Abstract
Questo protocollo dettagliato descrive l'attuazione guidata dalle immagini, degradazione idrogel laser per la realizzazione di reti microfluidica vascolari derivate incorporati in idrogel PEGDA. Qui, descriviamo la creazione di maschere virtuali che permettono di controllo laser guidata dalle immagini; la fotopolimerizzazione di un idrogel PEGDA micromolded, adatto per microfluidica realizzazione della rete e il flusso di testa-driven pressione; l'installazione e l'uso di una scansione laser microscopio confocale disponibile in commercio in coppia con un femtosecondi impulsi laser Ti: S per indurre la degradazione idrogel; e l'imaging reti microfluidica fabbricati usando specie fluorescenti e microscopia confocale. Gran parte del protocollo è focalizzata sulla corretta configurazione e implementazione del software microscopio e il microscopio macro, in quanto questi rappresentano passi decisivi nel mezzo di un microscopio commerciale a fini di fabbricazione microfluidici che contengono una serie di complicazioni. La componente guidata dalle immagini di questa technique consente l'implementazione di pile di immagini 3D o modelli 3D generati dall'utente, consentendo in tal modo per la progettazione microfluidica creativo e per la realizzazione di complessi sistemi microfluidici qualsiasi configurazione. Con un impatto previsto in ingegneria dei tessuti, i metodi descritti in questo protocollo potrebbe aiutare nella realizzazione di avanzati costrutti biomimetici microtessuto per i dispositivi di organismi e umane-on-a-chip. Imitando la complessa architettura, tortuosità, la dimensione e la densità dei vasi in vivo, i processi essenziali di trasporto biologici possono essere replicati in questi costrutti, portando a più accurata modellazione in vitro di farmacocinetica di droga e la malattia.
Introduction
Il sistema vascolare, composto sia linfatico e cardiovasculature, forme reti ad alta densità che sono essenziali per il trasporto di nutrienti e ossigeno e per la rimozione dei rifiuti metabolici. Di conseguenza, le cellule residenti nei tessuti vascolarizzati sono mai più di 50-100 micron di distanza da un recipiente 1. La capacità di riprodurre in vivo dell'architettura vascolare in vitro è fondamentale per modellare accuratamente in vivo processi di trasporto utilizzando costrutti ingegnerizzati. Con una recente un'unità di sviluppare dispositivi organo-on-a-chip 2 per droga high-throughput di screening 3,4 e modellazione malattia 5,6, metodi per creare reti di microfluidica che ricapitolano in vivo -come trasporto in idrogel sintetici o naturali sono di disegno notevole interesse. Per migliorare la biomimicry di microtissues utilizzati in questi dispositivi, abbiamo sviluppato un metodo degrado idrogel laser-based guidata dalle immagini che utilizza tridimenspile l immagine (3D) di vascolarizzazione nativa come modelli per la generazione di reti microfluidica vascolari-derivati incorporati in PEGDA idrogel 7. Questo protocollo descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser disponibile in commercio equipaggiato con un laser pulsato a femtosecondi per fabbricare vascolari derivate, reti microfluidici biomimetiche in idrogel PEGDA tramite degradazione guidata dalle immagini, basato su laser.
Gli attuali approcci per fluidificare idrogel includono l'induzione di vascolare 8-10 o 10-12 tecniche delle cellule endoteliali di auto-assemblaggio e di microfabbricazione angiogeniche di creare canali pre-definiti per endotelializzazione 13-16. Mentre le reti autoassemblati ricapitolano la densità e complessa architettura di microcircolo, spesso sono più permeabili reti in vivo 11,17,18, che può essere problematica nel trasporto modellazione per applicazioni di screening di stupefacenti. reti di auto-assemblati costituiti da physiologcamente rilevanti, vasi capillari di dimensioni, ma possono essere difficili da integrare con il flusso del fluido di massa a causa di limitazioni nella generazione di grandi vasi arteriole dimensioni. Poiché non vi è alcun controllo diretto sul gruppo di queste reti, l'architettura finale può variare da campione a campione, rendendo difficile ripetutamente produrre reti con le stesse proprietà di flusso e trasporto dei fluidi.
Per generare 3D, reti microfluidica idrogel-embedded a geometria ripetibile e architettura ben definito, sono state sviluppate una serie di tecniche di microfabbricazione, compreso il montaggio modulare 13, la stampa 3D di materiali sacrificali 16, montaggio e scrittura diretta 14, e la stampa omnidirezionale 15. L'applicazione di questi metodi, architettura microfluidica, e quindi fluidi proprietà di scorrimento e di trasporto, può essere ripetutamente fabbricato in molti costrutti. Una limitazione importante di questi approcci, tuttavia, è l'incapacità di creare microFreti luidic con caratteristiche capillari di dimensioni, da 4 a 10 micron 19. La maggior parte delle tecniche di microfabbricazione sono spesso limitati alle funzioni da 150 a 650 micron di diametro 13,16. Alcune tecniche esistenti sono in grado di generare reti gerarchiche con canali in una vasta gamma di diametri, 10 e 300 micron per il montaggio-scrittura diretta 14, e da 18 a 600 _M per la stampa omnidirezionale 15, ma sono limitati nella loro capacità di generare reti dense o per produrre più reti microfluidica in prossimità all'interno di un unico costrutto 7.
Per superare alcune di queste limitazioni, abbiamo sviluppato una tecnica degrado idrogel laser-based guidata dalle immagini che permette la fabbricazione ripetibile di biomimetica, reti microfluidica gerarchiche che ricapitolano l'architettura del microcircolo in vivo. Per fare ciò, un 790 nm, 140 femtosecondi (fs) laser pulsato operante a 80 MHz è i raster scansionatan desiderata posizioni 3D all'interno di un idrogel, come definito da immagini di vascolarizzazione in vivo. Noi ipotizziamo che il processo di degradazione opera attraverso la ripartizione indotta da laser ottica di acqua, la formazione di plasma risultante, la successiva rapida espansione termoelastica di acqua, e la degradazione locale del idrogel come l'acqua si espande 20. Questo meccanismo varia leggermente dalla degradazione basato su laser di idrogel a base di proteine 21-24. Diversamente PEGDA, che ha una bassa sezione multiphoton, proteine hanno spesso una grande multiphoton sezione e sono quindi degradati attraverso un multiphoton assorbimento indotta rottura chimica 23. Per generare reti microfluidica guidate da immagini, l'otturatore laser è controllato da maschere virtuali immagine derivato, che consistono di un mosaico di regioni di interesse 9 che definiscono l'architettura microfluidica. Usando questo approccio, abbiamo dimostrato la capacità di fabbricare microfluidi biomimetico vascolare-derivati 3Dreti ic, che ricapitolano l'architettura densa e tortuoso vascolare in vivo, per controllare localmente la porosità degli idrogel alterando la quantità di energia erogata durante la degradazione. Siamo stati anche in grado di generare due reti microfluidica indipendenti che si intrecciano nelle immediate vicinanze (15 micron), ma non si collegano direttamente 7. Abbiamo inoltre dimostrato la capacità di endothelialize microcanali laser degradata attraverso posta degrado funzionalizzazione con l'integrina leganti sequenza peptidica, arginina-glicina-acido aspartico-Serina (RGDS), per favorire l'adesione delle cellule endoteliali e la formazione di lumen 7.
