Abstract
In diesem Manuskript beschreiben wir zunächst das Herstellungsprotokoll eines mikrofluidischen Chips, mit Goldpunkten und Fibronektin-beschichteten Bereichen auf dem gleichen Glassubstrat, das mit gut definierten Positionen und Formen strukturiert, um die Erzeugung von Tandem-Blasen und einzelnen Zellen steuert genau in der Nähe. Wir zeigen dann die Erzeugung von Tandem-Blasen, die durch die Verwendung von zwei gepulste Laser ein Paar von Goldpunkten mit ein paar Mikrosekunden Zeitverzögerung zu beleuchten. Wir visualisieren die Blase-Blase Interaktion und die Strahlformung von Hochgeschwindigkeitsaufnahmen und zu charakterisieren, die sich ergebende Strömungsfeld mit Particle Image Velocimetry (PIV). Schließlich präsentieren wir einige Anwendungen dieser Technik für Einzelzellanalyse, einschließlich der Zellmembran Fungs mit Makroaufnahme, lokalisierte Verformung Membran durch die Verschiebungen der angeschlossenen Integrin-bindenden Perlen bestimmt, und die intrazelluläre Calcium-Reaktion von ratiometrisches Imaging. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine schnelle und direktionale Strahlstrom produced durch die Tandem-bubble-Interaktion, die eine stark lokalisierte Scherbeanspruchung auf der Oberfläche einer Zelle in der Nähe gewachsen auferlegen kann. Darüber hinaus können verschiedene Bioeffekte durch Änderung der Stärke des Strahlflusses von der Zelle durch Einstellung der Arbeitsabstand zu den Tandemblasen induziert werden.
Introduction
Es gibt eine wachsende Erkenntnis , dass zellulärer Heterogenität, aus dem stochastischen Expression von Genen ergeben, Proteinen und Stoffwechselprodukten , innerhalb einer großen Zellpopulation vorhanden ist, und dient als ein grundlegendes Prinzip in der Biologie zur Zell Anpassung und Evolution 1 zu ermöglichen. Daher ist es oft ungenau und unzuverlässig populationsbasierten Massenmessungen verwenden, um die Funktion der einzelnen Zellen und deren Wechselwirkungen zu verstehen. Die Entwicklung neuer Technologien für die Analyse Einzelzelle ist daher von großem Interesse in der biologischen und pharmakologischen Forschung und kann verwendet werden, beispielsweise, um besser auf die Schlüsselsignalwege und Prozesse in Stammzellen Biologie und Krebstherapie verstehen 2-4. In den letzten Jahren hat die Entstehung von Mikrofluidik - Plattformen stark Einzelzellanalyse erleichtert, wobei die Positionierung, Behandlung und Beobachtung der Reaktion von einzelnen Zellen haben 5 mit neuartigen Analysestrategien durchgeführt.
Cavitation spielt eine wichtige Rolle in einem breiten Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich der Behandlung von Krebserkrankungen durch hochintensiven fokussierten Ultraschall (HIFU) 6, die nicht-invasive Fragmentierung von Nierensteinen durch Stoßwellen - Lithotripsie (SWL) 7, Drogen- oder Genübertragung durch Sonoporation 8 und die vor kurzem berichtet Zerstörung von Zellen oder Geweben durch hydrodynamische Kavitation bubble 9,10. Trotzdem haben die dynamischen Prozesse der Kavitationsblase (e) Wechselwirkungen mit biologischen Gewebe und Zellen nicht gut verstanden worden. Dies ist wegen der Zufälligkeit in Kavitation Initiierung und Blasendynamik durch Ultraschall erzeugt, Stoßwellen und lokalen Hydraulikdruck; Des Weiteren gibt es einen Mangel Techniken ermöglicht, die von Natur aus komplex und schnelle Reaktionen von biologischen Zellen zu lösen, vor allem auf der Ebene einzelner Zellen.
Aufgrund dieser Herausforderungen ist es nicht verwunderlich, dass nur sehr wenige Studien haben Bienen berichtet Blase-Zell-Wechselwirkungen unter gut kontrollierten experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Zum Beispiel Membran Fungs einzelner Zellen in Suspension 11 eingefangen und die impulsive große Verformung von menschlichen roten Blutkörperchen 12 wurden unter Verwendung von lasererzeugten einzelnen Blasen in mikrofluidischen Kanälen gezeigt. Die letztere Technik kann jedoch produzieren nur sehr geringe Deformation in eukaryotischen Zellen aufgrund des Vorhandenseins des Kerns 13. Außerdem ist es schwierig, stromabwärts Bioeffekte zu überwachen, wenn die Zellen in Suspension zu behandeln. In anderen Studien Ultraschallanregung eines zellgebundenen Mikrobläschen (oder Ultraschall - Kontrastmittel) zur Herstellung von Membran Porenbildung und / oder die intrazelluläre Calciumreaktionen in einzelnen anhaftenden Zellen wurde 8 berichtet. Membranfungs einzelner anhaftender Zellen können auch mit lasererzeugten Tandem - Blasen in einer dünnen Flüssigkeitsschicht , die lichtabsorbierende Trypanblaulösung 14 hergestellt werden, oderdurch eine oszillierende Gasblase durch Mikrolaserpulsen bestrahlt wird durch ein optisch absorbierenden Substrat in Mikrokammern 15 erzeugt. Im Vergleich hat das optisch absorbierende Substrat einen Vorteil gegenüber dem Laser absorbierendes Trypan-Blau-Lösung, da diese auf Zellen toxisch ist. Noch wichtiger ist, sind Laser erzeugten Blasen kontrollierbarer in Bezug auf die Blasengröße und Lage als akustisch angeregten Blasen. Dennoch in allen diesen früheren Studien, die Zellform, Orientierung und Haftbedingungen wurden nicht kontrolliert wird , die im wesentlichen die Zellantwort und Bioeffekte durch mechanische Spannungen 16 erzeugt beeinflussen.
