Abstract
В этой рукописи, мы сначала опишем протокол изготовления микрожидком чипа, с золотыми точками и фибронектина покрытием областей на той же стеклянной подложке, которая точно контролирует образование пузырьков тандемных и отдельных клеток узорчатых рядом с хорошо определенными местах и форм. Затем демонстрируют генерацию пузырьков тандеме с использованием двух импульсных лазеров, освещающие пару золотых точек с задержкой по времени несколько микросекунд. Мы визуализировать взаимодействие пузырь пузырь и формирование струи изображений высокой скорости и характеризуют поле результирующего потока с использованием велосиметрии изображения частиц (PIV). И, наконец, мы приведем некоторые применения этого метода для анализа отдельных клеток, включая клеточную мембрану порации с макромолекулы поглощения, локализованной деформации мембраны определяется смещениями присоединяемых интегрином связывания шариков и внутриклеточной реакции кальция из логометрической визуализации. Наши результаты показывают, что быстрый и направленный поток струйное является прообразуемых при взаимодействии тандем пузырь, который может наложить высоколокализованной напряжение сдвига на поверхности клетки, выращенные в непосредственной близости. Кроме того, различные биоэффекты можно индуцировать путем изменения силы потока нагнетаемой регулируя расстояние STANDOFF от кюветы до пузырьков тандема.
Introduction
Существует растущее признание того, что клеточная гетерогенность, возникающие в связи с стохастической экспрессии генов, белков и метаболитов, существует в большой популяции клеток и служит основополагающим принципом в биологии , чтобы позволить адаптации и эволюции 1 клеток. Поэтому часто неточны и ненадежны использовать объемные измерения на уровне всего населения для понимания функции отдельных клеток и их взаимодействий. Разработка новых технологий для анализа одноклеточного поэтому представляет большой интерес в биологических и фармакологических исследований, и может быть использовано, например, чтобы лучше понять ключевые сигнальные пути и процессы в области биологии стволовых клеток и терапии рака 2-4. В последние годы, появление микрофлюидальных платформ в значительной степени облегчает анализ одноклеточного, где позиционирование, лечение и наблюдение ответа от отдельных клеток были проведены с новыми аналитическими стратегиями 5.
Кавитация играет важную роль в разнообразных биомедицинских применений, в том числе при лечении злокачественных опухолей с помощью высокоинтенсивного сфокусированного ультразвука (HIFU) 6, неинвазивный фрагментация камней в почках с помощью ударно - волновой литотрипсии (SWL) 7, лекарственное средство или ген доставки по sonoporation 8, а также недавно сообщили разрушения клеток или тканей с помощью гидродинамического кавитационного пузыря 9,10. Несмотря на это, не были хорошо изучены динамические процессы кавитационного пузырька (ами) взаимодействия с биологической ткани и клетки. Это происходит из-за хаотичности в инициировании и пузырьковых динамики кавитационных производства с помощью ультразвука, ударные волны, и локального гидравлического давления; Кроме того, существует недостаток стимулирующих методов для решения сложных по своей сути и быстрый отклик биологических клеток, особенно на уровне одной клетки.
Из-за этих проблем, это не удивительно, что очень небольшое число исследований было пчелап сообщили исследовать взаимодействия пузырьков клетки в хорошо контролируемых условиях эксперимента. Например, мембрана порации отдельных клеток в суспензии в ловушке 11 и импульсивный большая деформация человеческих красных кровяных клеток 12 были продемонстрированы с использованием лазерных сгенерированных одиночных пузырьков в микроканалов. Последний метод, однако, может производить только очень малую деформацию в эукариотических клетках , из - за наличия ядра 13. Кроме того, трудно контролировать вниз по течению биоэффектов при обработке клеток в суспензии. В других исследованиях, ультразвуковое возбуждение клеток переплете микропузырьков (или ультразвуковое контрастное вещество) для производства мембран порации и / или внутриклеточные реакции кальция в одиночных адгезивных клеток было сообщено 8. Мембрана порации отдельных адгезивных клеток , также могут быть получены при использовании генерируемое лазером пузырьков тандемные в тонком слое жидкости , содержащей светопоглощающий трипанового синего раствора 14, иликолеблющимся газового пузыря , генерируемого микросекунды лазерных импульсов , облучающих через оптически поглощающую подложку в микрокамеры 15. При сравнении оптически поглощающей подложке имеет преимущество по сравнению с лазерным поглощающие -ным раствором трипанового синего, поскольку последний является токсичным для клеток. Что еще более важно, лазерные генерируемые пузырьки более управляемым с точки зрения размера пузырьков и места, чем акустически возбужденных пузырьков. Тем не менее, во всех этих предыдущих исследованиях, форма клеток, ориентация и условия прилипания были не контролируется, что может существенно влиять на клеточный ответ и биоэффектов , полученные с помощью механических напряжений 16.