Con questo protocollo, la generazione di reti complesse microfluidica in idrogel PEGDA è reso possibile tramite la degradazione guidata dalle immagini, laser-based utilizzando un microscopio disponibile in commercio accessibile su molti campus universitari. Poiché il processo di degradazione è guidato da, maschere virtuali digitali, questa fabricatecnica zione è suscettibile per la progettazione creativa di reti microfluidica, consentendone l'uso in un'ampia varietà di applicazioni. Prevediamo che il metodo descritto qui sarà più vantaggiosa nella progettazione di dispositivi organismi e umane-on-a-chip biomimetici in grado di replicare i processi di trasporto biologici importanti nella modellazione del trasporto di droga 2. Questa tecnica di fabbricazione può anche essere di interesse per la generazione di modelli di malattia in vitro, comprendenti metastasi del cancro 5,6 e modelli barriera ematoencefalica 25. Come degrado idrogel basato su laser è stato precedentemente utilizzato per creare tracce per la guida di escrescenza neuronale 21-23, l'estensione guidata dalle immagini di questa tecnica potrebbe rivelarsi utile nelle strategie di ingegneria tessutale avanzate per posizionare le celle a disposizioni spaziali 3D definiti dall'utente.
Protocol
1. Generare maschere virtuali
NOTA: Un'immagine 3D pila di microcircolo cervello di topo è stato scelto come modello di microfluidica per questo protocollo, essendo stati abbattuti da un set di dati molto più grande che contiene le immagini di un intero microcircolo cervello di topo. Immagini microvascolari sono state acquisite tramite acuminate microscopia a scansione (KESM) 26, 2; dati microvascolari simili sono apertamente disponibili attraverso il KESM cervello di topo Atlas 28.
- Apri l'immagine software di elaborazione 29 e aperta e ritagliare l'immagine 3D TIF pila di vascolarizzazione nativo, in modo che la rete microfluidica desiderata, da generare all'interno del idrogel, si inserisce in un 450 micron x 450 micron x 1,5 mm (x di y per z) finestra. Per fare ciò, disegnare un quadrato attorno alla regione desiderata e fare clic su "Immagine" → "Crop". Rimuovere le fette nella direzione z facendo clic su "Immagine" → "Duplica" e digitare una fetta desideratogamma.
NOTA: Questo assicura che le caratteristiche desiderate inseriscono all'interno del campo visivo (x per y) (531,2 x 531,2 micron quando si utilizza un 20X (NA1.0) obiettivo immersione in acqua con una dimensione del frame di 2.884 x 2.884 pixel e uno zoom di 0.8 con una scansione laser microscopio confocale) e la distanza di lavoro (z) di un obiettivo ad immersione dell'acqua 20X (NA1.0). Se sconosciuto, il campo di vista per altri sistemi può essere determinato acquisendo un'immagine con l'obiettivo e le impostazioni desiderate. - Ruotare la serie di immagini in modo che le caratteristiche sono principalmente allineati con la direzione di scansione raster, o la direzione x, facendo clic su "Immagine" → "Trasforma" → "Ruota". Questo riduce il tempo necessario per la fabbricazione.
- Scala lo stack immagine ritagliata in modo che le partite di dimensione dei pixel o supera le impostazioni utilizzate per la degradazione sul microscopio confocale (0.184 micron / pixel quando si utilizza un (NA1.0) obiettivo 20X immersione in acqua con una dimensione del frame di 2.884 per 2.884 pixele uno zoom di 0.8). Per fare questo, fare clic su "Immagine" → "Regola" → "Size" e digitare "2446" per "larghezza" (vale a dire, 450 micron, o la dimensione dell'immagine diviso per 0.184 micron / pixel).
- Soglia / binarizzare della serie di immagini digitando "Ctrl + Shift + T". Deselezionare "Dark", e cliccare su "Apply" → "OK". Completare il processo facendo clic su "Immagine" → "tabelle di ricerca" → "Inverti LUT".
- Utilizzando un algoritmo personalizzato (codice sorgente è disponibile nel materiale supplementare del manoscritto riferimento) nel software di programmazione 9, montare il binarizzata (bianco) dispone con un mosaico di singoli quadrilateri pixel alto parallelamente alla direzione di scansione raster (x -Direzione) per generare regioni di interesse (ROI) che guidano la posizione del laser e l'otturatore 9, 7, 30, 31, <sup> 32.
NOTA: L'algoritmo personalizzato 9 converte ogni singolo piano nell'immagine TIF pila in un file RLS. - Modificare l'estensione del file dei file RLS per .ovl per l'uso durante la degradazione.
2. Configurazione del confocale a scansione laser Microscopio
NOTA: Mentre altri microscopi a scansione laser dotati di laser ad impulsi può essere utilizzato, le impostazioni e il protocollo qui descritto l'uso di un microscopio a scansione laser (LSM) in combinazione con il software.
- Con il microscopio confocale a scansione laser, aprire il software microscopio, e fare clic su "Start System". Selezionare l'obiettivo "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75 millimetri" nella scheda "Mantieni".
- Impostazione della configurazione "Hydrogel Visualizzazione"
- Nella scheda "Acquisizione", assicurarsi che sia selezionata la linea laser (514 nm laser Argon) e nel Windo "Laser"w. NOTA: Questo canale è utilizzato per l'immagine del idrogel tramite eosina Y fluorescenza a fini di orientamento 7.
- Nella finestra "Impostazioni di imaging", impostare "Mode" su "Channel Mode", impostare "Track Switch ogni" a "Frame", e selezionare "Track1".
- Nella finestra "Path Light", selezionare solo il rivelatore a fluorescenza Ch1, con una gamma 516 al 735 nm; un divisore di fascio principale (MBS) 458/514 filtro sulla linea luce visibile; e una piastra nella linea luce invisibile. Deselezionare il rilevatore di tubo fotomoltiplicatore in campo chiaro, "T-PMT".