Um diese Nachteile in früheren Studien zu überwinden, haben wir vor kurzem ein experimentelles System zur Blasenerzeugung, Zellmusterungs, bubble-bubble-Zell-Wechselwirkungen, und Echtzeit-Bioassays von Zellantwort in einem mikrofluidischen Chip aufgebaut unter Verwendung einer einzigartigen Kombination von Mikrofabrikations techn entwickelteniques. Drei Hauptmerkmale , die unsere experimentellen System von anderen in dem Feld zu unterscheiden sind: 1) das Strukturieren von Mikrometergrße Goldpunkte auf dem Glassubstrat lokalisierte Laserabsorptions für Blasenerzeugungs 17 zu ermöglichen; 2) das Strukturieren von Mikrometergrße Inseln extrazellulären Matrix (ECM) für die Zelladhäsion auf dem gleichen Substrat zu steuern, sowohl die Lage und Geometrie der einzelnen Zellen; und 3) die Kompression der Abmessung der Blase-bubble-Zell-Interaktionsdomäne von 3D auf einer quasi-2D-Raum in der Ebene zu erleichtern Visualisierung von bubble-bubble-Wechselwirkungen Strömungsfelder Jetting Zelldeformation und Bioeffekte alle erfasst in eine rationalisierte Bildgebungssequenz (Abbildung 1d).
Abbildung 1: Die Mikrofluidik - Chip und schematische Darstellungen von verschiedenen Assays. a) Gebaute Mikrofluidik - Chip mit Kanälen mit blauer Tinte gefüllt für die Visualisierung. b) Ein Bereich innerhalb des mikrofluidischen Chips mit gemusterten Zellen und Goldpunkten (der Abstand zwischen den beiden Goldpunkte in der Nähe von 40 & mgr; m). Viele Paare von Arbeitseinheiten können in einem Kanal angeordnet werden. c) Close-up Bild einer einzigen Arbeitseinheit , bestehend aus einem Paar von Goldpunkten und einer HeLa - Zelle zur Zelle Strukturierungsbereich geklebt. d) Schematische Darstellung des Gerätebetriebs. Eine einzelne Zelle hält sich an und breitet sich auf dem "H" -förmigen Insel mit Fibronektin beschichtet. Ein Paar von Kavitationsblasen (tandem bubble) mit gegenphasigen Schwingung werden durch Beleuchten gepulste Laserstrahlen auf den Goldpunkten (siehe Abbildung 4a), was zur Erzeugung eines schnellen und lokalisierte Strahl bewegt sich in Richtung der Zielzelle in der Nähe erzeugt wird . Die Zelle kann mit einem Calciumantwort für makromolekulare Aufnahme und / oder stimulierten verformt, porated werden, abhängig von der Arbeitsabstand (S d) der Zelle zu dem Tandemblase.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Diese Plattform kann ferner mit Fluoreszenzassays und funktionalisierten Kügelchen an die Zelloberfläche für Kavitation induzierten Bioeffekte befestigt kombiniert werden. Insbesondere eröffnet diese Plattform, um den Weg für eine zuverlässige und quantifizierbare Assays auf Einzelzellebene. Bis jetzt haben wir das Gerät für die Analyse von Tandem blaseninduzierten Zellmembran Verformung, Zellporenbildung und die intrazelluläre Aufnahme, Lebensfähigkeit, Apoptose und intrazellulären Calcium-Reaktion verwendet. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir den Prozess der Chipherstellung und das Verfahren für die Analyse der verschiedenen Bioeffekte oben erwähnt. Außerdem sind die Operationen des Chips beschrieben.
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Protocol
1. Mikrofertigung
HINWEIS: Alle Mikrofabrikationsverfahren werden in einem Reinraum durchgeführt. Eine Chrommaske wird vor dem Mikro entworfen, siehe Abbildung 2.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Kanaldesign in der Mikrofluidik - Chip und den Abmessungen der Arbeitseinheiten. a) Mask Design der ausgerichteten PDMS Mikrokanäle (grün) und die Muster auf dem Glassubstrat (blau und rot). b) vergrößertes Bild des Maskendesign in einem repräsentativen Abschnitt der Arbeitseinheit Arrays. c) Schematische Darstellung einer Arbeitseinheit ein Zellmuster (blau) und ein Paar von Goldpunkten (rot) zeigt. Alle Längenskalen sind auf der rechten unteren Ecke angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine lar anzuzeigenger-Version dieser Figur.
- Gold - Punktmuster
HINWEIS: Die Fläche jeder Gold Punkt innerhalb 25-30 & mgr; m 2 sein , ausgebildet, so dass es groß genug ist , Laserenergie für die Blasenerzeugung zu absorbieren, aber klein genug , um einzelne Zellen daran anhaften zu vermeiden. Ein schematisches Diagramm für den Goldpunkt Herstellung wird in 3a gezeigt.- Glasobjektträger Reinigung (in einer chemischen Haube)
- Spülen Sie die Objektträger aus Glas mit Aceton , gefolgt von Isopropylalkohol (IPA) und dann trocknen Sie es mit einem N 2 -Strom.
- Einweichen der Schieber in Piranha - Lösung (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) für 10 min.
- Nehmen Sie die Folie aus, spülen Sie es mit DI - Wasser, und es dann trocken mit einem N 2 -Strom.
- Backen Sie den Glasobjektträger auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 10 min.
- Behandeln Sie die Folie in einem Plasmaverascher bei 100 W für 90 s.
- Spin-Beschichtung (Spin-Coating-Haube)
- Schalten Sie auf einer Heizplatte und warten Sie, bis die Temperatur bei 95 ° C stabil ist.
- Folgen Sie dem Beschichtungsverfahren:
1000 Umdrehungen pro Minute für 5 s mit einer 500 rpm / s Rampe;
dann 3000 Umdrehungen pro Minute für 30 s mit einer 1.000-rpm / s Rampe. - Befestigen Sie das gereinigte Glasobjektträger auf den Spin-Coater durch Anlegen eines Vakuums.
- Decken Sie die Gleitfläche mit P-20 und das Beschichtungs Rezept starten.
- Wiederholen Sie den Beschichtungsprozess für NFR-negativer Photoresist.
- Backen Sie die Folie bei 95 ° C für 60 s und warten, bis es kühlt auf Raumtemperatur ab.
- Die Fotolithografie
- Montieren Sie die Chrommaske auf die Mask Aligner und stellen Sie sicher, dass das Muster Seite nach unten in Richtung der Folie.