Для преодоления этих недостатков в предыдущих исследованиях, в последнее время мы разработали экспериментальную систему для образования пузырьков, клетки кучность, пузырь пузырь-клеточных взаимодействий, и в режиме реального времени биоэксперименты клеточного ответа в микрожидком чипа, построенного с использованием уникального сочетания микроструктур техничiques. Три основные черты , которые отличают нашу экспериментальную систему от других в области являются: 1) структурирование микронного размера золотых точек на стеклянной подложке , чтобы позволить локализованное поглощение лазера для образования пузырьков 17; 2) структурирование микронного размера островков внеклеточного матрикса (ЕСМ) для клеточной адгезии на той же подложке, чтобы контролировать как расположение и геометрию отдельных ячеек; и 3) сжатие размерности области взаимодействия пузырь пузырь-клеток из 3D в квази-2D пространства для облегчения в плоскости визуализации пузырьков пузыря взаимодействий, струйное поля течения, деформации клеток, и биоэффектов, все захваченные в один обтекаемый последовательность изображений (рис 1д).
Рисунок 1: Микрожидкостных чипа и схемы различных анализов. а) Собранный Микрожидкостных чип с каналами заполнены синими чернилами для визуализации. б) область внутри микрожидком чипа с узорчатыми клетками и золотыми точками (расстояние между двумя точками золота в непосредственной близости от 40 мкм). Многие пары рабочих блоков могут быть расположены в канале. с) Крупным планом изображение одного рабочего узла , состоящего из пары золотых точек и клетки HeLa прилипшего к области клеточной структуризации. d) Схема работы устройства. Одна ячейка придерживается и распространяется на "Н" -образного острова, покрытого фибронектина. Пара кавитационных пузырьков (тандем пузырь) с анти-фазовых колебаний производятся путем освещения импульсные лазерные лучи на золотых точек (рис 4а), что приводит к образованию быстро и локализованным струи движется в направлении клетки - мишени поблизости. Клетка может быть деформирован, porated для макромолекулярной поглощения, и / или стимулируются с ответом кальция, в зависимости от расстояния зазора , (S г) клетки на тандем - пузырь.F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Эта платформа может быть дополнительно в сочетании с анализами флюоресценции и функционализированных бусинок, прикрепленных к поверхности клетки для кавитационных-индуцированной биоэффектов. В частности, эта платформа открывает путь для надежных и поддающихся количественной оценке анализов на уровне одной клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа тандемной пузыря-индуцированной деформации клеточных мембран, клеток порации и внутриклеточного поглощения, жизнеспособность, апоптоз и внутриклеточного кальция ответ. В следующем протоколе мы опишем процесс изготовления чипа и порядок анализа различных биоэффектов, упомянутых выше. Кроме того, также описаны операции чипа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. микротехнологий
Примечание: Все процедуры микротехнологий выполняются в чистом помещении. Хромированная маска предназначена до микротехнологий, смотри Рисунок 2.
Рисунок 2: Схема конструкции канала в микрожидком чипа и размеры рабочих органов. а) Маска дизайн выровненных микроканалов PDMS (зеленый) и узоры на стеклянной подложке (синий и красный). б) Увеличенное изображение конструкции маски в репрезентативной части рабочего блока массивов. в) схема одного рабочего блока , показывающее конфигурацию ячейки (синий) и пару золотых точек (красный). Все масштабы длины приведены в правом нижнем углу. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть LARGER версия этой фигуры.
- Золотая точка формирования рисунка
Примечание: Площадь каждого из золота точка предназначена быть в пределах 25-30 мкм 2, таким образом , чтобы она была достаточно большой , чтобы поглотить энергию лазера для образования пузырьков, но достаточно малы , чтобы избежать отдельных клеток , прилипшие к нему. Схематическая диаграмма для изготовления золота точка показана на рисунке 3a.- Стекло слайд очистки (в химической капотом)
- Промыть стекло с ацетоном с последующим изопропилового спирта (IPA), а затем высушить его с помощью N 2 потока.
- Замочите слайд в пираньи растворе (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) в течение 10 мин.
- Выньте слайд, промойте его дистиллированной водой, а затем высушить его с помощью N 2 потока.
- Выпекать Предметное стекло на плитке при 120 ° С в течение 10 мин.
- Рассматривать слайд в плазме Ашера при 100 Вт в течение 90 с.
- Спин-покрытие (спин-покрытие капота)
- Включите плитке и подождите, пока температура не стабильна при 95 ° С.
- Выполните процедуру нанесения покрытия:
1000 оборотов в минуту в течение 5 с с / с рампой 500 оборотов в минуту;
то 3000 оборотов в минуту в течение 30 с с / с рампой 1000 оборотов в минуту. - Закрепите очищенное предметное стекло на спин для нанесения покрытий с применением вакуума.
- Покройте поверхность скольжения с P-20 и начать рецепт покрытия.
- Повторите процесс нанесения покрытия для NFR-негативного фоторезиста.
- Выпекать слайд при 95 ° С в течение 60 секунд и подождать, пока она не остынет до комнатной температуры.
- фотолитография
- Установить хромовую маску на маску выравнивателя и убедитесь, что сторона шаблон лицевой стороной вниз в направлении скольжения.
- Установите рецепт фотолитографии в режим жесткого экспозиции с 9 с УФ-облучения и быстро выровнять стеклянную подложку с маской.
