de durée de détectés thêta époques; groupes distincts ou prédéfinis; cycles, tels que la lumière / obscurité; et d'autres paramètres.
NOTE: Statistics peut inclure le test t, ANOVA, ou MANOVA, en fonction de la variable, le nombre de groupes, les conditions, etc. - Calculer les statistiques de l'amplitude des époques thêta détectés, mais seulement dans la gamme de fréquences de thêta (03/05 à 08/05 Hz).
- Évaluer la statistique de la fréquence des époques thêta détectés, mais seulement dans la gamme de fréquences de thêta (03.05 à 08.05 Hz).
REMARQUE: La fréquence thêta d'une époque thêta est définie comme étant la fréquence appartenant à l'amplitude maximale thêta d'une époque thêta.
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Representative Results
Theta activité peut être enregistrée dans une large gamme de système nerveux central (SNC) régions. Ici, nous présentons une analyse des oscillations thêta de l'hippocampe de souris. Ces oscillations peuvent se produire pendant les différents états comportementaux et cognitifs. Il est fortement recommandé d'analyser thêta oscillations dans les deux à long terme, à court terme liées à la tâche, et les conditions spontanées pharmacologiquement induites.
La figure 1 montre un enregistrement représentatif intrahippocampique CA1 dans des conditions de contrôle. Si l'animal n'a pas spontanée "état thêta," l'EEG intrahippocampique est souvent caractérisée par un grand-irrégulier-amplitude (LIA) l'activité. Administration d'agonistes des récepteurs muscariniques (par exemple, l' arécoline, la pilocarpine, ou uréthane) se traduit par des oscillations thêta hautement organisées qui peuvent être bloqués par l' atropine (50 mg / kg, ip, figure 1).
(Figure 2). Sur la base de cette classification, il est possible de quantifier la durée totale des oscillations dans des conditions thêta spontanées ou tâches cognitives et comportementales spécifiques.
Afin d'analyser un segment d'EEG 30 min (comme pour l'uréthane pharmacologique / atropine dissection thêta), on effectue d'abord une analyse temps-fréquence pour une plage de fréquences de 0,2 à 12 Hz, ce qui indique l'amplitude (mV) dans un couleur- mode codé (Figure 3 A). Comme devient évident à la figure 3 A, activité thêta à haute amplitude, ce qui est confirmé par une inspection visuelle de l'EEG (flèches blanches), est accompagnée d'une faible amplitude dans la gamme de fréquence delta. Ensuite, les amplitudes maximales de lathêta (de 3,5 à 8,5 Hz) et delta (2 à 3,4 Hz) plages de fréquences sont représentées graphiquement (figure 3 B). Des études systématiques ont révélé de corrélation que le rapport de l' amplitude maximale thêta à l' amplitude du delta maximale supérieure à 1,5, ce qui indique des oscillations thêta hautement organisées (figure 3 C).
La figure 4 montre comment l' uréthane peut induire des oscillations thêta hippocampique (cercles blancs sur la figure 4 II). Uréthane est un médicament multi-cible qui peut déclencher le type II thêta en raison de son action agoniste sur les récepteurs muscariniques. Après une injection d'atropine (Figure 4 III), ces oscillations de type II thêta (oscillations thêta atropine sensibles) sont supprimés. Il est important de considérer que les agonistes des récepteurs muscariniques, en plus de l'atropine, ont des propriétés pharmacocinétiques individuelles qui influent sur les caractéristiques de temps d'occurrence de thêta et thêta blocus. Il convient de noter que le type I thêta atropine reste insensible unaffecté par des antagonistes des récepteurs muscariniques.
Un résumé de l'outil de détection de thêta et de la quantification entière est représentée sur la figure 5. Il en résulte dans le calcul de l'amplitude, la fréquence et la somme / moyenne thêta durée. Contrairement aux techniques précédemment décrites, on fait appel à une approche basée sur des ondelettes avec une grande précision. L'outil d'analyse décrit ici a plusieurs domaines d'application. Thêta oscillations sont générées dans le système septohippocampique et sont souvent altérées par des processus neurodégénératifs, par exemple dans la maladie d'Alzheimer. De nombreux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer ont été décrits, qui varient en homologie isomorphisme, et la prévisibilité. Certains de ces modèles ont été signalés pour présenter une réduction de l'activité thêta, tandis que d'autres se sont avérés afficher une augmentation de l'activité thêta, la raison pour laquelle reste à déterminer. Nous avons appliqué avec succès le thêta détection tool décrit ici pour caractériser une architecture altérée thêta oscillatoire dans le modèle 5XFAD de la maladie d'Alzheimer 8. Cependant, il pourrait également être appliquée dans la recherche de l'épilepsie et des maladies neuropsychiatriques.