- Legen Sie die Photolithographie Rezept auf Festbelichtungsmodus mit 9 s von UV-Exposition und richten Sie schnell das Glassubstrat mit der Maske.
- Nach der Durchführung der UV-Bestrahlung aus, backen die Folie bei 956; C für 1 min, und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen dann.
- Entwicklung
- Entwickeln des Musters auf der Folie in Entwicklerlösung für 60 s.
- Entfernen Sie die Folie aus der Entwickler, spülen Sie es mit DI - Wasser, und trocknen Sie es mit einem N 2 -Strom.
- Überprüfen Sie die Mustergeometrie unter dem Mikroskop, und messen und die Strukturgröße aufzuzeichnen.
- Goldabscheidung (E-beam Verdampfung) und Abheben
- Backen Sie die Folie bei 120 ° C für 5 Minuten, und lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen.
- Reinigen der Schieber mit Plasma in dem reaktiven Ionenätzen (RIE) Maschine für 90 s bei 500 Torr und 100 W.
- Kaution 5 nm Ti und 15 nm Au auf den Objektträger unter Verwendung eines E-Beam - Verdampfer 17.
- Genießen Sie die Schlitten über Nacht in einem Becherglas Photoresist-Entferner Lösungsmittel, das Gold, die auf der Oberseite des NFR widerstehen zu entfernen.
- Rufen Sie die Folie bündig it mit Aceton , gefolgt von IPA, und trocknen Sie es mit einem N 2 -Strom.
- Trocknen Sie die Folie auf einer heißen Platte bei 115 ° C, bevor es in das Sauerstoffplasmaverascher bei 100 W für 90 s gereinigt wird.
- Glasobjektträger Reinigung (in einer chemischen Haube)
- Molecular-Montage Musterung durch Abheben (MAPL)
Anmerkung: Die Fläche jeder Fibronektin beschichteten Insel ist so eingestellt, daß innerhalb von 700-900 & mgr; m 2 ausreichende HeLa - Zelle zu erleichtern , in einer quadratischen Region ausbreitet , während die Wahrscheinlichkeit von mehreren Zellen minimiert auf der Insel aggregieren. Ein schematisches Diagramm zur Herstellung von zellStrukturierungs Inseln ist in 3b gezeigt.- Spin - Beschichtung
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.2, aber verwenden S1813-positiven Photoresist und eine Temperatur von 115 ° C.
- Aligned photolithographischen
- Montieren Sie die Chrommaske auf die Mask Aligner und stellen Sie sicher, dass die Seite mit dem Muster nach unten zeigt in Richtung der Folie mit derGoldpunkte.
- Legen Sie die Photolithographie Rezept auf Festbelichtungsmodus mit 9 s von UV-Exposition.
- Richten Sie die obere Maske mit dem unteren Schieber mit Ausrichtungsmarkierungen, um den Rand der Maske befindet, als Raumbezug.
- Überprüfen Sie den zentralen Teil der Maske und stellen Sie sicher, dass die Mustermerkmale korrekt ausgerichtet sind.
- Füllen Sie die UV-Bestrahlung ohne Nacherwärmung.
- Entwicklung
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.3 , aber mit 45 s der Entwicklung , bevor sie auf einer Heizplatte getrocknet und in N 2 Lagerung zu erhalten.
- Spin - Beschichtung
- Chemische Behandlung
- Bereiten Sie die Passivierungslösung: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG in 10 mM HEPES-Puffer.
- Rufen Sie die Folie aus N 2 -Speicherung und reinigen RIE unter Verwendung der Parametereinstellung: 500 Torr Druck, 100 W Leistung und 90-s Dauer.
- Pipette ein Tropfen Passivierungslösung auf ein Stück Paraffinfilm. </ Li>
- Sandwich der Lösung mit dem Film und der Folie, um sicherzustellen, dass die Seite mit dem Muster-Features nach unten in Richtung des Films; die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Warten Sie 45 Minuten, bevor die Folie aus dem Film zu entfernen.
- Weichen Sie die Folie nacheinander in Photoresist-Entferner, Photoresist-Entferner und DI-Wasser (1: 1) und DI-Wasser, und rühren es in einem Ultraschallbad für 90 s für jede einweichen.
- Trocknen Sie die Folie auf einer Heizplatte, die Feuchtigkeit zu entfernen, bevor es in einem Exsikkator Dichtungs- und es in einem Kühlschrank lagern.
- Chip - Montage
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4, aber mit SU8-2025-negativen Photoresist und der Parametereinstellung genannte Microchem Protokoll 18, eine so genannte Silikonform mit einer Photomaske herzustellen.
- Fertigen Sie ein PDMS Mikrokanal (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) und eine kleine PDMS Platte (800 & mgr; m breite Rillenstruktur) unter Verwendung von Weich-Lithographie.
- Lochen die microchannel für die Fluidzugangsöffnungen und reinigen Sie sie mit Klebeband und dann mit IPA.
- Schirmen den gemusterten Bereich des Glassubstrats mit dem PDMS Bramme und gelten RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) zu entfernen PLL-g-PEG aus dem Peripheriebereich.
- Behandeln Sie den Mikrokanal mit einer reduzierten Dosis von RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), und dann auf das strukturierte Glassubstrat ausrichten (mit dem kleinen PDMS Platte entfernt); bringen den Mikrokanal und die strukturierte Glassubstrat in einen konformen Kontakt unter einem Stereoskop.
Abbildung 3: Schematische Darstellung für Mikro und Chip - Montage. a) Muster der Goldpunkte auf dem Glassubstrat. b) Herstellung des Glassubstrats für die Zellmusterungs über MAPL. c) Montage des mikrofluidischen Kanal mit Plasma - Bindung. Sehen Sie sich die Materialliste für die Definitionen of die Abkürzungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Zellbindung
HINWEIS: HeLa-Zellen werden routinemäßig in DMEM mit 10% FBS und 1% Antibiotikum / Antimitotikum Lösung in einer Zellkultur-Inkubator ergänzt gehalten. Ein schematisches Diagramm für die Chipmontage und Zellanheftung ist in 3c gezeigt.- Prime der Chip mit PBS für 30 min bei 1 & mgr; l / min und dann Fibronektin-Lösung (50 ug / ml in PBS, 1 & mgr; l / min) für 45 min ziehen lassen.