- После проведения экспозиции УФ, выпекать слайд на 956 ° С в течение 1 мин, а затем дайте ему остыть до комнатной температуры.
- разработка
- Разработка рисунка на слайде в растворе проявителя в течение 60 с.
- Удалить слайд от разработчика, промойте его дистиллированной водой и высушить его с помощью N 2 потока.
- Проверьте геометрию картины под микроскопом, а также измерить и записать размер элемента.
- Осаждение золота (испарение E-света) и отрыва
- Выпекать слайд при 120 ° С в течение 5 мин и дайте ему остыть до комнатной температуры.
- Очистите слайд с плазмой в машине реактивное ионное травление (РИТ) в течение 90 с при 500 Торр и 100 Вт
- Депозит 5 нм Ti и 15 нм Au на слайд с использованием электронно-лучевой испаритель 17.
- Замочите на ночь слайд в стеклянный стакан, содержащий фоторезиста для удаления растворителя для удаления золота покоится на вершине NFR сопротивляться.
- Получить слайд, на одном уровне ят с ацетоном с последующим ИПС, и высушить его с помощью N 2 потока.
- Сушат слайд на горячей плите при 115 ° С перед очисткой в кислородной плазме Асировой при 100 Вт в течение 90 с.
- Стекло слайд очистки (в химической капотом)
- Молекулярно-сборка структурирование путем отрыва от земли (MAPL)
Примечание: Площадь каждого острова фибронектина покрытием устанавливается в пределах 700-900 мкм 2 для облегчения адекватной клетки HeLa распространения в квадратной области при одновременной минимизации возможности нескольких ячеек агрегировании на острове. Принципиальная схема для получения клеточного кучность островков показана на рисунке 3b.- Спин покрытие
- Повторите шаг 1.1.2, но используют S1813-позитивного фоторезиста и температуру 115 ° С.
- Унифицированные фотолитографии
- Установить хромовую маску на маску выравнивателя и убедитесь, что сторона с рисунком обращена вниз к слайду сзолотых точек.
- Установите рецепт фотолитографии в режим жесткого экспозиции с 9 с УФ-облучения.
- Совместите верхнюю маску с нижней слайда с использованием меток выравнивания, расположенные вокруг края маски, как пространственная привязка.
- Проверьте центральную часть маски и убедитесь, что характеристики модели совмещены правильно.
- Заполните УФ-облучения без пост-выпекать.
- разработка
- Повторите шаг 1.1.3 , но с 45 с разработки перед сушкой на плитке и сохранения в памяти N 2.
- Спин покрытие
- химическая обработка
- Приготовьте раствор пассивирующий: 0,5 мг / мл ФАПЧ-г-ПЭГ в 10 мМ HEPES-буфере.
- Получить слайд из хранилища N 2 и очистить его с помощью RIE с установкой параметра: 500 мм рт.ст. давление, 100 Вт мощности и 90-х годов продолжительность.
- Пипетка одну каплю раствора пассивирования на кусочек парафиновой пленки. </ Li>
- Сэндвич раствора с пленкой и слайде, убедившись, что сторона с рисунком признаков лицевой стороной вниз в направлении пленки; Во избежание образования пузырьков.
- Подождите в течение 45 минут перед удалением слайд из фильма.
- Замачивание слайд последовательно в фоторезиста удаления, удаления фоторезиста и DI воды (1: 1), и деионизованной воды, и перемешивать ее в ультразвуковой ванне в течение 90 с для каждого растворения грязи.
- Сушат предметное стекло на плитке, чтобы удалить влагу перед пломбированием ее в эксикаторе и хранить его в холодильнике.
- Чип сборки
- Повторите шаги 1.1.1-1.1.4, но с SU8-2025-негативного фоторезиста и настройки параметра , упомянутого называется протоколом MICROCHEM 18, чтобы подготовить силиконовую форму с фотошаблона.
- Изготовить микроканале PDMS (40 мм х 25 мм х 5 мм, Д х Ш х В) и небольшой PDMS (сляб мкм шириной структуры паз 800), используя мягкую литографию.
- Пробейте microchanneл для портов доступа жидкости и очистить его с лентой, а затем с АПИ.
- Щит узорный участке стеклянной подложки с плитой PDMS, и применять RIE (100 Вт, 500 мТорр, 60 лет), чтобы удалить ФАПЧ-G-ПЭГ из периферийной области.
- Лечить Микроканал с уменьшенной дозой РИТ (25 Вт, 500 мТорр, 25 с), а затем привести его к узорчатой стеклянной подложке (с небольшой PDMS плиты удалены); принести Микроканал и узорчатое стекло подложки в конформной контакте под стереоскоп.
