Abstract
人工多能性幹細胞（性IPSC）は、病気のモデリングと再生治療のための偉大な約束を保持します。我々は以前に、末梢血単核細胞（PBのMNC）から統合フリー性IPSCを生成するエピソームベクター（EV）の使用を報告しました。使用するエピソームベクターは、それぞれ 、哺乳動物細胞におけるプラスミドの複製および長期保持を可能にエプスタイン-バー（EB）ウイルスからのoriPおよびEBNA1の要素、が組み込まれたDNAプラスミドです。さらなる最適化では、IPSCコロニーの数千人は、末梢血の1ミリリットルから得ることができます。高再プログラミング効率を達成するための2つの重要な要因は次のとおりです：1）2Aの使用は「自己切断」は、ペプチドは、このように二つの要因の等モル発現を達成し、OCT4およびSOX2をリンクします。 2）個別MYCおよびKLF4を発現させるための2つのベクトルの使用を。ここでは、統合のないIPアドレスを生成するためのステップバイステップのプロトコルを記述します成人の末梢血サンプルからのSC。残留エピソームプラスミドは5継代後に検出されないようにして生成性IPSCは、統合フリーです。再プログラミング効率は、センダイウイルス（SV）ベクターに匹敵するが、EVのプラスミドは、かなりより経済市販SVベクターよりいます。この手頃な価格のEVの再プログラミング・システムは、再生医療における臨床応用の可能性を保持し、統合のない間葉系幹細胞、神経幹細胞などにPBの多国籍企業の直接再プログラミングするためのアプローチを提供します。
Introduction
いくつかの転写因子の強制発現した後、 （ すなわち OCT4、SOX2、MYCおよびKLF4）、体細胞は再生医療や細胞置換療法1-3のアプリケーションのための偉大な約束を保持して誘導された多能性幹細胞（性IPSC）に再プログラムすることができます。これまでに、さまざまな方法は、再プログラミング4-7の成功率を高めるために開発されてきました。ウイルスの統合が再プログラミング因子の高レベルの安定な発現を導くためのウイルスベクターによって誘発される再プログラミングが広く、iPS細胞の効率的な生成のために使用されます。しかし、細胞のゲノム中へのベクターDNAの永久的な統合は、挿入突然変異5を誘導し得ます。また、初期化因子の不十分な不活性化は、iPS細胞の分化8を妨害することができます。このように、初期化因子の統合なし性IPSCの使用は、特に、細胞療法用途における使用のために、必須です。
9からの二つの要素、ウイルス複製（のoriP）およびEB核抗原1（EBNA1）の起点を含むプラスミドです。 EBNA1エレメントは宿主細胞の分裂時のエピソームの分割を可能にする染色体DNAにoriPを含むプラスミドDNAを係留しながらのoriPエレメントは、哺乳動物細胞中でのプラスミドの複製を促進します。センダイウイルス（SV）およびRNAのトランスフェクションを含む他の統合フリーアプローチと比較して、電気自動車は、複数の利点5,6,10を有します。彼らは非常に手頃な価格、プラスミドDNAとしては、電気自動車は、容易に製造することができ、家の中で修正されました。また、EVに再プログラミングすることは、いくつかのRNAのトランスフェクションが成功した再プログラミングのために必要であるのに対し、電気自動車を持つ単一のトランスフェクションは、IPSCの世代のために十分であるため、少ない労働集約的なプロセスです。
Dermal線維芽細胞は、多くの初期化研究に使用されてきました。しかし、皮膚生検は侵襲的で痛みを伴うプロセスだけでなく、再プログラミングのために十分な量に細胞を拡大するために時間がかかるだけではありません。大きな懸念されるのは、成人ドナーの皮膚細胞は、多くの場合、このように皮膚線維芽細胞11,12由来iPS細胞用のアプリケーションを制限し、腫瘍に関連する変異につながる可能性があり、長期UV光放射線にさらされてきました。最近、正常なヒトの皮膚細胞は強い正の選択13の下にあり、皮膚の扁平上皮細胞癌の主な要因のほとんどを含む、体細胞変異及び複数の癌遺伝子を蓄積することが報告されています。
1）血液細胞を容易に低侵襲的方法によって得ることができるので、皮膚線維芽細胞とは対照的に、末梢血（PB）細胞は、2）末梢血細胞は、造血幹細胞の子孫であり、再プログラミングのための細胞の好ましい供給源であります骨髄中に存在する、したがって、有害な放射線から保護。末梢血単核細胞（PBのMNC）は、フィコール - ハイパック（1.077グラム/ ml）を用いて、単純な勾配遠心分離後、バフィーコート層からの時間で収集することができます。得られたPBの多国籍企業は、リンパ球、単球およびいくつかの造血前駆細胞（HPCの）14から構成されています。ヒトTリンパ球は、PBの主要な細胞型の一つである成熟がT細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、従って、アプリケーション15,16のための可能性を制限する完全なゲノムを欠いています。しかし、IPSCの生成を介してT細胞の活性化は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法17-19における潜在的な用途を有することができます。比較において、のHPCは、無傷のゲノムを有しており、容易に再プログラム可能です。わずか0.01が-末梢循環中の0.1％の細胞でのHPCであり、これらの細胞はerythrの増殖を有利赤血球培地中でex vivoで拡大することができますOID前駆細胞14。