- Während des Wartens, Zentrifuge einzelnen Zellen und Rekonstitution der Zellsuspension in vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium bei 5x10 6 Zellen / ml trypsinize Zellkultur mit 0,25% Trypsin-EDTA, waschen Sie sie in einem Kulturmedium.
- Ersetzen Sie die Fibronektin-Lösung mit PBS und spülen Sie den Chip bei 10 & mgr; l / min für 5 min.
- Injizierendie hergestellte Zellsuspension in den Chip, den Fluss zu stoppen, klemmen den Ausgang, und 30 min den Chip in einer Zellkultur-Inkubator halten.
- Lassen Sie die Steckdose und spülen Sie den Chip mit Zellkulturmedium bei 10 & mgr; l / min für 5 min. Reduzieren die Perfusion Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums auf 0,75 & mgr; l / min und Pflege der Zellkultur für 2 h in den Inkubator.
2. Blasenbildung und Strömungsvisualisierung
ANMERKUNG: Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur tandem Blasenerzeugung , und die resultierende Strömungs Interaktion mit einer einzelnen Zelle in einem mikrofluidischen Kanal gezüchtet Nähe in 4a gezeigt.
- Die Erzeugung von Tandem - Blasen mit zwei Lasern und Zeitsteuerung
- Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip auf der Stufe eines inversen Mikroskops und richten Sie die Brennpunkte der beiden gepulsten Nd: YAG-Laser (λ = 532 nm, 5 ns Pulsdauer) auf einem Paar von gemusterten Goldpunkten getrennt by 40 um.
- Verwenden einer digitalen Verzögerungsgenerator die zwei Laser mit einer Zeitverzögerung etwa 2,5 & mgr; s zu triggern zwei Blasen an der Goldpunkte eingeleitet zu erzeugen.
- Stellen Sie die Laserausgangsenergie (~ 10 & mgr; J) innerhalb von 50 ± 2 um einen maximalen Durchmesser der Blasen zu erzeugen.
- Synchronisieren eines High-Speed-Kamera (200-ns-Exposition und 2 Millionen Bilder pro Sekunde (fps)) zu den Lasern und erfassen die Dynamik der Blasenexpansion, Kollaps, den Blasen-Interaktion und Strahlbildung.
- Die Quantifizierung der Strahlgeschwindigkeit
- Aufzeichnen der Position der Düsenspitze (J 1) an dem proximalen Ende der ersten Blase (B 1) und dem distalen Ende der B 1, beginnend bei der Erzeugung der zweiten Blase (B 2) und endend mit dem Aufsetzen von J 1 zu dem distalen Ende von B 1; siehe die schematische in 5a.
- passen Linienförmig den zeitlichen Verlauf der Position für Both der proximale (Düsenspitze) und den distalen Enden. Berechnen Sie die Steigung der Spitzenposition-Zeit-Kurve für das proximale Ende der Strahlgeschwindigkeit zu bestimmen. Der Schnittpunkt der beiden Linien zeigt den Strahl Aufsetzen Zeit. Weitere Details finden Sie in der Referenz 19 zu finden.
- Visualisierung der Tandem - Blase-induzierten Strömungsfeld
- Bereiten Sie 1 & mgr; m aus Polystyrol (PS) Beadsuspension in DI-Wasser (2,6% w / v) und injizieren die Kügelchen in die Mikrofluidik-Chip.
- Erzeugen tandem Blasen beschrieben, wie in Schritt 2.1.1-2.1.3.
- Notieren Sie die Tandem-Blasendynamik unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Videokamera mit einer Bildfrequenz von 5 M fps mit einer 100-ns Belichtungszeit.
- Laden Sie die aufgenommenen Bildsequenz in einem kommerziellen PIV-Software.
- Dividieren jedes Bild in kleinere Abfragefenster von 16 x 16 Pixel (px) mit einem 75% überlappen.
- Anwenden Multipass-Iterations- und regionale Filter, um die Fehler im Geschwindigkeitsfeld Berechnung zu reduzieren, undgeben die Ergebnisse in einer Geschwindigkeitsvektorkarte.
Abbildung 4: Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus und Bildaufzeichnung. a) Versuchsaufbau zur Tandem - Blase Generation. b) Zeitlicher Ablauf für verschiedene Arten von Abbildungsnahmen verwendet. FL: Fluoreszenzmikroskopie, BF: Hellfeld, IFT: Inter-Zeit. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
3. Single-Zell-Analyse und Bioeffects
HINWEIS: Die Tandemblase neben den Zielzellen erzeugt wird, und die resultierenden Bioeffekte werden in einem Arbeitsabstand abhängigen Weise untersucht. Der zeitliche Ablauf für verschiedene Arten von Bildaufnahmen ist in Abbildung 4b dargestellt.
- Membranporenbildung und hochmolekularen Aufnahme
HINWEIS: Die Aufnahme von extrazellulären Makromolekülen in die Zielzelle wird durch die fortschreitende Diffusion von Membran impermeant Propidiumiodid (PI) durch die Poration Stelle auf der Zellmembran aus.- Nach dem Schritt 1.5, ersetzen Sie die regelmäßigen Kulturmedium (dh DMEM) mit PI - Lösung (100 & mgr; g / ml in DMEM) läuft bei einer Perfusionsfördermenge von 0,5 & mgr; l / min während des gesamten Experiments.
- Programmieren der Mikroskopsteuerung Software, um automatisch die PI Fluoreszenzwürfel auf dem Drehturm auswählen und die Zeitsteuerung der CCD-Kamera mit dem PI-Fluoreszenzanregung synchronisieren, um Fluoreszenzbilder mit einer Belichtungszeit von 200 ms zu erfassen.
- neben einer Zielzelle, Aufnahme sowohl Hellfeld- (BF) und Fluoreszenz (FL) Bilder vor dem Tandemblasenbehandlung nach der beiden Laserherde sind mit einem Paar von Goldpunkten ausgerichtet sind.