Figure 1: Theta Oscillations dans C57BL / 6. Radiotélémétrique enregistrement CA1 intrahippocampique dans des conditions spontanées (I) et l'injection d'uréthane suivant (800 mg / kg, ip, II). Suite à l'injection d'uréthane, des oscillations thêta hautement organisées deviennent visibles, qui peuvent être bloquées par l'atropine (50 mg / kg, ip). Ce chiffre a été modifié par la référence 20, avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: une analyse basée sur Wavelet d'un profond CA1 EEG Enregistrement à partir d' une souris C57BL / 6. (A et B) Deux époques EEG 2,5 s-sont représentés visuellement classés comme non-theta et thêta segments, respectivement. (C et D) l' analyse temps-fréquence des segments affichés dans CA1 EEG A et B dans l'intervalle de 0,2 à 12 Hz, avec l'amplitude étant codés par couleur. L'analyse temps-fréquence en C irrégulière présente une architecture thêta fluctuant en ce qui concerne la fréquence et du temps, alors qu'un segment ayant des oscillations thêta hautement synchronisé se caractérise par une base régulière, non fluctuant de grande amplitude thêta d'une fréquence à peu près constante de 6 hertz. Le rapport de thêta maximum d' amplitude delta maximum est de 1,25 en C et 4,67 en D, classer clairement
Figure 3: Un outil de détection Theta basé Wavelet. (A) d'analyse temps-fréquence d'un segment d'EEG 30 min (non représenté) qui a été enregistré après l' administration d'uréthane. L'analyse complexe à base d'ondelettes de Morlet a été réalisée dans l'intervalle de 0,2 à 12 Hz, l'amplitude (mV) étant codés par couleur. (B) Cette image affiche l'amplitude maximale de la bande de fréquences de thêta (3,5 à 8,5 Hz, vert) et la bande delta supérieure (2 à 3,4 Hz, rouge) pour le segment d'EEG 30 min. (C) Cette figure illustre le rapport de l'amplitude maximale theta(vert B) et l'amplitude delta maximale (rouge B). Notez que les oscillations thêta hautement synchronisées en corrélation avec les taux de supraliminaires en C. Ce chiffre a été tiré à part de référence 20, avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Analyse des Oscillations Theta pharmacologiquement induite, hautement organisés à base d'ondelettes. des segments représentant 30 min EEG (non représentés) sont analysés dans la plage de fréquences de 0 à 12 Hz, avec une amplitude (mV) étant codés par couleur. Une injection d'uréthane à 800 mg / kg, ip, a entraîné l'apparition d'oscillations fragmentée thêta hautement organisée, avec une fréquence prédominante d'environ 6 Hz (cercles blancs). Après une auinjection ropine à 50 mg / kg, ip, ces oscillations thêta sont abolies. Ce chiffre a été réimprimé de référence 20, avec la permission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Diagramme illustrant la quantification des hautement organisée Theta Oscillations Enregistré du murin CA1. Type II oscillations thêta peuvent être analysées à l' aide d' une commande d' enregistrement (phase), une post-injection (par exemple, l' uréthane, l' arécoline, ou pilocarpine) phase et une phase de post-atropine (A1). 30 segments min EEG (A2) de chaque phase sont temps-fréquence analysé dans la gamme de 0,2 à 12 Hz en utilisant une approche basée sur les ondelettes (B1 et B2). Ensuite, segmentaire thêtadétection de t est lancée (C1), donnant un coup d' oeil de plus près les caractéristiques temps-fréquence de la gamme thêta (de 3,5 à 8,5 Hz, C2) et la gamme delta supérieure (2 à 3,4 Hz, C3) pour les époques EEG qui sont 2,5 s chaque (C4 et C5). Par la suite, l'amplitude est analysée sur la plage de fréquences thêta et delta représentant les valeurs maximales (C6 et C7). Si l'amplitude maximale de thêta / delta est supérieure à 1,5, le 2,5 EEG du segment est classée comme une période d'oscillation thêta hautement organisée (C8), avec une amplitude et une fréquence définie (D1-D3). Cet outil de détection thêta permet la quantification de l' architecture d'oscillation thêta (E1). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Theta activité est d'une importance centrale dans la neurophysiologie systémique. On peut observer dans les diverses régions du cerveau, en particulier dans l'hippocampe, où elle est liée à des états comportementaux et cognitifs spécifiques. En outre, hippocampique thêta peut être pharmacologiquement différenciée en atropine sensible de type II et de type I thêta atropine insensible. Type I est pensé pour être lié à la locomotion, comme la marche ou la course 27, 28, 29, 30, 31, tandis que le type II peut être observé au cours de l'état d' alerte-immobilité 27, 28, 29, 30. États d' alerte-immobilité peut être induite par tonalité ou tactiles stimuli rares et aléatoires, par exemple 32. Type II thêta est également liée à passive rotation du corps entier 14. Pendant le sommeil paradoxal, les deux rythmes thêta atropine sensibles et atropine résistant sont présents 33. L'état de repos immobilité se caractérise par de grandes activité irrégulière (LIA) 27.