我々の以前の研究では、PBの再プログラミングefficency 20で10倍に増加した山中因子（OCT4、SOX2、MYCおよびKLF4）に加えて、因子BCL-XLを使用していました。またBCL2L1として知られているBCL-XLは、カスパーゼ21,22の活性化を阻害することにより、細胞死の強力な阻害剤です。しかし、BCL-XLはまた、多能性21,22を維持する上で重要な役割を果たし得ます。最近、我々はさらに、別途再プログラミング効率23で約100倍増加につながる2つのベクトルでMYCおよびKLF4を発現させることにより、当社のEV再プログラミングシステムを最適化しました。健康なドナーからの0.5％ - この方法を使用して、トランスフェクション時の細胞数を開始することによって分割コロニー数で定義された再プログラミング効率は、0.2です。以下のように、我々はPBから統合フリーiPS細胞を生成するための詳細な実験手順を説明します。
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Protocol
人間のPBサンプルのすべてが地元の研究倫理委員会の承認を得て、天津血液センターから入手可能な無識別情報と匿名の成人ドナーから得ました。
1.遠藤フリープラスミドの調製
- 製造業者のプロトコルに従って大腸菌からエピソームベクターを抽出するために商業的なプラスミド精製マキシキットを使用してください。最後のステップでは、DNAペレットを溶解するためにエンドトキシンフリー滅菌水でTE緩衝液に置き換えてください。
- 商業UV /可視分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。濃度は、それぞれ1.8と2.0、より大きいA260 / A280およびA260 / A230比で、1μgの/μLよりも通常大きいです。
2.文化メディア
- 赤血球培地を調製：100ng / mlのヒト幹細胞因子（SCF）、10ng / mLのインターロイキン3（IL3）、2 U / mLのエリスロポエチン（Eを補充した造血幹細胞増殖培地PO）、20 ngの/ mLのインスリン成長因子1（IGF1）、1μMのデキサメタゾンおよび0.2mMの1-チオグリセロール。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。赤血球媒体は最大1ヶ月間4℃で保存することができます。
- IPSC媒体を準備：1×L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、1×非必須アミノ酸溶液、50 ngの/ mLの線維芽細胞増殖因子2（FGF2を添加したDMEM / F12培地（ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12） ）、1×インスリン - トランスフェリン - セレンサプリメント（ITS）、および50mg / mLのアスコルビン酸。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。 IPSC媒体は、1ヶ月まで4℃で保存することができます。
- ; 1×ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコースDMEM）：MEF培地を準備します。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。 MEF培地は、1ヶ月まで4℃で保存するか、あるいは使用前に新たに1×L-グルタミンを追加することができます。
- Prepare IPSC凍結保存培地（2回）：37℃の水浴中に滅菌水30mL中のD-トレハロース5gを溶解します。 4℃に温度を持参した後、FBS 10mLのジメチルスルホキシド10mLの（DMSO）を追加します。 0.22μmのシリンジフィルターで滅菌フィルター。 3ヶ月まで24、4℃で保管してください。
末梢血単核細胞の単離3（PBのMNC）
- 50 mLのチューブに10 mLの新鮮なPBサンプルと10 mLのPBS緩衝液を合わせ、よく混ぜます。使用前にRTまたは37℃にPBSを持参してください。
注：約1から3×10 6のMNC（新鮮または凍結保存した）は、PBの1ミリリットルから得ることができます。培養中に成熟した細胞の死による1×10 6総細胞-培養6日後、0.5を持っていることを期待しています。約1×10 7細胞を、新鮮なPBの10ミリリットルから得ることができます。 - 長い針に取り付けた10 mLの注射器を使用して、チューブの底に10mLのフィコールを追加します。このプロセスは、フィコール層はPBと混合しないことを確実にするために、ゆっくりと行うべきです。
- 低加速と減速の速度で30分間、400×gで遠心分離します。遠心分離した後、PBの多国籍企業は、PBプラズマとフィコールの間に位置する白層（軟膜）です。