- Nella finestra "Modalità di acquisizione", controllare che sia selezionata l'obiettivo corretta e impostare la "Modalità di scansione" a "Frame", il "Frame Size" a "2884" in X e Y, la "Linea Step" a "1" , il "numero della media" a "1", la "modalità media" a "Line", il "Averaging Method" a "Mean", il "Profondità di bit "a" 16 bit ", e la" direzione "per" <-> "per la scansione bidirezionale.
- Nella finestra "modalità di acquisizione", impostare la "velocità" come desiderato e impostare "Corr X" e "Y" a "0.05" o regolare come necessario per il microscopio specifico utilizzato. Deselezionare "HDR".
- Nella finestra "Modalità di acquisizione", assicurarsi che l ' "Area di scansione" visualizza una "dimensione dell'immagine" di "531,2 micron x 531,2 micron" e un "Pixel Size" di "0,18", con un "Zoom" impostato su "0.8" ; impostare tutti gli altri valori "di scansione" a zero.
- Nella finestra "Canali", selezionare "Track1", come il rivelatore di fluorescenza Ch1. Selezionare la riga laser "514", con una percentuale di potenza di "10.0", un "Pinhole" di "1AU", un primo "Gain (Master)" di "800", un "offset digitale" di "0", e un "Digital Gain" di4; 1 ".
NOTA: regolare queste impostazioni come necessario per il microscopio specifica in uso. - Salvare questa configurazione come "Hydrogel Visualizzazione".
- Impostazione della configurazione "Canale Formazione"
- Nella scheda "Acquisizione", verificare che la linea del laser (790 nm 140 fs a impulsi laser Ti: S) viene selezionato e nella finestra "Laser". Impostare "GDD Correction" a "4000" per la potenza massima a 790 nm.
- Impostare la finestra "Impostazioni di imaging", come indicato al punto 2.2.2.
- Nella finestra "Percorso Light", assicurarsi che non rilevatori fluorescenti vengono selezionati, con un MBS 458/514/561/633 filtro sulla linea di luce visibile e una MBS 760+ filtro sulla linea di luce invisibile. Deselezionare il rilevatore di tubo fotomoltiplicatore in campo chiaro, "T-PMT".
- Nella finestra "Modalità di acquisizione", verificare che l'obiettivo corretto è elencato. Impostare la "velocità" a "3"E tutte le altre impostazioni come descritto al punto 2.2.4.
- Nella finestra "Canali", selezionare "Track1", come il rilevatore di T-PMT. Selezionare la linea laser "790", con una percentuale di potenza di "100.0", una prima "Gain (Master)" di "800", un "offset digitale" di "0", e "Gain digitale" di "1" .
- Nella finestra "Stage", azzerare il palco facendo clic su "set a zero". Segnare la posizione cliccando su "Mark". Questo è fondamentale per il caricamento di maschere virtuali alla macro microscopio in fase 3.
- Nella finestra "Time Series", impostare "Cicli" come "1" e "Intervallo" come "0".
- Nella finestra "Bleach", controllare la "Start imbianchimento dopo # scansioni" scatola e impostarlo su un valore pari a "0 su 1". Selezionare "Different velocità di scansione", con un valore di "3" (corrispondente ad un tempo di permanenza di pixel 8,96 ms / pixel). Selezionare il "bl sicuraciascuno per GaAsP ".
- Nella sezione linea laser della finestra "Bleach", selezionare la linea laser 790 e impostare la potenza per cento a "100.0". Lasciare tutte le altre caselle nella finestra di candeggina non selezionati. Salvare le impostazioni di candeggina nella finestra "Bleach".
- Salvare questa configurazione come "formazione del canale".
NOTA: La "Z-Stack", "Regioni", "Focus", e le finestre "stage" sono importanti anche per questo protocollo, ma non hanno bisogno di essere impostato o regolato durante la configurazione iniziale.
3. Creazione di una ricetta e il caricamento di maschere virtuali al Software Microscopio e Macro
- Con il microscopio confocale a scansione laser ancora in corso e il software microscopio ancora, selezionare solo la finestra "Regions" (accanto al pulsante "Start Experiment") nella configurazione "formazione del canale".
- Per garantire che le maschere carico al macro microscopio correttoLy, impostare la potenza per cento nella finestra "canali" a "0,2" e la "velocità" nella finestra "Modalità di acquisizione" a "8", e cliccare su "Snap" in alto a sinistra dello schermo.
- Verificare che le dimensioni delle immagini è ancora "531,2 micron x 531,2 micron", con una dimensione di pixel di "0,18", nella scheda "Informazioni" dell'immagine. Se questi valori non sono corretti, controllare i valori "ZOOM" "Frame Size" e di nuovo.
- CRITICO: Verificare che le posizioni X e Y nella finestra "Stage" vengono azzerati e che la posizione è segnata prima di aprire la macro microscopio. Fare riferimento al punto 2.3.6.
- Per aprire la macro microscopio, digitare "Alt + F8", fai clic su "Carica", e selezionare la versione corretta. Vedere i dettagli nella lista di specifici materiali / attrezzature. Un lungo elenco di sub-macro si aprirà nella finestra "Macro di controllo".
- Nella finestra "Macro di controllo", fai clic su "Esegui" per aprire il MICRoscope macro, e quindi chiudere la finestra "Macro di controllo".
NOTA: Alternativa versioni della macro microscopio potrebbero non essere compatibili con il degrado idrogel laser-based utilizzando questo protocollo. - Nella scheda "Salvataggio" della macro microscopio, fornire un arbitrario "Nome file base", selezionare "uscita singola file", e ha scelto una cartella "file temporanei". Impostare "Apri cartella Temp" per posizione "1", selezionare "Cartella immagine singola temporanea", e il nome della ricetta in "Store / Apply ricetta" con "lista di richiamo posizioni" selezionato. Fai clic su "Store" per creare inizialmente la ricetta.
- Nella scheda "Acquisizione" della macro microscopio, assicurarsi che la "configurazione di scansione" corrisponde al nome dato alla configurazione software del microscopio impostato al punto 2.3. Impostare il "no del Tempo Punti all'interno del blocco" a "1", con un "intervallo" di "0". Assicurarsi che "Z Marcato - Top of the Z StacK "è evidenziata in verde. Tutte le altre impostazioni predefinite vanno bene così come sono.
- Nella scheda "Timing" della macro microscopio, in modo che "Aspetta Delay" è evidenziata in verde, impostare "Ripetizioni esperimento" e "Gruppo Ripetizioni" a "1" e "Wait intervallo prima del blocco a Prima Posizione Only" a "0" . Tutte le altre impostazioni predefinite vanno bene così come sono.
NOTA: Il "Gruppo Ripetizioni" (e non il "Ripetizioni esperimento") scatola è dove si può impostare il numero di volte che le scansioni laser su una regione (ad esempio, le ripetizioni della ricetta). - Nella scheda "Z List" della macro microscopio, sono specificati i piani di degradazione in direzione z. Impostare la z-spaziatura, "dZ", a "1 micron", con il "Numero di posizioni" impostato per corrispondere al numero di maschere virtuali da utilizzare.