Рисунок 3: Принципиальные схемы для микротехнологий и чип - сборки. а) Структура золотых точек на стеклянной подложке. б) Получение стеклянной подложки для клеток кучность через MAPL. в) Сборка микрожидкостных канала с плазменной сварки. Смотрите список материалов для определения ое сокращений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- прикрепление клеток
Примечание: HeLa клетки обычно поддерживают в среде DMEM, дополненной 10% FBS и 1% / антимитотическому раствором антибиотика в культуре клеток инкубаторе. Принципиальная схема для сборки стружки и клеточного прикрепления показан на рисунке 3в.- Заливка чип с PBS в течение 30 мин при 1 мкл / мин, а затем влить раствор фибронектина (50 мкг / мл в PBS, 1 мкл / мин) в течение 45 мин.
- Во время ожидания, Trypsinize культуры клеток с 0,25% трипсин-ЭДТА, промойте их в культуральной среде, центрифужные отдельных клеток, и восстановить суспензии клеток в предварительно нагретом (37 ° С) культуральной среде при 5x10 6 клеток / мл.
- Заменить фибронектин раствора PBS и промывать чип при 10 мкл / мин в течение 5 мин.
- впрыскиватьПриготовленную суспензию клеток в чип, остановить поток, зажимать выходное отверстие, и поддерживать чип в культуре клеток инкубаторе в течение 30 мин.
- Освободить выходное отверстие и промывать чип с клеточной культуральной среде при 10 мкл / мин в течение 5 мин. Уменьшить скорость потока перфузионного культуральной среды до 0,75 мкл / мин и поддерживают культуру клеток в течение 2 ч в инкубаторе.
2. Поколение пузыря и визуализации потока
Примечание: Схема экспериментальной установки показана на рисунке 4а для генерации тандема пузырьков и взаимодействие полученного потока с одной клетки , выращенного рядом в микрожидком канале.
- Генерация тандема пузырьков с двумя лазерами и управление синхронизацией
- Поместите микрожидкостных чип на сцене инвертированного микроскопа и выравнивать фокусов двух импульсных Nd: YAG лазеров (λ = 532 нм, 5 нс длительность импульса) на паре узорчатых золотых точек разделенных Ьу 40 мкм.
- Используйте генератор цифровой задержки для запуска двух лазеров с временной задержкой около 2,5 мкс, чтобы произвести два пузырька, инициированные на золотых точек.
- Регулировка выходной мощности лазера энергии (~ 10 мкДж), чтобы произвести максимальный диаметр пузырьков в пределах 50 ± 2 мкм.
- Синхронизировать камеру высокоскоростной (экспозиции 200 нс и 2 миллиона кадров в секунду (FPS)) для лазеров и захватить динамику расширения пузыря, коллапс, взаимодействие пузырь пузырь и формирования струи.
- Количественное скорости струи
- Записывают положение струйного наконечника (J 1) на проксимальном конце первого пузырька (В 1) и дистальным концом B 1, начиная с генерации второго пузырька (B 2) и заканчивая приземлением из J 1 по направлению к дистальному концу B 1; см схему на рисунке 5а.
- Линейно подходят временной ход позиции для ботач проксимальный (струйного наконечника) и дистальные концы. Вычислить наклон положения зонда в зависимости от кривой времени для проксимального конца, чтобы определить скорость струи. Пересечение двух линий указывает время струи приземления. Более подробную информацию можно найти в работе 19.
- Визуализация поля потока пузырьков индуцированный тандем
- Готовят 1 мкм из полистирола (PS) суспензионной в деионизированной воде (2,6% вес / объем) и вводят шарики в микрожидком микросхеме.
- Генерация пузырьков в тандеме, как описано в шаге 2.1.1-2.1.3.
- Запишите динамику тандема пузырь с помощью камеры высокоскоростного видео со скоростью формирования кадров 5 кадров в секунду M с временем экспозиции 100 нс.
- Загрузить полученную последовательность изображений в коммерческое программное обеспечение PIV.
- Разделите каждое изображение на более мелкие допроса окна размером 16 х 16 пикселей (точек) с 75% перекрытием.
- Применить многоходовую итерацию и региональные фильтры, чтобы уменьшить ошибки в вычислении поля скоростей ивыводить результаты в вектор скорости карты.
Рисунок 4: Схема экспериментальной установки и записи изображения. а) Экспериментальная установка для генерации тандем пузыря. б) последовательность времени , используемый для различных типов приобретениям изображений. FL: флуоресцентная микроскопия, BF: светлое поле, IFT: межкадрового время. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
3. Одноклеточный Анализ и биоэффекты
Примечание: Тандем пузырь производится рядом с клетками-мишенями, и полученные биоэффекты изучаются в тупике расстояния-зависимым образом. Последовательность времени для различных типов изображений приобретений изображен на рисунке 4b.
- Мембрана порации и макромолекулярная поглощение
Примечание: Поглощение внеклеточных макромолекул в клетку-мишень характеризуется прогрессирующей диффузии йодида мембранного impermeant пропидиума (PI) через сайт порации на клеточной мембране.- После стадии 1.5, заменить обычный культуральной среды (то есть, DMEM) с раствором PI (100 мкг / мл в DMEM) , работающей при скорости потока перфузионной 0,5 мкл / мин в течение всего эксперимента.