- ゆっくりとバフィーコート層を乱すことなく〜10mLのPBプラズマを吸引除去します。慎重に新しい50mLのチューブに1 mLのピペットチップを用いた白色層を収穫。 6 mLの - 白層から採取した細胞の総容積は3の間であろう。
- 30 mLまで全量を10 mLのピペットでよく混合するためにPBSを追加します。 10分間400×gで遠心分離します。
- 上清を除去し、20 mLの培養液中で細胞ペレットを再懸濁（ すなわちイスコフ改変ダルベッコ培地、IMDM）とよく混ぜます。血小板の大部分を除去するために10分間、400×gで遠心分離します。
- 上清を除去し、1で細胞ペレットを再懸濁 - 2 mLのIMDM。細胞は、fを使用することができますまたは即時文化、または後で使用するために凍結ダウン。凍結保存のために、凍結保存培地の同量を追加します。クライオバイアル中のアリコートの細胞（0.5 - 1バイアルあたり1mL）および転送は直ちに-80℃の冷凍庫にクライオバイアル。 PBの多国籍企業は、数週間のために-80℃の冷凍庫に保存されている、または長期保存のために液体窒素タンクに移すことができます。
注：凍結細胞を解凍する場合、当社の凍結保存培地は、細胞の生存率を維持することができるが、細胞数は、解凍処理中により細胞死を減少させることができます。 10×10 7個の細胞を各バイアル中で凍結されます- 1がすることをお勧めします。
赤血球中でのPBの多国籍企業の4拡大
- 15 mLチューブに5 mLのIMDM培地を準備します。すぐに37℃の水浴中で凍結したPBの多国籍企業を解凍した後、IMDM培地をチューブに移します。
注：水浴中で時間の長さは、凍結保存細胞の体積およびクライオバイアルのuに依存しますSED。通常、凍結した細胞は、1分以内に解凍します。 - 10分 - 5用の400×gで遠心分離します。上清を除去し、赤血球培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 10μLの細胞懸濁液を10μLのトリパンブルー溶液を加え、よく混ぜます。 3分 - トリパンブルーが1以内に死細胞を染色します。血球計数器を用いて、顕微鏡下で細胞を数えます。
- 非組織培養（非TC）で培養PBの多国籍企業は、5％のCO 2中、37℃で約5×10 6細胞/ mLの細胞密度で、ウェルあたり2mLの培地で6ウェルプレートに扱わ加湿インキュベーター。
- D 3と5で培地を変更することなく、各ウェルに直接1 mLの新鮮な赤血球媒体を追加します。
- D 6では、ヌクレオのためのPBの多国籍企業を収穫。
5. PB MNCヌクレオとリプログラミング
- 一日20分間、37℃で0.1％ゼラチンとヌクレオ、プレコートTC処理した6ウェルプレートの前に。解凍不活性化されたマウス胚性ファイブロ37℃の水浴中で爆発（MEF）フィーダー細胞と直ちにMEF培地5mlを含む15 mLチューブに移します。
- 5分間400×gで遠心分離し、上清を除去します。 、6ウェルプレートのゼラチンを除去MEF培地中で細胞ペレットを再懸濁し、そしてゼラチン前処理6ウェルプレートに移します。各ウェルに、シード2 - 4×10 5、2 mLのMEF培地中に懸濁MEF細胞を不活性化。
- 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で培養MEFフィーダー細胞。
- ヌクレオの日に、MEF培地を吸引し、1 mLの赤血球培地に交換してください。 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で30分間- 10培養プレートを予め平衡化。
- 1.5 mLの滅菌したエッペンドルフチューブに2μgのPEV-OCT4-2A-SOX2、1μgのPEV-MYC、1μgのPEV-KLF4、および0.5μgのPEV-BCL-XLを追加します。汚染を防止し、RTまで冷却し、5分間50℃でチューブを加熱します。加えます57μLの緩衝液および13μLサプリメントヌクレオ。
- 収穫7分間、200×gで遠心分離することにより、5 mLチューブに2×10 6培養PBの多国籍企業。上清を除去し、細胞ペレットにプラスミド及びヌクレオバッファーミックスを追加します。指でチューブをフリックでよく混和します。
注：2×10 5細胞できるだけ低くはヌクレオのために使用することができるが、より低い初期化の効率も同様に期待されるべきです。 - キットで提供キュベットにDNAや細胞懸濁液を移し、キュベットキャップ。ヌクレオデバイス上でプログラムU-008を選択します。ホルダーにキュベットを挿入し、U-008プログラムを適用するには、[OK]を押します。
- すぐに予め平衡化MEFプレートに1mLの予め温めておいた赤血球各キュベット内のメディア、および転送細胞 - ホルダーのうちキュベットを取り、0.5を追加します。高い再プログラミング効率とドナーの変動による、1-10×10 5細胞のpの範囲のセルの異なる数を播種えーも非常に奨励されています。