- Fare clic sul pulsante "Crea Z Stack" per rendere la "Lista Z" appaiono nel menu a discesa "List di luoghi "verso la parte inferiore della finestra. Verificare che il numero di sedi e z-spacing siano corrette e che le posizioni X e Y vengono azzerati.
NOTA: Se non lo sono, non conservare la ricetta; chiudere la macro microscopio e ripetere il passaggio 2.3.6 prima di riaprire la macro microscopio e la creazione di nuovo la ricetta.
NOTA: Invece di avere 100 maschere distanziate da 1 micron ciascuno, per esempio, può essere vantaggioso avere 50 maschere, ciascuna impiegato due volte e distanziati da 1 micron, per ottenere una struttura microfluidica equivalente, come il caricamento singole maschere alla macro microscopio può richiedere molto tempo. - Nella scheda "Bleach" della macro microscopio, tutte le maschere devono essere caricati e abbinati con una posizione numerata specifica nella "Lista delle posizioni". Per iniziare, selezionare la casella "Bleach" e garantire che "Config." corrisponde al nome delle impostazioni candeggina nella finestra "Bleach" nella schermata del software del microscopio principale (fare riferimento al punto 2.3.8). Impostare "Aspetta ritardo dopo Bleach" a "0", deselezionare "spot", e lasciare il "ROI" vuoto.
- Non modificare nulla nella "posizione", "mattonelle", "Griglia", "Autofocus", "Blocchi", e "Opzioni" linguette dalle impostazioni predefinite.
- Per caricare le maschere alla macro microscopio, selezionare solo la finestra "Regioni" nel software del microscopio e aprire la scheda "Bleach" della macro microscopio. Nella finestra "Regioni", fai clic su "Carica" e selezionare il file .OVL per la maschera nella parte inferiore dello z-stack di essere degradato.
NOTA: La prima posizione nella "lista Z" è il fondo della z-stack, e la macro microscopio facendo strada all'inizio z-stack o idrogel. - Una volta che l'elenco dei ROI appare nella finestra "Regioni", fare clic sul pulsante con la freccia per visualizzare le ROI della maschera all'interno del campo di vista (sull'immagine scattò al punto 3.2). Verificare che le ROI inseriscono all'internoil campo di vista.
- Per salvare la maschera caricata nella macro microscopio, dare la maschera di un nome e il numero nella casella "Aggiungi Regione Current al ROI List" sulla scheda "Bleach", e quindi fare clic sul pulsante "Aggiungi Regione Current al ROI List". Il nome e il numero vengono visualizzati nell'elenco a discesa "ROI" con altre maschere (tra cui maschere da altre ricette create in precedenza). Eliminare la maschera nella finestra "Regions" nel software microscopio.
- Ripetere i punti 3.14 e 3.16 per caricare e salvare tutte le maschere alla macro microscopio.
- Per assegnare le maschere caricato in ogni Z-posizione, posizione 1 nel menu a discesa "Lista delle posizioni" in evidenza. Selezionare il ROI appropriata dall'elenco a discesa "ROI". Assicurarsi che la casella "Bleach" è selezionato nella parte superiore della scheda "Bleach" nella macro microscopio.
- Ripetere il passaggio 3.18 per tutte le posizioni nel menu a discesa "Lista dei Luoghi", e quindi fare clic su "Store" sul &# 34; Saving "scheda per salvare la ricetta nella sua forma definitiva.
4. fotopolimerizzanti un PEGDA Hydrogel
- Rendere sterile HEPES Buffered Saline (HBS) con trietanolammina (TEOA)
- In un 1-L bicchiere, aggiungere 500 ml di H 2 O. DI Con un ancoretta, mantecare con 2.922 g di cloruro di sodio, 1.196 g di HEPES, e 7,5 ml di TEOA in una cappa aspirante.
- Aggiustare il pH a 8,3 con soluzione di idrossido di sodio 1 N aggiungendo goccia a goccia con una pipetta Pasteur.
- filtro sterile la soluzione attraverso una tazza filtrazione sottovuoto 0,2 micron in un supporto di bottiglia di vetro da 500 mL autoclavato. Aliquota e conservare a 4 ° C.
- Fissare un anello di biadesivo con il sostegno di un piatto speciale di 60 mm di Petri con un foro di taglio di 20 mm dal fondo. Lasciando l'appoggio sull'anello adesivo, premere eventuali bolle d'aria tra la piastra di Petri e l'adesivo.
- Preparare i materiali. Portare il sintetizzato 33 3.4 kDa PEGDA fuori dal -80 ° C freezer e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente. Accendere la sorgente di luce bianca almeno 15 minuti prima fotopolimerizzanti idrogel.
- In una cappa aspirante, aggiungere 1 ml di HBS con TEOA ad una, 2-provetta ambra centrifuga lamina coperto (utilizzato per evitare che la luce esposizione del fotoiniziatore, eosina Y). Aggiungere 10 ml di 1 mm eosina Y sale bisodico in DI H 2 O.
- In una cappa aspirante, estrarre un piccolo volume di 1-vinil-2-pirrolidinone (NVP) in un bicchiere di vetro con una pipetta Pasteur. Da questo volume, pipettare 3,5 ml di NVP nel tubo ambra centrifuga con HBS, TEOA, eosina Y.
- In un secondo, 2-provetta ambra centrifuga lamina coperto (usato per prevenire fotoattivazione errante della soluzione prepolimero), aggiungere 10 mg di 3.4kDa PEGDA. Aggiungere 0,2 ml di HBS, TEOA, eosina Y, soluzione NVP per un 5% w / v soluzione pre-polimero PEGDA. Vortex fino a quando il PEGDA è completamente sciolto. Usando un misuratore di potenza e detector bacchetta, regolare l'intensità del li biancafonte ght a 95 mW.
- Costruire un Poly (dimetilsiloxano) (PDMS) Mold
- Costruire uno stampo PDMS 7 su una superficie maggiore (vetro, tessuto polistirene cultura piatto) per facilità di trattamento e assemblare gli stampi in modo che gli idrogeli stampati inseriscono all'interno di un cerchio di diametro di 20 mm.
- Per generare un idrogel a forma rettangolare con uno spessore di 500 micron, posizionare due PDMS 500 micron di spessore distanziatori su una superficie PDMS per creare due bordi idrogel definiti.
- Include un 300 micron PDMS spacer per conferire un ben 300 micron di profondità nella superficie della idrogel, che è utile per l'introduzione di fluidi.