- Verwenden Mikroskop Steuerungssoftware sofortbeginnen kurz nach einer Zeitraffer-Fluoreszenzbildaufzeichnung der Zielzelle 2.1 Schritt die Geschichte der PI-Aufnahme zu erfassen.
- Membranverformung
- Vorbereitung 1-um-Kügelchen (1% w / v, aktiviert mit wasserlöslichem Carbodiimid) und funktionalisieren sie mit Peptid-2000 (100 ug / ml in PBS).
- Nach dem Schritt 1.5, brüten die anhaftenden Zellen mit den funktionalisierten Kügelchen bei einer Dichte von 1x10 9 Perlen / ml bei 37 ° C für 30 min.
- Wiederholen Sie Schritt 2,1 bis Tandemblasen neben der Zielzelle herzustellen und die Zellverformung mit einem Ultra-High-Speed-Kamera mit einer Bildfrequenz von 5 Millionen fps aufzeichnen.
- Identifizieren einer Triade von drei Kügelchen , die während des Experimentes auf der Abbildungsebene verbleiben und zu kompilieren ihre Positionen als (x 1, y 1) (x 2, y 2) und (x 3, y 3) in der Experiment - Koordinaten.
- Berechnen Sie die Fläche der Triade vor und after die Tandem-Blase Behandlung mit der Formel:
- Berechnen Sie die Fläche Stamm als:
- Auf der Basis der Koordinaten der drei Eckpunkte vor und nach der Tandem - Blase Behandlung, die Berechnung der örtlichen Hauptdehnung und Flächen Stamm folgenden etablierten Protokollen 20,21.
- Viability und Apoptose
HINWEIS: FITC Annexin V markiert Zellen, einschließlich apoptotischen diejenigen, durch die Externalisierung von Phosphatidylserin (grüne Fluoreszenz). PI-Etiketten die Kerne von nekrotischen Zellen (rote Fluoreszenz). Hellfeldabbildung wird verwendet, die Zellmorphologie zu dokumentieren und mit der Identifizierung von Zelllebensfähigkeit und Apoptose zu unterstützen.- Notieren Sie sich die Position jedes behandelte Zelle in der mikrofluidischen Kanal (durch die Adress - Etiketten in den Kanal erleichtert, siehe 2b
- Inkubieren der behandelten Zellen in dem Zellkulturmedium für weitere 2 h, bevor der Chip mit FITC Annexin V Lösung 15 min Perfusion. Positive Zellen zeigen grüne Fluoreszenz.
- Wiederholen Sie Schritt 3.3.2 24 h nach der bubble Tandembehandlung die langfristigen Bioeffekte in den Zielzellen zu untersuchen.
- Calcium - Reaktion
- Mix 3 & mgr; l Fura-2 AM Stammlösung (1 mg / ml in DMSO) mit 3 & mgr; l 10% w / v Pluronic F-127 in 500 & mgr; l der reduzierten Serummedium die endgültige Markierungslösung (6 & mgr; M) hergestellt wurde.
- Nach dem Schritt 1.5, ersetzen Sie die Zellkulturmedium mit der Markierungslösung und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 40 min (1 & mgr; l / min Durchblutungsrate).
- Füllen Sie den Kanal mit dem reduzierten Serummedium (0,75 & mgr; l / min Durchblutungsrate), bevor die Zelle Experiment zu starten.
- Starten Sie ratiometrisches Imaging (Wellenlänge: 340/380 nm, 50-ms-Exposition)der Zielzelle die kommerzielle PTI-System.
- Nach 10 s von ratiometrisch Bildgebungs der Zelle bei Ruhepegel erzeugen tandem Blasen wie in Schritt 2.1; erste Platte mit einem Zwischenrahmenzeit (IFT) von 0,1 s für 1 min, dann erhöhen Sie die IFT auf 1 s für eine andere min, und eine weitere Erhöhung auf 5 s nach 2 min.
- Verwenden Sie das PTI-Software, das Verhältnis R = F340 / F380 in der Region von Interesse (ROI) zu berechnen, die auf die intrazelluläre Calcium-Konzentration proportional ist.
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Representative Results
Die mikrofluidischen Plattform in dieser Arbeit beschrieben wurden, können verwendet werden, den Blasen Wechselwirkungen zu untersuchen und eine Vielzahl von Kavitation induzierten Bioeffekte auf Einzelzellebene zu analysieren. Hier stellen wir verschiedene Beispiele einer Vielzahl von experimentellen Untersuchungen und Bioassays zu demonstrieren, die in unseren experimentellen System durchgeführt werden kann. Wir werden zuerst mit der Strahlbildung, die Visualisierung der resultierenden Strömungsfeld und die Berechnung der Strahlgeschwindigkeit (5a) , um die transiente Interaktionen von Tandemblasen veranschaulichen. Wir werden dann vorliegenden Beispiele von Tandem - bubble-induzierte lokalisierte Zellmembran Verformung (5b), geortet Membran Poration mit PI - Aufnahme (5c) und die intrazelluläre Calcium - Reaktion (Abbildung 5d). Andere Beispiele, wie die Zellebensfähigkeit und Apoptose-Assays können in Referenz 22 entnommen werden.
5a zeigt ein Beispiel der Tandem - bubble Wechselwirkung mit dem Strahlbildung, erfasst durch Hochgeschwindigkeitsbildverarbeitung und die resultierende Strömungsfeld von PIV offenbart. Insbesondere nach ihrer maximalen Expansion, der Zusammenbruch der ersten Blase B 1 (bei 0 & mgr; s erzeugt) asymmetrisch 2 durch die rasche Expansion der zweiten Blase B verzerrt (bei 2,5 & mgr; s erzeugt), was zur Bildung einer "nach oben" führt Strahl (J 1) bei 3,4 & mgr; s und die nachfolgende Strahlströmung mit 5,4 & mgr; s gezeigt. Die durchschnittliche Strahlgeschwindigkeit durch die Steigung einer angepassten Linie für die Position des proximalen Endes (oder Pol) von B 1 vor dem Aufsetzen (dh, der Kontakt mit dem distalen Ende des B 1) als Funktion der Zeit bestimmt wird. Die durchschnittliche Strahlgeschwindigkeit wird festgestellt , 20-58 m / s zu erhöhen , wenn der maximale Durchmesser B 2 steigt von 40 bis 60 & mgr; m. Basierend auf den Ergebnissen der PIV-Analyse der Richtstrahlströmung um den tandem Blase ist in der Größenordnung von 10 m / s und in einer Breite in der Größenordnung von 10 & mgr; m beschränkt. Es ist somit in der Lage eine impulsive und lokalisierte Scherspannung und Spannungsgefälle auf eine Zielzelle in der Nähe gewachsen produzieren.