- 低酸素室にプレートを転送し、そして1について、92％のN 2、5％CO 2および3％O 2の混合ガスをチャンバーをフラッシュ- 20 L /分の速度で2分間。室を密閉した後、培養細胞を37℃で。
- D 2ポストヌクレオでは、各ウェルに直接2mLのIPSC媒体を追加します。
- D 4のポストヌクレオでは、培地の3ミリリットルを削除し、2 mLの新鮮なIPSC媒体を追加します。 D 4のポストヌクレオで、生細胞の大部分は、フィーダー層に付着しているであろう。
- 18 - D 6ポストヌクレオした後、500μLを残すことにより、培地を変更するごとに2 dはD 14まで0.25 mMの酪酸ナトリウムを添加した培地および2mLのを追加し、新鮮なE8媒体を過ごしました。
注：追加のフィーダー細胞は、フィーダー細胞が分離されていることを観察するたびに、培養ウェルに添加してもよいです。 （5.1および5.2を参照）のMEFを解凍した後、 すなわち 〜0（E8媒体少量の細胞ペレットを再懸濁します。その後、2 6ウェルプレートの1ウェルについてmL）を、培養ウェルにしたMEFを追加します。約2％FBSを細胞接着を増大させるために添加されてもよいです。代替的に、MEF馴化培地を使用することもできるが、それは、より面倒です。
iPS細胞の6.増設
注： - 10ポストヌクレオほとんどのケースでは、IPSCの多数のコロニーは、D 8に表示されます。 D 14の後、大きなIPSCコロニーは通常、ピッキングの準備ができています。
- コロニーを選ぶ前に、フィーダーまたはマトリゲル被覆された24ウェルプレートの1ウェル中で、ROCK阻害剤、Y27632（10μM）を補充した500μLE8媒体を追加します。スクラッチに10または20μLのピペットを使用して、顕微鏡下でコロニーを選択します。培養液を含むウェルに各コロニーの部分を転送します。
注：マトリゲルの濃度は、1バッチから別のものに異なります。マトリゲルの100希釈：通常、我々は1を使用します。- 交差汚染を回避するために、選択広く、他のものから分離されたコロニー。 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で培養性IPSC。
注：コロニーの数十または数百は6ウェルプレートの各ウェルに存在する場合IPSC集団が原因で細胞遊走に対するポリクローナルであってもよいことに留意すべきです。
- 交差汚染を回避するために、選択広く、他のものから分離されたコロニー。 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で培養性IPSC。
- 最初の2日間培地を変更しないでください。 ROCK阻害剤は、小さなコロニー25の生存を促進することができます。
- 以降D 2から、使用済み培地を除去し、各ウェルに500μLの新鮮E8媒体を追加することで、毎日培地に変更。
- 約1週間後、コロニーが十分に大きい場合、培地を除去し、1 37℃で300μLの細胞分離溶液（PBS中の0.5mMのEDTA）で細胞を治療する - 3分。細胞剥離溶液を除去し、iPS細胞を中断するROCK阻害剤（10μM）を含むE8媒体を追加します。過剰な細胞死につながる可能性があり、単一の細胞にコロニーを分解しないでください。 50セル - 5と細胞塊SはIPSC通過するのに適しています。
- フィーダまたはマトリゲルでプレコートされた12-または6-ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を100％ - 転送50。
- マトリゲル被覆プレート（6.1の注を参照）長期培養のために、毎日培地を変更します。細胞集密度が40に達すると - 60％、約3分間、37℃で1mLの細胞分離溶液（PBS中の0.5mMのEDTA）で細胞を処置します。コロニーが丸くする起動すると、細胞剥離液を除去し、iPS細胞を中断するROCK阻害剤（10μM）を含むE8媒体を追加します。流路4の分割係数を有する細胞 - 8生存率を増加させるために細胞を継代時にROCK阻害剤を添加する必要があり、および分化を防止するために1次元後に除去しました。
- 製造業者のプロトコルに従って5分 - フリーズダウンするにはiPS細胞を、3 37℃で細胞剥離液で細胞を処理します。 IPSCコロニーを丸くするために開始すると、バッファを吸引し、0.5を追加 - 1 mLのE8媒体を。 <李>は細胞懸濁液に凍結保存培地を等量加え、よく混ぜます。凍結性IPSCは、数週間または長期保存のために液体窒素で-80℃の冷凍庫に保存することができます。
残留エピソームプラスミドのないiPS細胞の7選択
- 通路5の後、収穫性IPSCおよびゲノムDNAを抽出します。
注：通常、培養5継代後、残留エピソームプラスミドが検出されません。このように、ほとんどすべての5（ すなわち通路10）上記の通路でIPSCコロニーのは、残留エピソームプラスミドを欠いています。 - ネガティブコントロールとしてトランスフェクトしていないPBの多国籍企業からのゲノムDNAを使用してください。細胞あたりのPEVプラスミドのコピーで細胞を模倣するために1μgのネガティブコントロールDNAに1.6 pgのPEV-OCT4-2A-SOX2プラスミドを追加します。