D'une manière générale, les oscillations thêta peuvent être enregistrées dans des conditions spontanées, mais aussi après l' induction pharmacologique (par exemple, via l'application d'agonistes des récepteurs muscariniques, tels que l' uréthane, la pilocarpine, l' arécoline, oxotrémorine, etc.). Notez que, pharmacodynamique, uréthane est un médicament multi-cible qui peut améliorer le type II thêta, mais aussi inhiber type I thêta. En revanche, la pilocarpine, arécoline et oxotrémorine induire sélectivement type II thêta. Selon la pharmacocinétique des agonistes muscariniques utilisés, il faut une quantité variable de temps jusqu'à ce que thêta oscillations se produisent. Type II peut être bloqué efficacement par l'atropine. Critique, le dosages des agonistes et des antagonistes muscariniques à induire et le bloc de type II oscillations thêta sont l'espèce et la souche-dépendante. Ainsi, il est absolument essentiel d'effectuer des études dose-effet de démêler la dose optimale pour l'induction d'oscillations thêta et pour leur blocage pour une question scientifique spécifique. Courte durée thêta oscillations peut aussi être induite par des stimuli sensoriels, tels que ou paw-coffre à bagages pincement.
Il existe différentes approches pour caractériser l'activité thêta en général. approches fondées sur FFT, résultant de la densité spectrale de puissance (liées à la bande de fréquence) (PSD) analyse / parcelles continues ou discontinues ou dans une analyse de puissance pour les bandes de fréquences individuelles, sont des approches standard qui fournissent des informations précieuses sur les caractéristiques de fréquence.
Toutefois, pour obtenir un aperçu plus complexe à l'architecture thêta, les approches supplémentaires semblent nécessaires. En particulier, on pourrait être intéressé par les différents organesEtats izational de thêta et leurs fréquences, qui ne peuvent être évalués directement et avec précision par les procédures mentionnées ci-dessus. En revanche, la technique analytique nouvelle présentée ici est basée sur les ondelettes et capable d'évaluer très organisés, oscillations thêta à court terme. Ils ne correspondent pas à la puissance thêta standard, qui considère également paroxystique, activité thêta discontinue. L'objectif est de susciter des caractéristiques spécifiques temps-fréquence dans les données EEG qui sont typiques pour thêta époques. Ainsi, la nouvelle méthode empêche les classifications de faux positifs de thêta époques. La procédure automatisée garantit l'évaluation des ensembles de données EEG de longue durée et comprend donc des comparaisons statistiques fiables des cycles physiologiques (cycle lumière / obscurité ou rythmicité circadienne) au cours des études à long terme.
Ce protocole est d'une importance particulière dans l'analyse des données EEG obtenues à partir de modèles animaux de maladies neurodégénératives, en particulier dans le tysation de l'architecture thêta hautement organisée dans le septohippocampique et d'autres systèmes neuronaux. analyse thêta complexe et de haute précision peut aider à déterminer l'EEG empreintes digitales qui peuvent servir de biomarqueurs EEG dans l'avenir.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
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