- Программирование программного обеспечения управления микроскоп для автоматического выбора PI флуоресцентного куб на вращающейся турели и синхронизировать синхронизацию ПЗС-камеры с PI возбуждения флуоресценции для захвата флуоресцентные изображения с временем экспозиции 200 мс.
- После того, как два лазерных фокусы совмещены с парой золотых точек рядом с клеткой-мишенью, записывать как светлого поля (BF) и флуоресценции (FL) изображений до лечения тандем пузыря.
- С помощью программного обеспечения управления микроскопом немедленноначать замедленную запись флуоресцентного изображения клетки-мишени вскоре после того, шаг 2.1, чтобы захватить историю поглощения PI.
- Мембрана деформация
- Готовят 1 мкм бусин (1% вес / объем, активированные с растворимой в воде карбодиимида) и функционализации их с пептидом-2000 (100 мкг / мл в PBS).
- После стадии 1.5, инкубировать прикрепленные клетки с функционализованной бусинок при плотности 1x10 9 бусин / мл при 37 ° С в течение 30 мин.
- Повторите шаг 2.1 для создания пузырьков в тандеме рядом с клеткой-мишенью и записывают деформацию клетки с камерой сверхвысокой скоростью работает со скоростью кадрирования 5 миллионов кадров в секунду.
- Идентифицировать триаду 3 бусинок , которые остаются на плоскости формирования изображений в течение всего эксперимента и обобщать их позиции в виде (х 1, у 1) (X 2, Y 2), и (х 3, у 3) в эксперименте координатах.
- Вычислить площадь триады до и афTer лечение тандем пузырьков с использованием формулы:
- Вычислить напряжение области, как:
- На основании координат трех вершин до и после обработки пузыря тандем, вычислить локальный главной деформации и зоны деформации в соответствии с установленными протоколами 20,21.
- Жизнеспособность и апоптозом
Примечание: FITC аннексина V маркирует клетки, в том числе апоптотических из них, через экстернализации фосфатидилсерина (зеленой флуоресценции). PI метки ядер некротических клеток (красная флуоресценция). Светлое поле изображения используется для документирования морфологии клеток и для оказания помощи в выявлении жизнеспособности клеток и апоптоз.- Запишите положение каждой обработанной клетки в микрожидкостных канале ( при содействии адресных меток в канале, рис 2b
- Выдержите обработанных клеток в клеточной культуральной среде в течение еще 2 ч до перфузируя чип с раствором ФИТЦ аннексина V в течение 15 мин. Положительные клетки отобразить зеленую флуоресценцию.
- Повторите шаг 3.3.2 через 24 ч после обработки тандемной пузыря для изучения долгосрочных биоэффектов в клетках-мишенях.
- кальциевый ответ
- Смешайте 3 мкл фура-2 AM маточного раствора (1 мг / мл в ДМСО) с 3 мкл 10% вес / об Pluronic F-127 в 500 мкл среды уменьшенной сыворотки для получения конечного раствора маркировка (6 мкМ).
- После стадии 1.5, заменить среду для культивирования клеток с раствором маркировки и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 40 мин (1 мкл / мин скорость перфузии).
- Залейте канал с пониженным сыворотки среде (0,75 мкл / мин скорость перфузии) перед началом эксперимента клетки.
- Начало логометрические изображений (длина волны: 340/380 нм, 50-мс экспозиции)клетки-мишени с использованием коммерческой системы PTI.
- После того, как 10 с логометрической визуализации клетки на уровне покоя, производят пузырьки в тандеме, как на стадии 2.1; Первая запись с временем межкадрового (IFT) 0,1 с в течение 1 мин, а затем увеличить IFT до 1 с в течение еще мин, а затем увеличивается до 5 с через 2 мин.
- С помощью программного обеспечения PTI, чтобы вычислить отношение R = F340 / F380 в интересующей области (ROI), который пропорционален концентрации внутриклеточного кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрожидкостных платформа описана в этой работе, может быть использован для изучения пузыря пузырь взаимодействий и анализировать различные кавитационных индуцированных биоэффектов на уровне одной клетки. Здесь мы приведем несколько примеров, демонстрирующих различные экспериментальных исследований и биопробы, которые могут быть выполнены в нашей экспериментальной системе. Сначала мы иллюстрировать переходные взаимодействия пузырьков тандеме с формирования струи, визуализации поля результирующего потока, а при вычислении скорости струи (рис 5а). Затем мы приведем примеры тандемной пузыря индуцированных локализованной деформации клеточных мембран (рис 5б), точно определили мембраны порации с поглощением PI (рис 5в) и внутриклеточной реакции кальция (рис 5б). Другие примеры, такие как жизнеспособность клеток и апоптоз анализов, можно найти в ссылке 22.