- Pipettare 60 ml di 5% w / v soluzione pre-polimero PEGDA sullo stampo PDMS. Fare attenzione a non introdurre bolle durante il pipettaggio.
- Centro e posizionare un [3- (methacryloyloxy) propil] trimetossisilano (TMPSA) funzionalizzati 7, diametro 40 mm, # 1.5 coprioggetto vetro sulla parte superiore della soluzione. Assicurarsi che il coverslip poggia sui distanziali PDMS 500 micron. L'idrogel legherà coprioggetto metacrilato e impedire l'idrogel dal galleggiante nella soluzione.
- Posizionare il PDMS, soluzione pre-polimero PEGDA e applicare il coprioggetto il gruppo sotto la sorgente di luce bianca per 3 min.
- Flusso DI H 2 O tra lo stampo e il vetrino per separare l'idrogel dalle PDMS. Risciacquare l'idrogel con DI H 2 O. Asciugare i bordi del vetrino con il tessuto di laboratorio. Fare attenzione a non toccare o acqua stoppino dalla idrogel.
- Dopo aver rimosso il rivestimento dall'adesivo, aderire il vetrino al piatto preparato Petri e rimuovere delicatamente le bolle d'aria dalla tra l'adesivo e il vetro. Immergere l'idrogel nella capsula di Petri con DI H 2 O.
NOTA: Lo stampo PDMS può essere riutilizzato per rendere idrogel aggiuntivi se risciacquato con DI H 2 O, essiccato con azoto, ed essere esenti da polvere.
5. Fabricating vascolare di derivazione della rete Microfluidics tramite degradazione laser-based
- Con la scansione laser microscopio confocale e il software microscopio su, selezionare l'obiettivo "W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC VIS-IR M27 75 millimetri" nella scheda "Mantieni". Nella scheda "Acquisizione", assicurarsi che le linee necessarie laser (514 nm laser ad argon e 790 nm 140 fs a impulsi laser Ti: S) sono accesi e riscaldati.
- Impostazione l'idrogel per formare un canale di ingresso
- Montare l'idrogel e piastra di Petri sull'inserto palco e posizionare l'inserto palco sul palco microscopio. Riempire la piastra di Petri con almeno 5 ml di H 2 O. DI Centro le caratteristiche di idrogel e bene da occhi prima di abbassare l'obiettivo immersione in acqua nella DI H 2 O.
NOTA: Non schiacciare l'idrogel con l'obiettivo a due non dovrebbe mai toccare! - Per trovare l'idrogel, passare alla configurazione "Hydrogel Visualizzazione" dal punto 2.2. Fai clic su "Live" per attivare la linea laser e portare the obiettivo più vicino al idrogel finché il segnale eosina Y (rilevata dal rilevatore fluorescente Ch1) della parte superiore della idrogel può essere visto.
NOTA: Per trovare l'idrogel facilmente, la potenza percentuale può essere aumentata o il foro può essere aperto. Una volta che l'obiettivo è focalizzata sul idrogel, tuttavia, cadere la potenza percentuale di proteggere il rivelatore a fluorescenza e diminuire la pinhole ritorna 1AU evitare sovrasaturazione del rivelatore e per individuare con precisione la superficie idrogel. - Nella finestra "Stage", contrassegnare le posizioni della parte superiore e inferiore del idrogel e del fondo del pozzetto.
NOTA: I valori z qui aiuterà nella determinazione dello spessore del idrogel e la profondità del pozzo. - Utilizzare il joystick per muoversi in X e Y per individuare il bordo di un pozzo. Posizionare l'idrogel a destra dello schermo, con il pozzo a sinistra, o viceversa. Lasciare che l'idrogel per riempire non più di due terzi del campo di vista.
- Drop the plane fuoco giù 150 micron in idrogel impostando il "Step Size" a "150" nella finestra "Focus" e cliccando sulla freccia in giù accanto alla casella "Z-Position". Ripetere il passaggio 5.2.4, se necessario.
NOTA: L'x, y, ez posizione del ingresso dipende unicamente dalla progettazione delle maschere virtuali. - CRITICA: Zero X e Y posizione nella finestra "Stage", eliminare tutte le altre posizioni marcate, e segnare solo questa posizione.
NOTA: Se non si esegue questa operazione, la macro microscopio non ripristinerà correttamente le posizioni nella ricetta salvato in precedenza, e l'idrogel non sarà degradato nella posizione desiderata.
- Montare l'idrogel e piastra di Petri sull'inserto palco e posizionare l'inserto palco sul palco microscopio. Riempire la piastra di Petri con almeno 5 ml di H 2 O. DI Centro le caratteristiche di idrogel e bene da occhi prima di abbassare l'obiettivo immersione in acqua nella DI H 2 O.
- Formando un canale di ingresso
- "Snap" un'immagine e disegnare una regione rettangolare che sarà l'ingresso alla rete vascolare utilizzando il pulsante rettangolo nella finestra "Regions".
NOTA: parte sicura della regione si estende nel pozzo per garantire che esimoe ingresso collegherà il bene alla rete vascolare. - Accanto al ROI generato nella finestra "Regioni", selezionare "Acquisition" e deselezionare "Bleach" e "Analisi".
- Salvare la configurazione "Hydrogel Visualizzazione", deselezionare "Regioni", e passare alla configurazione "Formazione Channel", istituito nel punto 2.3. Nella configurazione "formazione del canale", selezionare "regioni" di nuovo.
NOTA: Quando si passa tra il "Hydrogel Visualizzazione" e le configurazioni "formazione del canale", assicurarsi di deselezionare le regioni in alto a sinistra dello schermo. A volte la scala delle regioni può cambiare inaspettatamente tra le configurazioni, se questo non viene fatto. - Nella configurazione "Formazione Channel", assicurarsi che solo "Regioni" e "Z-Stack" vengono selezionati. Nella finestra "Z-Stack", fare clic sul pulsante "Center" in alto e poi il "Centro" testa a testail sopra "offset" per impostare il centro della z-stack come Z-posizione corrente. A seconda di come grande ingresso deve essere, impostare il numero di "fette", con un "intervallo" di "1". La dimensione del Z-stack viene visualizzato sotto "Range".
- Controllare che "Speed" nella finestra "Modalità di acquisizione" è impostato su "3" e che la "percentuale di alimentazione" nella finestra "Canali" è impostato su "100". Salvare la configurazione e fare clic sul pulsante "Start Experiment".
NOTA: La macro microscopio non è necessario per degradare la stessa forma semplice su più piani, interpretato qui per generare un canale di ingresso. La macro viene richiesto solo quando degradante regioni differenti su ogni singolo piano, ed è utilizzato per memorizzare le maschere virtuali all'interno di una ricetta. - Per visualizzare l'idrogel durante la degradazione, aumentare la "Gain (Master)" nella finestra "Canali", se la regione in tegli campo di vista è di colore nero, o diminuire il "Gain (Master)" se la regione è bianco.