- 100 ngのゲノムDNAおよび1μLの特異的プライマーを含む9μLPCRグレードの水を追加します（10μMフォワードの各プライマーおよびリバースプライマー）高忠実度PCRマスターミックス10μLに。午前のノーマライズGAPDHによるDNAのount。 EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT、EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG、WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT、WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT、GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC、GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC：PCR用の以下のプライマーを使用してください。
- 60秒間、98℃で反応混合物をインキュベートし; 10秒、30秒、60℃、30秒、72°C、98°Cに続きます。 30サイクルの後、 5分間72℃で反応を延長します。
- 負荷1％アガロースゲルの各ウェル中5μLのPCR産物。さらに文化や下流の分析のためのEBNA1およびWPREのための検出不可能なバンドでIPSCクローンを選択し、100Vで30分間 - 20用のゲルを実行します。
8.フローサイトメトリー
- 単一細胞懸濁液を得るために5分 - 3 37℃でのAccutaseでそれらを処理することにより収穫性IPSC。 5×10 5細胞- 1（100μLの細胞懸濁液に1μLPE結合抗TRA-1-60またはeFluor 570結合抗SSEA4またはアイソタイプの抗体を追加）5 mLチューブです。 20分間室温で暗所でチューブをインキュベートします。
- RTで20分間染色した後、5分間400×gで2 mLのPBSと遠心を追加します。細胞分析フローサイトメトリーを用いて、蛍光活性化細胞選別（FACS）分析のために300μLのPBSで細胞を再懸濁し。 23,26
9.共焦点イメージング
- マトリゲルコーティングされたチャンバースライド中の種子性IPSC。
- 3後 - 培養の4日間、増殖培地を除去し、30分間室温で4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定します。 PBSで細胞を2回洗浄します。
注：PFAは、有毒、有害です。 - 室温で30分間PBS中0.1％トリトンX-100（PBS-T）で細胞を処置します。 PBSで細胞を2回洗浄します。
- RTで1時間：ブロッキング緩衝液（V PBS中の5％ヤギ血清、V）で細胞をブロックします。
- ブロッキング工程の間に、ブロッキング緩衝液中で一次抗体（100倍）を希釈します。
注：抗体情報は、 材料/機器の表に記載されています。 - 4°CO / Nで希釈した抗体を用いて細胞をインキュベートします。
- 15分間、PBSで2回、続いて15分間、PBS-Tで二回洗浄します。
- 室温で2時間希釈したフルオロフォア結合二次抗体で細胞をインキュベートします。
- 15分間、PBSで2回、続いて15分間、PBS-Tを用いて細胞を2回洗浄します。
- 10分間室温でPBS中DAPI（1μg/ ml）で核を染色。
- 15分間、PBSで細胞を2回洗浄します。
- 共焦点顕微鏡で画像をキャプチャします。 23,27
10.奇形腫アッセイ
希釈した200μLのDMEM / F12における細胞剥離液（PBS中の0.5mMのEDTA）を再懸濁細胞と収穫1×10 6 iPS細胞（1：1）マトリゲル。
- 皮下には、NOD / SCID免疫不全マウスの背面ハンチに細胞を注入します。
- IPSCの注射後12週、10％ホルマリンで奇形腫を分析して修正 - 8時。 28
- マイクロセクションの後とヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色し、サンプルを分析します。 29
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Representative Results
このプロトコルを使用して、我々は1×10 5 nucleofected PB多国籍企業からのコロニーの数百を取得することができる（ 図1Aおよび図1B）。 0.5％のコロニーが多能性マーカー（ 図1Cおよび1D）を発現-再プログラミング効率は約0.2です。記載されたプロトコルを使用して生成されたiPS細胞は、統合含まず、3胚葉（ 図1Eおよび1F）を構成する奇形腫を形成する能力を有します。