рисунке 5а показан пример пузырьковой взаимодействия тандеме с формирования струи, захваченного изображения высокой скорости, и поле результирующего потока выявленной PIV. В частности, после его максимального расширения, коллапс первого пузырька B 1 (производимого на 0 мкс) искажается асимметрично быстрым расширением второго пузырька B 2 (производимого на 2,5 мкс), что приводит к образованию "вверх" жиклер (J 1) в 3,4 мкс и последующий поток струйное, показанный на 5,4 мкс. Средняя скорость струи определяется наклоном подогнанной линии для положения проксимального конца (или полюса) из B 1 до приземление (то есть, контакт с дистальным концом B 1) в зависимости от времени. Средняя скорость струи обнаружено увеличение от 20 до 58 м / сек , когда максимальный диаметр B 2 возрастает от 40 до 60 мкм. На основании результатов анализа PIV, направленного потока нагнетаемой вокруг TANDEM пузырь составляет порядка 10 м / с и ограничена в пределах шириной порядка 10 мкм. Таким образом, способен производить импульсное и локализованное напряжение сдвига и градиентом напряжений на клетки-мишени, выращенной поблизости.
Другой пример показан на рисунке 5b показана деформация клеточной мембраны , индуцированное направленным и локализованным струйного потока производимого тандемом пузырьков на расстояние S зазора , D = 40 мкм. Деформация мембрана и восстановление подсвечиваются смещением функционализированного шарика (обозначенный желтой пунктирной линией), прикрепленной к передней кромке мембраны клетки. Местный штамм площадь можно вычислить из координат триады соседних бусин. Схема максимального расчетного изменения площади в различных местах на поверхности клеток показана в середине. Передний край в первую очередь растягивается (см зеленые кружки), в то время как на задней кромке или LatEral стороны ячейки сжимаются (как показано красными кругами), что указывает на гетерогенность клеточной деформации производимого тандемный пузырь индуцированного потока нагнетаемой. Изменение во времени деформации зоны на переднем крае клеток показано справа. Она состоит из нескольких быстрых колебаний в начале, а затем большой и устойчивый протяжения в течение примерно 100 мкс (FWHM) и последующего постепенного восстановления в масштабе времени нескольких мс.
Кроме того, большая деформация площадь и деформация интеграл в клетки передней кромки могут быть ответственны за клеточную мембрану порации , наблюдаемой при малых и D, как показано на Рисунок 5в. При малых S D (т.е. 10 мкм, а в некоторых случаях, 20 мкм) , и промежуточное соединение S D (то есть, большинство 20 и 30 мкм), локализованное разрушение мембраны индуцируется, что приводит к поглощению заострить внеклеточного PI вцитозоль. Если интенсивность PI внутри клетки продолжает увеличиваться без насыщения, происходит некроз. Для сравнения, если интенсивность ПИ на порядок ниже и достигает плато в течение 10 секунд после обработки пузыря тандем, ремонтоспособно порации с выживанием клеток вероятно будет происходить, что дополнительно подтверждается минимальным изменением морфологии клеток. При больших S D (т.е. 40 мкм), ничтожна поглощение ПИ найдены следующие тандемной обработки пузырьков, что указывает на незначительное или вообще не порации. Клетка может выжить с регулярного роста и пролиферации 22. В целом, результаты показывают четкий переход в ответ клеток от некроза, через восстанавливаемого мембраны порации, к не-порации в диапазоне S d ≈ 20-40 мкм.
Наконец, показано, результаты радиометрического визуализации внутриклеточного кальция ответа, вызываемого пузырьками тандем в отдельных клетках в различных Sд, особенно в диапазоне сублетальные S D = 30-50 мкм (рис 5г). Отношение интенсивностей пропорционально количеству внутриклеточного кальция. При малых S D (т.е. 30 мкм или, в некоторых случаях, 40 мкм), волна кальция , идущий от передней кромки к задней кромке отчетливо наблюдается в течение нескольких секунд после обработки тандемной пузыря. После того, как внутриклеточный кальций достигает пиковой концентрации, он распадается медленно обратно до уровня покоя в течение нескольких минут. В отличие от этого , при больших S D (то есть, большинство 50 мкм, а в некоторых случаях, 40 мкм), увеличение внутриклеточного кальция намного мягче, и не ясно видна бегущая волна кальция не может быть идентифицирован. Эти две различные реакции кальция также можно отличить от их соотношения интенсивностей в сравнении временных профилей, с существенными различиями в пиковой амплитуды отношения интенсивностей и времени нарастания от уровня покоя до пикастоимость. При еще большем S D (т.е. выше 60 мкм), никакого ответа кальция не наблюдается. Процент клеток HeLa , отображающих реакции кальция при различных S D приводится на рисунке 5d (справа).
В целом, наши результаты показали , что, изменяя силу потока нагнетаемой (или изменение S д), различные биоэффектов могут быть произведены в отдельных клетках HeLa при аналогичных условиях культивирования, которые, вероятно , коррелировал с амплитудой и длительностью механической деформации , наложенного на клеточной мембране 22.