NOTA: formazione di bolle qui è un'indicazione di degradazione idrogel indotta da laser. - A degradare l'ingresso più volte invece di una sola volta, regolare i "Cicli" nella finestra "Time Series".
- Nella configurazione "Hydrogel Visualizzazione", cliccare su "live" per assicurare che l'ingresso si è formata.
- "Snap" un'immagine e disegnare una regione rettangolare che sarà l'ingresso alla rete vascolare utilizzando il pulsante rettangolo nella finestra "Regions".
- Impostazione l'idrogel per generare la rete Microfluidic
- Nella finestra "Regioni", caricare qualsiasi file di .OVL dalla Z-pila di maschere virtuali e fare clic sul pulsante con la freccia per vedere le ROI nel campo di vista.
- Fai clic su "Live" per vivere la scansione della configurazione "Hydrogel Visualizzazione" e utilizzare il joystick o la finestra "Stage" per posizionare l'idrogel in X e Y, in modo tale che l'ingresso si collega alla posizione corretta all'interno della rete vascolare.
NOTA: Assicurarsi che ilROI della maschera virtuale sovrapporre leggermente con l'ingresso precedentemente formata. - Eliminare il piano di messa a fuoco basso 50 micron dal precedente centrato Z-luogo, o 200 micron dalla superficie del idrogel, utilizzando il "Step Size" nella finestra "Focus" e cliccando sulla freccia in giù accanto alla "Z-Position " scatola. Questa sarà la prima posizione nella macro microscopio.
NOTA: La distanza effettiva di muoversi nella direzione z dipende dal disegno di rete. Assicurarsi che la rete desiderata non si estende oltre la superficie superiore o inferiore del idrogel nella direzione z. - CRITICA: Zero le posizioni X e Y nella finestra "Stage", eliminare tutte le altre posizioni marcate, e segnare solo questa posizione.
NOTA: Questo sarà il punto di partenza nella macro microscopio. La ricetta farà il suo ritorno verso la superficie dell'idrogel. - "Snap" un'immagine nella configurazione "Hydrogel Visualizzazione", cancellare e deselect "Regioni", e salvare la configurazione.
- Generare la rete Microfluidic
- Passare alla configurazione "Formazione Channel", e solo selezionare l'opzione "Time Series" e finestre "sbianca". Verificare che le impostazioni per il "Time Series" e le finestre "sbianca" sono come sono stati inizialmente fissati in punti 2.3.7 e 2.3.8.
- Impostare la "velocità" nella finestra "modalità di acquisizione" a "8" e la potenza percentuale della linea laser a "0,2" nella finestra "canali". Salvare la configurazione.
- Aprire la macro microscopio passo successivo 3.5. Nella scheda "Salvataggio" della macro, selezionare la ricetta fatta in precedenza dal punto 3 e fare clic su "Applica".
NOTA: Non cliccare "deposito" o la ricetta verrà sovrascritto! - Controllare le impostazioni in tutte le schede e verificare che le maschere virtuali (file .OVL) sono ancora correttamente associati con tegli Z posizioni nell'elenco a discesa. Verificare inoltre che la prima Z-posizione corrispondente alla posizione marcata nella finestra "Fase" del software microscopio.
NOTA: Counterintuitively, la seconda posizione nell'elenco discesa sarà fisicamente sopra il primo luogo, come macro microscopio farà il suo corso dal fondo dell'idrogel (più lontana dall'obiettivo) all'inizio della idrogel (più vicino al obbiettivo). - Salvare la configurazione "formazione del canale" di nuovo, e quindi fare clic su "Aggiorna" nella macro microscopio. Fai clic su "No" a "Sovrascrivi corrente Lista posizione?", E quindi fare clic su "Start" nella macro microscopio per iniziare la ricetta.
6. Visualizzare la Rete Microfluidic
- Per visualizzare l'idrogel e la rete microfluidica formato dopo la degradazione, chiudere la macro microscopio. Passare alla configurazione "Hydrogel Visualizzazione" per visualizzare la si eosina Yde segnal della idrogel; la rete degradata apparirà scuro.
NOTA: La degradazione idrogel non può essere visualizzato mentre il macro microscopio è in esecuzione. - Per visualizzare la rete microfluidica specificamente, utilizzare la configurazione "Hydrogel Visualizzazione" ad una potenza laser inferiore per consentire l'imaging del fluoresceina introdotto (FITC) destrano -labeled, che ha un segnale luminoso del segnale di eosina Y nativo dell'idrogel.
- Prima di introdurre destrano fluorescente per dissaldare acqua dal pozzo nel idrogel usando tessuti di laboratorio. Pipettare in 10 ml di 5 mg / mL 2.000 kDa destrano FITC-etichettato DI H 2 O (pre-filtrata attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron).
NOTA: Utilizzare qualsiasi destrano dimensionato 2.000 kDa o più grandi per impedire la diffusione nel gel. Se l'imaging per più di 30 minuti, utilizzare una fase incubate con 60% di umidità (o superiore) per prevenire idrogel essiccamento ed evaporazione dell'acqua dalla soluzione destrano marcato con FITC. - Rimuovere l'idrogel unND Petri dal palco e segnare la piastra di Petri per permettere la localizzazione facile della rete vascolare formata durante la sperimentazione in seguito.
Representative Results
Per dimostrare l'attuazione di guidata dalle immagini, il degrado idrogel basata sul laser per generare una rete microfluidica 3D, vascolare-derivato, abbiamo utilizzato una pila di immagini 3D di vascolarizzazione cervello di topo che è stata acquisita tramite acuminate microscopia a scansione (KESM) 26, 27 . Una regione 3D selezionato della maggiore microvascolare set di dati è stata convertita in una serie di maschere virtuali per la formazione della rete microfluidica guidata dalle immagini, come descritto sopra. Dopo la fabbricazione, la rete microfluidica risultante è stato perfuso con una soluzione di FITC-marcato, 2.000 kDa destrano e ripreso tramite microscopia confocale. La pila del sistema vascolare in vivo che definisce l'architettura di rete (Figura 1A e C) e la rete microfluidica fabbricato (Figura 1B e D) sono stati utilizzati per generare Z-proiezioni (Figura 1A e B) e rendering 3D (Figura 1C e D in vivo. La tecnica è suscettibile di fabbricazione di reti contenenti una vasta gamma di diametri; all'interno della Figura 1, sono stati generati canali che vanno da 3.3 al 28,8 micron di diametro. Si noti che la struttura rettangolare grande in alto a sinistra della figura 1B e nell'angolo sinistro di figura 1D è il canale di ingresso per introdurre flusso nella rete.