Ein weiteres Beispiel , gezeigt in 5b veranschaulicht die Zellmembran Verformung induziert durch die Richtungs- und lokalisierte Strömungsstrahl durch die Tandem erzeugten Blasen an Arbeitsabstand S d = 40 um. Die Membranverformung und Wiederherstellung werden durch die Verschiebung eines funktionalisierten Sicke (angezeigt durch die gepunktete Linie gelb) markiert an der Vorderkante der Zellmembran gebunden. Der lokale Stamm kann aus den Koordinaten eines Triade benachbarter Kügelchen berechnet werden. Eine schematische Darstellung des berechneten maximalen Flächenänderung an verschiedenen Stellen auf der Zelloberfläche ist in der Mitte gezeigt. Die Vorderkante ist in erster Linie gestreckt (die grüne Kreise sehen), während die Hinterkante oder latrere Seiten der Zelle komprimiert werden (wie durch die roten Kreise angedeutet), was Heterogenität in Zelle durch die Tandemblase induziert Strahlströmung erzeugt Verformung. Die zeitliche Variation des Bereichs Stamm an der Zellvorderkante ist auf der rechten Seite veranschaulicht. Es ist am Anfang ein paar schnelle Schwingungen besteht, für eine große und anhaltende Strecke folgte etwa 100 & mgr; s (FWHM) und einer anschließenden allmählichen Erholung auf einer Zeitskala von mehreren ms.
Darüber hinaus kann die große Fläche Dehnung und Dehnungs integral an der Zellvorderkante für die Zellmembran verantwortlich Poration bei kleinen S d beobachtet, wie gezeigt in 5c. Bei kleinen S d (dh 10 & mgr; m oder in einigen Fällen 20 & mgr; m) und mittleren S d (dh die Mehrheit der 20 und 30 & mgr; m), eine lokalisierte Membranzerstörung induziert, was zu einer punktgenauen Aufnahme von extrazellulärem PI indas Cytosol. Wenn die PI Intensität innerhalb der Zelle ohne Sättigung steigt weiter, tritt Nekrose. Im Vergleich dazu eine Größenordnung niedriger, wenn die PI-Intensität ist und ein Plateau erreicht, innerhalb von 10 s nach dem Tandem-Blase Behandlung wird reparierbar Fungs mit wahrscheinlich das Überleben der Zellen auftreten, die weiter durch die minimale Änderung der Zellmorphologie unterstützt wird. Bei großen S d (dh 40 & mgr; m), ist vernachlässigbar PI - Aufnahme folgende Tandem Blase Behandlung gefunden, was darauf hinweist vernachlässigbar oder nicht Fungs. Die Zelle kann mit regelmäßigen Wachstum und die Vermehrung 22 überleben. Insgesamt zeigen die Ergebnisse einen klaren Übergang in Zell - Antwort von Nekrose, durch reparable Membran Fungs, auf nicht-Fungs im Bereich von S d ≈ 20 bis 40 & mgr; m.
Schließlich zeigen wir die Ergebnisse der ratiometrisch Abbildung des intrazellulären Calcium-Reaktion durch Tandem-Blasen in einzelnen Zellen bei verschiedenen S hervorgerufend, insbesondere im Bereich von subletalen S d = 30-50 um (Figur 5d). Das Intensitätsverhältnis ist auf die Menge an intrazellulärem Calcium proportional. Bei kleinen S d (dh 30 & mgr; m oder in einigen Fällen 40 & mgr; m) von der Anströmkante eine Calciumwelle zur Hinterkante reisen eindeutig in wenigen Sekunden nach der bubble tandem Behandlung beobachtet. Nachdem der intrazellulären Calcium einen Spitzenkonzentration erreicht, zerfällt es innerhalb weniger Minuten zum Ruhepegel langsam zurück. Im Gegensatz dazu ist bei großen S d (dh eine Mehrheit von 50 & mgr; m oder in einigen Fällen 40 & mgr; m) ist der Anstieg der intrazellulären Calcium viel milder und keine deutlich sichtbare reisen Calcium Welle identifiziert werden kann. Diese zwei verschiedenen Calciumreaktionen können auch von ihren Intensitätsverhältnis über die Zeit-Profile, mit signifikanten Unterschieden in der Spitzenamplitude des Intensitätsverhältnisses und der Anstiegszeit von Ruhepegel unterschieden werden emporzuragenWert. Bei einer noch größeren S d (dh über 60 um), kann kein Calcium - Reaktion beobachtet werden. Der Prozentsatz der Zellen , HeLa Calciumantworten bei verschiedenen S d Anzeige ist in Figur 5d (rechts) zusammengefasst.
Alles in allem haben unsere Ergebnisse zeigen , dass durch die Stärke des Strahlflusses zu verändern (oder S d zu ändern), kann eine Vielzahl von Bioeffekte in einzelnen HeLa - Zellen unter gleichen Kulturbedingungen hergestellt werden, die wahrscheinlich mit der Amplitude und Dauer korreliert der mechanischen auf der Zellmembran 22 auferlegte Verformung.