図1： 末梢血単核細胞からの統合のないiPS細胞の生成。 （A）：末梢血液細胞を再プログラミングするためのプロトコルの概略図。 （B）：バルク中のAP染色（左）と、典型的なESCのようなIPSCのコロニー（右）60; PBの多国籍企業のヌクレオ後の14日。スケールバー：100μmです。 （C）：TRA-1-60またはSSEA4を発現している通路5におけるiPS細胞の代表的なFACS図。 （D）：IPSCコロニーの代表的な共焦点画像は、NANOGとOCT4を発現しています。スケールバー：100μmです。 （E）：全体像と3つの胚葉全てを備えた奇形腫のH＆E染色の代表的な画像。スケールバー：100μmです。 （F）は ：5継代後のiPS細胞中の残留EVプラスミドの番号をコピーします。 EBNA1及びWPREに特異的なプライマーは、エピソームベクターを増幅するために使用しました。 GAPDHは、DNAローディング対照として使用しました。 UD、検出不能。正のレーンは、1コピーの制御を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
健康なドナーや患者から血液サンプルを取得したことで、それ基礎研究および臨床細胞治療のための魅力的な細胞源作り、便利で非侵襲的です。ここでは、末梢血サンプルから統合フリーiPS細胞の非常に効率的に生成するためのプロトコルを記載しています。この再現性と手頃な価格のアプローチは、IPSCフィールドに利益をもたらすべきです。
我々は非常に効率PBの再プログラミング30を担当する2つの重要な要因があることを報告しています。一つは、図2（a）のリンカー31を用いて、OCT4およびSOX2の等モル表現です。これを達成するために、PEV-OCT4-2A-SOX2は、このプロトコルで使用されています。もう一つは、我々が以前に30を使用していることを代わりにPEV-MYC-2A-KLF4のMYCおよびKLF4を発現させるための二つのプラスミドPEV-MYCとPEV-KLF4の使用です。 KL：一見単純な変更は、主にMYCの緩やかと大きく増加したことによるものであるPBの再プログラミング効率の約100倍の増加につながり、プロセスの過程でF4比。
いくつかのポイントは、PBから高効率IPSCの生成を達成するために考慮されるべきです。 PBの多国籍企業は、赤血球前駆細胞の増殖と拡大を促進し、したがって、再プログラミング効率20を上昇させる赤血球媒体、中〜1週間培養されます。しかしながら、特に白血病患者から血液細胞のためのいくつかのサンプルのために、細胞を培養した場合、赤血球媒体に難生き残ります。この場合、培養時間を減少させるのに役立つであろう。 50％以上でなければならないヌクレオ効率を、確認するために、2μgののpmaxGFPベクトル - また、1を使用することをお勧めします。また、プラスミドの品質が重要です。 （ すなわち 、プラスミドを抽出するために遠藤フリープラスミドマキシキットを使用して）、エンドトキシン汚染なしのプラスミドを使用することをお勧めします。悪いプラスミド品質は有意な細胞死をもたらし、従って、再プログラミング効率を低下させることができます。我々と他の人は、その低酸素promotを示していますIPSC生成14,32は、es。我々は、92％のN 2、5％CO 2および3％O 2の混合ガスを低酸素チャンバを洗い流します。正常酸素が代わりに使用されている場合、再プログラミング効率が最大80％の減少が観察され得ます。再プログラミングが完了すると、性IPSCは、通常、加湿5％CO 2インキュベーター中で培養することができます。メディアを変更する場合、使用済み培地の少量（6ウェルプレート中のウェルあたり、すなわち 500μL）を残し、その後、新鮮な培地を添加することが便利です。あまりにも頻繁に培地交換は、iPS細胞の生成33を減らすことができるように、再プログラミング中に一日おきに培地のみ変更します。
我々が開発した新しいプロトコルは、SVの再プログラミングシステムに匹敵する高レベルのPBの再プログラミングを達成しました。 EVシステムは、いくつかの明白な利点を有します。 1については、EVがSVよりも手頃な価格です。 EVシステムは、さらに、追加の因子または異なるCOMBINA含むことによって修飾することができますSVのベクトルに対し、複数の要因のションは、研究者により変更することはできません市販製品です。我々の現在のプロトコルは、臨床用途を制限することが、容易にさらにプロトコル開発34,35によって除去することができるMEFフィーダー細胞および動物由来製品の使用を含みます。
GMPレベルEVプラスミドを容易に生成することができ、かなりのEVの統合とのiPS細胞が同定されていないので、このシステムは、疾患モデル及び薬物スクリーニングのためだけでなく、臨床治療のためだけでなく、使用することができると共に性IPSCを生成します。臨床応用では、患者の細胞は、通常、治療のために機能的な細胞への分化の前にiPS細胞で修正する必要がある疾患誘導遺伝子を保有します。最近の報告では、EVの再プログラミングシステムは、簡単なヌクレオ36の後に同時再プログラミングおよびゲノム編集を達成するために、CRISPR / Cas9システムと統合することができることを示しました。これはSVシステムを介してEVのNotherの利点。私たちの未発表データは、EVの再プログラミング時にゲノムの編集をピギーバックするときの編集効率を達成することができる20％のゲノムにそれをアップ示されています。 CRISP / Cas9Rゲノム編集とPBの再プログラミングの統合は今後数十年でそれ以外の場合は不治である複数の疾患の治療に潜在的な用途を有し得ることが私たちの希望です。
要約すると、我々の改善された末梢血細胞の再プログラミングプロトコルは、基礎研究と臨床応用における研究者の広いスペクトルのために有用であるはずです。この効率的なEV書き換えシステムは、IPSCのステージを経由せずに直接、成体末梢血細胞から統合無間葉系幹細胞（MSC）37、または神経幹細胞（NSC）38を生成するために、修正した後、使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
| Human Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80 °C |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80 °C |
| Erythropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80 °C |
| Insulin Growth Factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80 °C |
| 1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80 °C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
| L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Non-essential Amino Acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80 °C |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, 100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
| Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
| DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SV30087.01 | Store at -20 °C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
| Endofree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
| Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement should be stored at 4 °C |
| Sodium Butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80 °C |
| ROCK inhibitor - Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
| Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80 °C |
| Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80 °C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
| Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single-cell suspension |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 or -20 °C |
| Anti-Nanog AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used |
| AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when used |
| PE anti-human TRA-1-60-R antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
| Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
| Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | |
| Spinning Disk Confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
| Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | to take photos of AP staining in bulk |
References
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