Рисунок 5: Результаты тандем пузыря взаимодействия, клеточной мембраны деформации, мембраны порации и анализов реагирования кальция. а) движение жидкости и струииндуцируется взаимодействием тандем пузыря. Слева: Отдельные кадры показывая тандем пузырь взаимодействия с формирования струи и поля, выявленные PIV потоком. Максимальные диаметры двух пузырьков примерно 50 ± 2 мкм. Средний: Схема пузырьков струйное тандем, иллюстрирующей центральную ось, начало координат (о), а также ближним и дальним концами (или полюсами) первого пузырька B 1. Справа: Измеряется поулов (с погрешностью ± = 1 мкм) на ближнем и дальнем конце B 1. б) клеточных мембран деформации. Слева: желтая пунктирная линия этикетки водоизмещение PS бусинки, прикрепленной к передней кромке мембраны клетки, что указывает на локальную деформацию мембраны и восстановление. Средний: схематическое изображение площади пика растяжений в разных местах на поверхности клеток, показанных на левой стороне. Справа: Временные курсы штаммов области в середине передней кромки клеток. Δ ε является площадь деформации , рассчитанные барельефаред на главных деформаций и Д Д это область деформации вычисляется на основе триады изменения геометрии. Более подробную информацию о расчете деформаций площадь и анализа ошибок описаны в справочном 22. с) клеточных мембран порации. Слева: светлое поле изображения до и после обработки тандемной пузыря и покадровой флуоресцентных изображений поглощения PI (0 и 120 с). Белые стрелки указывают направление потока струйное. Средний: типичное изменение средней интенсивности ПИ в зависимости от времени внутри клеток. Справа: Статистические результаты процент клеток , подвергающихся некрозу (красный), ремонтопригодная порации (синий), и не-порации (зеленый) при различных S D. Количество клеток , обработанных N = 9, 14, 14, и 8 для S D = 10, 20, 30, и 40, соответственно. Статистическая погрешность составляет ± 1 / √ N. d) внутриклеточный ответ кальция. Слева: последовательности логометрических изображений, показывающие внутриклеточные реакции кальция индивидуальной клеткиs в S г 30 мкм и 50 мкм. Красные стрелки указывают направление струи. Средний: типичные профили отклика (кривые соотношения времени) при различных S д. Справа: вероятность ответа кальция при различных S д. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Противостояние расстояние (S d) (мкм) | Число Рейнольдса (Re) | усредненное напряжение сдвига (Па) в плоскости уг |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163.85 | 323,61 |
| 60 | 105.08 | 42.21 |
Таблица 1: Список параметров для физики потока из результатов PIV. Расчетное число Рейнольдса и усреднены напряжения сдвига относительно различных расстояний (S стойками под г). Плоскость YZ относится к ширине канала х высота плоскости. Усредненное напряжение сдвига оценивается с высоты от 0 до 7,7 мкм от дна канала, так как высота ячейки в канале составляет около 6-7 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ Одноклеточный, в сочетании с изображениями живых клеток, значительно расширило наше понимание динамических и часто переменных процессов в отдельных клетках, таких как развитие фенотипа и иммунного ответа 23. В отличие от обычной клеточной культуры, в блюдах или баллонах, микрофлюидальные системы позволяют точно контролировать микросреды, вплоть до уровня одноклеточного, в реальном времени. Следовательно, прогресс в микрожидком технологии и методы в значительной степени улучшили пропускную способность и воспроизводимость анализа одноклеточных. Объединяя мягкую литографию и поверхностную кучность, микрофлюидальные системы могут быть дополнительно разработаны для облегчения углубленного анализа ответа единственной клетки к сложных моделей spatiotemporally переменных стимулов. Например, переходные химические или механические сигналы были успешно доставлены в одиночных камерах в то время как их биологические или механические ответы были автоматически записаны и проанализированы 24. Несмотря на эту общую тенденцию, применение микрофлюидики к анализу кавитационные индуцированных биоэффектов на клеточном уровне было очень ограничено. В частности, она применялась только к пузырьковой индуцированный мембраны порации отдельных клеток в суспензии захваченных микростолбиков 11. В большинстве исследований по прилипшие клетки, польза от контроля морфологии клеток для поддержания стабильности в динамических взаимодействий Пузырь-клеток либо отсутствует, либо в значительной степени игнорируется.
Мы разработали микрожидкостных систему, чтобы точно контролировать начало, последующее расширение и динамики схлопывании кавитационных пузырьков; Пузырь-пузырь взаимодействия с формирования струи; и форма клеток, ориентация, шаблон адгезии и Противостояние расстояние от пузырьков, что позволяет воспроизводимым потока нагнетаемой должны применяться к отдельным клеткам в хорошо контролируемых экспериментальных условиях. Этот роман Микрожидкостных система идеально подходит для проведения фундаментальной улudies на кавитационном пузырьке (ами) -клетка взаимодействия, которые имеют отношение к разнообразных терапевтических ультразвуковых применений, таких как SWL, HIFU и sonoporation. Мы показали, что наша Микрожидкостных система может быть использована для исследования различных кавитационных индуцированных биоэффектов, в том числе деформации клеточной мембраны, мембраны порации, жизнеспособность и кальциевый ответ, в более контролируемым и воспроизводимым способом. В частности, направленное струйное поток производства пузырьков тандем позволяет исследовать механические свойства и кальция ответ в отдельных клетках при воздействии высоких штаммов-ставок, которые не были хорошо охарактеризованы. Локализованный, импульсивное механических напряжений в результате такого потока нагнетаемой не может быть достигнуто с помощью обычных методов , простирающихся, такими как микропипетки аспирации 25 и использование оптических 26 и магнитных пинцетов 27. Кроме того, в отличие от предыдущих исследований с использованием ультразвуковых контрастных агентов 8,28-30 или лазер-индуцированной одного бушельbbles 31,32, наша Микрожидкостных система обеспечивает лучший контроль геометрии клеток и адгезии условий, тем самым уменьшая их существенное влияние на клеточный ответ и биоэффектов 16.