Figura 1: Microfluidic rete vascolare-Derived. Una serie di maschere virtuali, derivato da una serie di immagini di vascolarizzazione cervello di topo (A e C), sono stati usati per fabricate una rete microfluidica biomimetica 3D incorporato in un idrogel PEGDA (B e D) tramite degradazione guidata dalle immagini, basato su laser. La rete microfluidica è stato perfuso con destrano 2.000 kDa coniugati con fluoresceina e ripreso tramite microscopia confocale. Z-proiezioni (A e B) e rendering 3D (C e D) delle due reti dimostrano la capacità di generare reti microfluidica che ricapitolano la densità, l'organizzazione e l'architettura complessiva del sistema vascolare in vivo. La freccia (D) segna l'ingresso rettangolare creata per introdurre il destrano. La barra della scala rappresenta il 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Abbiamo implementato due metodi, le teste di pressione e pompe siringa, per avviare il fluido Fa basso contenuto di queste reti microfluidica embedded. Ad esempio, un canale rettangolare 30 da 30 micron è stato fabbricato per collegare due pozzi in un idrogel PEGDA micromolded (Figura 2A), con flusso di fluido azionato tramite una testa di pressione 7. Generata in ben sinistra, la testa di pressione indotto flusso attraverso il microcanali e nel pozzo sulla destra. Nella Figura 2A, un fronte iniziale di tetramethylrhodamine (TRITC) -labeled, 70 kDa destrano è stata osservata muove attraverso il canale usando la microscopia time-lapse. Successivamente, nella figura 2B, un diametro di 10 micron sfera polistirene fluorescente scorreva dal pozzo sinistra, attraverso il canale, al pozzo sulla destra. Con la durata del flusso controllato dal volume di fluido presente nel micromolded ben in ingresso, e la portata controllata dal gradiente idrostatico generato tra l'ingresso e di uscita ben, flusso testa-driven pressione in idrogel micromolded fornisce un metodo semplice per il flusso inproduzione, senza la necessità di un involucro esterno o una pompa a siringa.
Figura 2: Pressione Portata Head-Driven in un Micromolded PEGDA idrogel. PEGDA stato micromolded per formare un idrogel contenente due pozzetti collegati da un microcanale incorporato. Una testa di pressione generata in sinistra e di avviare il flusso di TRITC marcato, 70 kDa destrano (A1-A3) e una sfera di polistirolo 10 micron (B1-B3) attraverso un 30 da 30 micron canale rettangolare da un pozzetto al altro. La barra della scala rappresenta il 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
In alternativa, per generare flusso del fluido costante all'interno di reti microfluidica, pompa-driven siringa fbasso può essere iniziata da fotopolimerizzanti l'idrogel all'interno di un dispositivo di microfluidica secondario con le porte di ingresso e uscita per la pompa a siringa interfacciamento. Nella Figura 3A, un dispositivo microfluidico prefabbricato commercialmente disponibile è mostrato con una fascia 1 mm di idrogel photopolymerized tutta la larghezza del dispositivo 7. degrado laser-based è stata implementata per fabbricare canali microfluidica e le reti in idrogel ospitate utilizzando lo stesso protocollo descritto qui per freestanding idrogel. Portata della pompa generata siringa può essere visto in Figura 3B, in cui un canale cilindrico del diametro di 20 micron è stato fabbricato in un idrogel alloggiata in un dispositivo microfluidico. In questo canale diametro di 20 micron, singole sfere di polistirene fluorescenti 2-micron sono facilmente risolti senza flusso di fluido (Figura 3B1), mentre quando viene applicato un 5 microlitri / s portata, le sfere si muovono attraverso il campo di vista, come evidenziato da striature (Figura 3B2 </ Strong>). Questo stesso approccio è stato utilizzato per indurre flusso attraverso una rete vascolare derivato 2D per monitorare il flusso di TRITC marcato, 65 kDa destrano attraverso la rete e diffusione nel idrogel circostante (Figura 3C).
Figura 3: Flusso pompa a siringa-Driven in PEGDA idrogel polimerizzato in alloggiamenti microfluidici. Un dispositivo disponibile in commercio prefabbricati microfluidica (A) con un microcanale 17 x 3,8 x 0,53 millimetri (x, y, z) ospita un photopolymerized 1 x 3,8 x 0,53 millimetri (x, y, z) PEGDA idrogel, indicato dal freccia nera. Un canale cilindrico del diametro di 20 micron è stato degradato attraverso l'idrogel, e sfere di polistirene 2-micron sono stati pompata attraverso il dispositivo (B). Le sfere sono chiaramente risolti senza flusso di fluido (B1), ma appaiono come striature con una portata di 5 ml / s(B2). In un'altra idrogel alloggiata, una rete 2D vascolare derivato è stato fabbricato e TRITC-etichettato, 65 kDa destrano è stata pompata attraverso la rete (C). Time-lapse microscopia è stato utilizzato per monitorare il destrano fluorescente come si riempie i canali e diffusa nelle idrogel circostanti. Frecce bianche in (B) e (C) indicano la direzione del flusso del fluido. La barra di calibrazione (C) indica l'intensità del destrano fluorescente. Le barre di scala rappresentano 20 micron di (B1) e (B2) e 50 micron di (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Critiche nella ignorando le funzioni standard del software microscopio per consentire l'utilizzo di maschere virtuali per la degradazione guidata dalle immagini, basata sul laser, la macro microscopio deve essere messa a punto e manipolato con cura. Come le interfacce software microscopio con la macro microscopio a volte può essere controintuitivo, e molti sforzi sono stati investiti nel determinare le impostazioni ottimali in entrambi i programmi per sviluppare questo metodo. Si consiglia una comprensione generale del laser-scanning di base uso microscopio confocale, in particolare con la "Stage" e le finestre "FOCUS" per la ricerca e il posizionamento del idrogel nelle direzioni x, y, z e dimensioni, prima di tentare la degradazione basato sul laser in modo corretto. Inoltre, la fabbricazione di un canale di ingresso è fondamentale per il protocollo; specie fluorescenti sospese dovranno essere in grado di immettere i sistemi microfluidici per l'imaging di successo e caratterizzazione di rete. È importante notare che questo protocollo si applica a una determinata al laserscansione microscopio confocale configurato con uno specifico laser pulsato a femtosecondi, in esecuzione versioni specifiche del software del microscopio e il microscopio macro (vedi dettagli nella lista delle specifiche Materiali / Equipment). Abbiamo scoperto che le versioni più recenti del macro microscopio non hanno il controllo e la funzionalità necessarie necessarie per il controllo del laser guidata dalle immagini. Mentre altre piattaforme microscopio e sorgenti laser ad impulsi può essere utilizzato, questo protocollo si applica specificamente a questo sistema e dovrà modifica secondo la piattaforma, sorgente laser e software implementato. I principi alla base di tutto questo protocollo si applicano ancora, però.