Abbildung 5: Ergebnisse von Tandem - Blase Interaktion, Zellmembran Verformung, Membranfungs und Calcium - Reaktion - Assays. a) Flüssigkeitsbewegung und der Strahlinduziert durch Tandem-Blase Interaktion. Links: Ausgewählte Frames mit der Strahlbildung Tandem Blase Wechselwirkungen zeigen und Feld von PIV ergab, fließen. Die maximalen Durchmesser der beiden Blasen sind etwa 50 ± 2 um. Mitte: Schematische Darstellung der Strahltandemblasen, die Mittelachse darstellt, den Ursprung der Koordinaten (o) und proximalen und distalen Ende (oder Pole) der ersten Blase B 1. Rechts: Gemessene Polstellen (mit Fehler = ± 1 & mgr; m) an dem proximalen und distalen Ende der B 1. b) Zellmembran Verformung. Links: Die gelbe gestrichelte Linie kennzeichnet die Verschiebung eines PS Wulst an der Vorderkante der Zellmembran befestigt ist, die lokale Membranverformung und Erholung hindeutet. Mitte: eine schematische Darstellung der Peakfläche zeigt, die Stämme an verschiedenen Stellen auf der Zelloberfläche auf der linken Seite gezeigt. Rechts: Die Zeitverläufe der Gegend Stämme in der Mitte der Zelle Vorderkante. Δ ε ist der Bereich , Dehnung berechnet based auf Hauptbelastungen und Δ Δ ist die berechnete Fläche Stamm auf der Grundlage der Triade Geometrieänderung. Weitere Details über die Region Dehnungsberechnung und Fehleranalyse in Referenz 22 c) Zellmembran Fungs dokumentiert. Links: Hellfeld-Bilder vor und nach der Tandem-Blase Behandlung und Zeitraffer-Fluoreszenzbilder von PI-Aufnahme (0 und 120 s). Die weißen Pfeile zeigen die Strahlströmungsrichtung. Mitte: die typische Veränderung der durchschnittlichen PI-Intensität gegen die Zeit in den Zellen. Rechts: Statistische Ergebnisse der Prozentsatz der Zellen Nekrose (rot), reparierbar Fungs (blau), und nicht Fungs (grün) bei verschiedenen S d laufen. Anzahl der Zellen behandelt: N = 9, 14, 14 und 8 für S d = 10, 20, 30 und 40. Die statistische Fehler beträgt ± 1 / √ N. d) intrazelluläres Calcium - Reaktion. Links: Sequenzen von ratiometrisch Bilder, um die intrazellulären Calciumantworten der einzelnen Zelle zeigt,s bei S d von 30 um und 50 um. Die roten Pfeile zeigen die Strahlrichtung. Mitte: typische Antwortprofile (Verhältnis Zeitkurven) bei verschiedenen S d. Rechts: die Wahrscheinlichkeit einer Calciumreaktion bei verschiedenen S d. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Arbeitsabstand (S d) (um) | Reynolds-Zahl (Re) | gemittelt Scherspannung (Pa) in yz-Ebene |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105,08 | 42.21 |
Tabelle 1: Eine Liste von Parametern für die Strömungsphysik aus den PIV Ergebnisse. Geschätzte Reynoldszahl und gemittelte Scherspannung in Bezug auf unterschiedliche Arbeitsabstände (S d). Die YZ-Ebene bezieht sich auf die x Höhe Ebene Kanalbreite. Die gemittelte Scherspannung wird aus einer Höhe von 0 bis 7,7 & mgr; m von dem Kanalboden, weil die geschätzte Zellenhöhe im Kanal ca. 6-7 um beträgt.
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Discussion
Einzelzellanalyse, in Kombination mit lebenden Zellen Bildgebung hat sich unser Verständnis der dynamischen und oft variable Prozessen in einzelnen Zellen stark verbessert, wie Phänotyp - Entwicklung und Immunantwort 23. Im Gegensatz zu der herkömmlichen Zellkultur in Schalen oder -flaschen, ermöglichen mikrofluidische Systeme präzise Steuerung der Mikroumgebung, bis auf die Ebene einzelner Zellen in Echtzeit. Folglich schreitet in Mikrofluidik-Technologien und Techniken weitgehend den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit der Einzelzellanalyse verbessert. Durch die Integration von Softlithographie und Oberflächenstrukturierung können mikrofluidische Systeme weiter die eingehende Analyse einer einzelnen Zelle Antwort auf komplexe Muster von raum-zeitlich variable Stimuli so gestaltet werden, erleichtern. Zum Beispiel wurden transient chemische oder mechanische Signale wurden auf einzelne Zellen erfolgreich zugestellt, während ihre biologische oder mechanische Reaktionen automatisch aufgezeichnet und analysiert 24. Trotz dieser allgemeinen Tendenz, die Anwendung von Mikrofluidik Kavitation induzierten Bioeffekte auf zellulärer Ebene zu analysieren sehr begrenzt ist. Vor allem hat es nur zu blaseninduzierten Membran Poration einzelner Zellen in Suspension von 11 Mikrosäulen gefangen angewendet. In den meisten Studien auf adhärente Zellen, ist der Nutzen der Zellmorphologie zu steuern Konsistenz in dynamischen bubble-Zell-Wechselwirkungen zu halten ist entweder nicht verfügbar oder weitgehend vernachlässigt.
Wir haben ein Mikrofluidik-System entwickelt, um genau die Einleitung zu steuern, die anschließende Expansion und Zusammenbruch Dynamik von Kavitationsblasen; Bubble-Blase Wechselwirkungen mit Strahlbildung; und Zellform, Orientierung, Haftmuster und Arbeitsabstand von den blasen, damit für reproduzierbare Strahlströmung ermöglicht, um einzelne Zellen unter kontrollierten Versuchsbedingungen angewandt werden. Dieses neuartige Mikrofluidik-System ist ideal für die Durchführung von grundlegenden studies auf Kavitationsblase (n) -Zell-Wechselwirkungen, die auf ein breites Spektrum von therapeutischen Ultraschallanwendungen, wie SWL, HIFU und Sonoporation relevant sind. Wir haben gezeigt, dass unsere mikrofluidischen System verwendet werden, können verschiedene Kavitation induzierten Bioeffekte, einschließlich Zellmembran Verformung Membran Poration, Lebensfähigkeit und Calcium-Reaktion, in einer kontrollierbaren und reproduzierbaren Weise zu untersuchen. Vor allem die Richtstrahlströmung durch Tandem-Blasen erzeugt ermöglicht es, die mechanischen Eigenschaften und Calcium-Reaktion in einzelnen Zellen unter hohen Dehnungsraten zu sondieren, die nicht gut charakterisiert. Die lokalisierte, impulsive mechanische durch eine solche Strahlströmung erzeugt Stress kann nicht durch herkömmliche Streckverfahren erreicht werden, wie beispielsweise Mikropipette aspiration 25 und der Verwendung von optischen Pinzetten 26 und Magnet 27. Weiterhin im Gegensatz zu früheren Studien unter Verwendung von Ultraschallkontrastmittel 8,28-30 oder laserinduziertes Einzel bubbles 31,32, unser mikrofluidischen System bietet eine bessere Kontrolle der Zellgeometrie und Haftungsbedingungen und damit ihre wesentliche Wirkung auf die zelluläre Antwort und Bioeffekte reduziert 16.