В то время как наш метод является надежным и воспроизводимым, необходимо следовать протоколу осторожно, чтобы гарантировать, что экспериментальная система точно воспроизводится. Качество поверхности кучность в микроканале в первую очередь отвечает за воспроизводимости пузырь пузырь-клеточных взаимодействий и каскадом вниз по течению биоэффектов. Например, для клеток HeLa, площадь каждого золота точка должна быть в пределах 25-30 мкм 2 , чтобы обеспечить стабильное образование пузырьков, предотвращая клетки слипание. С другой стороны, площадь каждого острова фибронектина покрытием должна быть около 700-900 мкм 2 , чтобы облегчить адекватное распространение одной клетки в квадрате, уменьшая вероятность нескольких клеток , образующих агрегаты на острове. центровкамежду золотыми точками и фибронектин покрытием островков должны быть точно выполнена с помощью маски выравнивателя, чтобы сохранить угловой ошибки в пределах 1 ° и осевой погрешностью в пределах 0,5 мкм. Кроме того, эта экспериментальная система обеспечивает универсальность в мониторинге ряд событий, с их временной шкале изменялась на несколько порядков (например, динамики пузырька: мкс, деформация ячейки: мс, мембрана порации: S, апоптозу: ч). Поэтому важно, чтобы точно контролировать время получения изображения и записи каждой последовательности с помощью тонкой настройки сигналов триггеров (управляемый генератором цифровой задержки). Одноклеточного культура должна быть в хорошем состоянии в микроканале, чтобы минимизировать изменение клетки к клетке в фенотипу (в основном упоминается как морфологии). Поэтому, как минимум 2-часовой инкубации требуется для прикрепления клеток и распространения на островах, прежде чем приступить к обработке вниз по течению клеток. Рекомендуется всегда держать скорость потока в microchannЕ.Л. под 3 мкл / мин, таким образом, что при сдвиге потока напряжений производится циркулирующей культуральной среды на клетки находится в пределах физиологической нормы.
Один ограничение тока нашей техники является то, что тандем пузырь взаимодействия и струйное поток результирующая может быть применен только к клетке-мишени один раз, так как золотые точки будут абляции лазерным облучением. Этот недостаток ограничивает возможности нашей экспериментальной системы, чтобы имитировать биоэффектов произведенные терапевтического ультразвука, где клетки часто подвергаются кавитационных событий. Тем не менее, это временное ограничение может быть облегчена путем применения другой тонкий слой диоксида кремния для защиты золотых точек от прямого воздействия в жидкости 15. В целом, наша Микрожидкостных система предлагает хорошо контролируемых экспериментальных условиях для исследования биоэффектов, произведенные из кавитационного пузырька (ами) -клетка взаимодействий и имеет несколько уникальных особенностей. Во-первых, как размер и расположение кавитационных пузырьков в нашем еxperimental системы можно точно контролировать путем регулировки энергии падающего лазерного поглощаемой золотыми точками. Во-вторых, геометрия и адгезии отдельных клеток стандартизированы клеток кучность, чтобы минимизировать их влияние на ответы клеток и биоэффектов, что приводит к более воспроизводимых результатов. В-третьих, параллельные рабочие блоки в микрожидком конструкции чипа делают возможным изучать вниз по течению биоэффектов, такие как рост клеток, пролиферации и экспрессии генов, потенциально, после воздействия кавитации, так как каждая ячейка может рассматриваться и контролироваться индивидуально. Таким образом, наша Микрожидкостных система и методология создания надежных пузырь пузырь взаимодействия для изучения биоэффектов отдельных клеток с улучшенной точностью.
Наш текущий чип предназначен для анализа отдельных клеток HeLa. Тем не менее, модификация узора островов для других клеточных линий млекопитающих, также возможно. Некоторые улучшения могут быть сделаны для дальнейшего расширения аппликацийнс микросхемы. Например, заменители молекул ФАПЧ-г-PEG можно было бы изучить, чтобы остановить отдельные узорных клетки мигрировать даже после 24 ч. Кроме того, новые конструкции чипа с микрофлюидальных клапанов могут быть изучены для управления микроокружения клеток, так что химические вещества, такие как маркеры флуоресцентных или токсичных реагентов будут применяться только к определенному местоположению, не влияя на клетки в других регионах чипа , С помощью этих усовершенствований, Микрожидкостных система, представленная здесь, может предоставить возможности для изучения долгосрочных биоэффектов одиночных клеток, таких как обмен веществ, сегрегация, дифференцировки и экспрессии генов, после воздействия кавитации или механических раздражителей, полученных импульсным потоком.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al.
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H.
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