Un potenziale modifica di questo protocollo comporta la modifica della composizione idrogel. Qui, abbiamo utilizzato 5% in peso, 3,4 idrogel kDa PEGDA, ma il degrado basato su laser (per scopi di parte generazione di rete microfluidica) è stato implementato per degradare sia idrogel sintetici e naturali, tra cui PEGylated fibrinaOgen 21,22, proteine della seta idrogeli 23, e collagene 24. La regolazione della potenza del laser, velocità di scansione, spaziatura tra Z-fette, e il numero di ripetizioni sarà di aiuto nel determinare i parametri ottimali per fabbricare reti microfluidici in altre formulazioni idrogel.
Una corrente di limitazione della tecnica è il volume complessivo di idrogel che può essere degradato in una quantità di tempo fattibile. Per creare vuoti aperti o caratteristiche microfluidica all'interno del idrogel, il laser tempo di sosta deve essere pari o superiore a 8,96 ms / pixel (o di una velocità di scansione laser di 0,021 micron / ms) quando si utilizza una fluenza laser di 37,7 nJ / micron 2. Con queste impostazioni, ci vogliono 1,4 h di degradare vasi all'interno di un volume 0,014 millimetri 3 (come si vede in figura 1). Utilizzando un tempo di sosta laser di 4.48 ms / pixel o inferiore, l'energia erogata non è sufficiente per la piena degradazione della formulazione idrogel usato qui. L'implementazione di un idrogel diversocomposizione potrebbe superare questa limitazione. L'uso di gel fotolabili che contengono componenti sensibili alla luce 34-36 o idrogel che hanno grandi multiphoton sezioni 21-24 sono buone opzioni che permetta l'utilizzo di meno energia e si tradurrebbe in precoce decadimento. Per quanto riguarda le limitazioni dimensionali, caratteristiche sono state fabbricate fino a 1,5 mm di profondità in idrogel 7. Il ottenibile profondità è una funzione della distanza di lavoro dell'obiettivo e può essere aumentata utilizzando obiettivi a distanza di lavoro ultra-lunghi ottimizzati per imaging in vivo. Il più piccolo canale misurata 7 creata usando un 20X (NA1.0) obiettivo ad immersione acqua aveva una larghezza di 3,3 micron e profondità di 8,9 micron, che è alla pari con le dimensioni più piccole canali generati in Figura 1. Mentre altri laboratori hanno utilizzato inferiori obiettivi NA 21,23,24, ci aspettiamo che le reti microfluidica con caratteristiche più piccoli possono essere generati utilizzando altaobiettivi er NA a scapito di una distanza di lavoro ridotta. Infine, tuttavia, la risoluzione della tecnica è una funzione della funzione di diffusione di punto del fascio laser focalizzato, le proprietà di scansione laser, la quantità di energia erogata dal laser, e le proprietà di assorbimento del laser del materiale degradati.
Inoltre, le proprietà laser (velocità, fluenza, la spaziatura tra le maschere virtuali, ed il numero di ripetizioni) devono essere ottimizzate in base alle proprietà idrogel (densità di reticolazione, macromero / peso molecolare del monomero, percento in peso ed il tipo di idrogel: proteina a base sintetica vs. ), in quanto questi intrinsecamente alterare le interazioni con il laser e quindi la soluzione finale del processo. Mentre l'energia erogata è influenzata anche dall'obiettivo utilizzato, l'ottimizzazione aggiuntivo è necessario quando si passa tra gli obiettivi. Per quanto riguarda i costi, è necessario accedere ad un microscopio con un laser pulsato, e mentre molti objec diversitive possono essere usati, quelli con un alto NA e distanza di lavoro (per imaging in vivo) può essere costoso.
Al di là del protocollo dettagliato qui, reti microfluidica generati con questa tecnica possono essere funzionalizzati con peptidi cellula-adesivo post-channel fabbricazione di indurre l'adesione delle cellule endoteliali e la formazione di lumen 7. Inoltre, l'incorporazione di sequenze peptidiche cellule degradabile nel materiale sfuso 9 prima incanalare degrado potrebbe consentire lo studio della migrazione cellulare in e attraverso l'idrogel. Per fluidizzazione continua della rete microfluidica all'interno dell'idrogel, idrogel possono essere photopolymerized in dispositivi o contenitori fluidici più grandi, come dimostrato nelle figure 2 e 3 7.
La generazione di reti vascolari via vascolare o angiogenico autoassemblaggio 8-12 fornisce un approccio diretto per indurre vascularization durante un volume relativamente grande idrogel. Sebbene questo approccio si traduce in reti fluidici perfusable, è difficile controllare direttamente le dimensioni, tortuosità, densità e architettura di rete complessiva. A causa di questa limitazione, il profilo di flusso e velocità di taglio nella vascolatura possono variare tra esperimenti. In alternativa, le tecniche di microfabbricazione 13-16 consentono il controllo diretto sulle architetture di rete, ma sono spesso limitate dalla loro incapacità di generare piccoli, canali capillari dimensioni o la realizzazione di reti dense che imitano in architettura vivo vascolare. Mentre la tecnica di degrado idrogel basato su laser qui delineato è stato recentemente riproposto per la generazione di microfluidica, supera contemporaneamente sia il controllo architettonico e limitazioni di dimensione basata su metodi di microfabbricazione esistenti, consentendo la creazione di reti di microfluidica biomimetici 3D che ricapitolano la densità, tortuosità, gamma di dimensioni, e nel complesso architecture di vascolarizzazione in vivo. Inoltre, più reti fluidici possono essere generati in una singola idrogel, permettendo lo studio dei trasporti inter-rete 7. Per le applicazioni di ingegneria tissutale che si sforzano di replicare più da vicino in processi di trasporto in vivo in vitro, le reti microfluidica idrogel-embedded altamente risolti qui descritte sono adatte. Prevediamo che questo protocollo sarà utile per lo sviluppo di costrutti di tessuto che più accuratamente imitare il trasporto in vivo per l'utilizzo come dispositivi di screening di stupefacenti e in modelli di malattia in vitro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
| LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
| Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
| Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
| Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| 150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
| PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
| Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| 1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
| 3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
| Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
| Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
| 60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
| High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
| Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
| Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
| TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
| Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2,000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4 kDa PEGDA hydrogel |
| 1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
| Acrodisc Syring Filter, 0.2 µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
| sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |
References
- Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
- Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
- Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
- Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
- Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
- Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489 (2013).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
- He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
- Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
- Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
- Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
- Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
- Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
- Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
- Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
- Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
- Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
- Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
- DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
- Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).