Während unsere Technik zuverlässig und reproduzierbar ist, muß man das Protokoll folgen vorsichtig, dass das Versuchssystem, um sicherzustellen, getreu wiedergegeben wird. Die Qualität der Oberflächenstrukturierung im Mikrokanal ist in erster Linie verantwortlich für die Reproduzierbarkeit der Blase-Blase-Zell-Interaktionen und der Kaskade von nachgeschalteten Bioeffekte. Zum Beispiel für HeLa - Zellen, die Fläche jedes Gold Punkt muss etwa 25-30 & mgr; m 2 sein stabile Blasenbildung zu gewährleisten , während die Zellen ein Anhaften zu verhindern. Auf der anderen Seite ist die Fläche jeder Insel Fibronektin beschichteten hat etwa 700-900 & mgr; m 2 sein , die eine ausreichende Ausbreitung einer einzelnen Zelle in einem Quadrat zu erleichtern , während die Wahrscheinlichkeit von mehreren Zellen Reduktions Aggregate auf der Insel bilden. Ausrichtungzwischen den Goldpunkten und den Fibronektin-beschichteten Inseln müssen genau mit Hilfe der Mask Aligner zu halten den Winkelfehler innerhalb von 1 ° und der axialen Fehler innerhalb von 0,5 & mgr; m durchgeführt werden. Darüber hinaus ist dieses experimentelle System bietet Vielseitigkeit in einer Reihe von Veranstaltungen Überwachung mit ihren Zeitskala um Größenordnungen variiert (zB Blasendynamik: us, Zellverformung: ms, Membranfungs: s, Apoptose: h). Daher ist es wichtig, den Zeitpunkt der Bildaufnahme und Aufzeichnen jeder Sequenz genau zu steuern, durch Feinabstimmung der Triggersignale (von einer digitalen Verzögerungsgenerator gesteuert). Die Einzelzellkultur müssen gut in den Mikrokanal aufrechterhalten werden, von Zelle zu Zelle Veränderung im Phänotyp zu minimieren (meist als Morphologie bezeichnet). Daher ist ein mindestens 2 h Inkubation für Zellanheftung erforderlich und Ausbreitung auf den Inseln vor mit nachgeschalteter Zellbehandlung fortgefahren wird. Es wird empfohlen, immer die Strömungsgeschwindigkeit im microchann haltenel unter 3 & mgr; l / min, so daß die Strömungsscherspannung durch das zirkulierende Kulturmedium auf der Zelle produziert wird im physiologischen Bereich.
Eine Strombegrenzung der Technik ist, dass tandem bubble Interaktion und die sich ergebende Strahlstrom kann nur an eine Zielzelle einmal angewendet werden, da die Goldpunkte wird durch die Laserbestrahlung abgetragen werden. Dieser Nachteil schränkt die Fähigkeit unserer experimentellen System die Bioeffekte von therapeutischem Ultraschall erzeugt nachzuahmen, wo Zellen zu Kavitation Ereignisse häufig ausgesetzt sind. Jedoch kann diese zeitliche Begrenzung durch Aufbringen einer weiteren dünnen Schicht aus Siliziumdioxid gelindert werden , um die Goldpunkte vor direkter Exposition in der Flüssigkeit 15 zu schützen. Insgesamt sind unsere mikrofluidischen System bietet gut kontrollierten experimentellen Bedingungen die Bioeffekte von Kavitationsblase (n) -Zelle Wechselwirkungen erzeugt, zu untersuchen und einige einzigartige Eigenschaften hat. Zuerst wird sowohl die Größe und die Lage der Kavitationsblasen in unserer experimental System kann genau durch Einstellen des einfallenden Laserenergie, die durch den Goldpunkten absorbiert gesteuert werden. Zweitens sind die Geometrie und die Adhäsion von einzelnen Zellen durch Zellmusterungs standardisiert ihre Wirkungen auf die Zellreaktionen und Bioeffekte zu minimieren, zu besser reproduzierbaren Ergebnissen führt. Drittens, die parallel Arbeitseinheiten in der mikrofluidischen Chip-Design machen es möglich nachgelagerten Bioeffekte, wie Zellwachstum, Proliferation und potentiell Genexpression nach Kavitation Exposition zu untersuchen, da jede Zelle adressiert werden können und einzeln überwacht. Zusammengefasst unsere mikrofluidischen System und Methodik erstellen zuverlässige Blase-Blase Wechselwirkungen die Bioeffekte einzelner Zellen mit verbesserter Genauigkeit zu untersuchen.
Unsere aktuellen Chip ist für die Analyse von einzelnen HeLa-Zellen entwickelt. Jedoch sind eine Modifikation der Muster Inseln für andere Säugetierzelllinien ebenfalls möglich. Verschiedene Verbesserungen können die Anwe weiter zu erweitern gemacht werdenns des Chips. Zum Beispiel Ersatz der PLL-g-PEG-Moleküle könnten einzelne gemusterten Zellen wandern auch nach 24 h zu stoppen erkundet werden. Zusätzlich können neue Chip-Designs mit mikrofluidische Ventile untersucht werden, um die lokale Mikroumgebung der Zellen zu steuern, so dass Chemikalien wie Fluoreszenzmarker oder toxischen Reagenzien werden nur an einer bestimmten Stelle angewendet werden, ohne die Zellen in anderen Bereichen des Chips zu beeinflussen . Mit diesen Verbesserungen hat die mikrofluidische System hier kann Möglichkeiten bieten, die langfristigen Bioeffekte von einzelnen Zellen, wie zum Beispiel den Stoffwechsel, Segregation, Differenzierung und Genexpression nach Kavitation Belichtung oder mechanische Reize durch eine impulsive Strömung erzeugt zu studieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
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