Abstract
I dette manuskriptet, må vi først beskrive fabrikasjon protokoll av en microfluidic chip, med gullprikker og fibronektin-belagte områder på samme glasset underlaget, som nettopp styrer generasjon av tandem bobler og individuelle celler mønstrede nærheten med godt definerte steder og former. Vi viser genereringen av tandem-bobler ved hjelp av to pulsede lasere belyse et par av gull prikker med noen få mikrosekund-tidsforsinkelse. Vi visualiserer boble-boble samhandling og jet formasjon ved høy hastighet bildebehandling og karakterisere den resulterende strømningsfeltet ved hjelp av partikkel bilde velocimetry (PIV). Til slutt presenterer vi noen anvendelser av denne teknikken for enkelt celle analyse, inkludert cellemembranen poration med makromolekyl opptak, lokalisert membran deformasjon bestemmes av forskyvninger av vedlagte integrin-bindende perler, og intracellulær kalsium respons fra ratiometrisk bildebehandling. Våre resultater viser at en rask og retningsstrålestrømmen er prosert ved tandem boblen interaksjonen, som kan pålegge en sterkt lokalisert skjærspenning på overflaten av en celle dyrket i umiddelbar nærhet. Videre kan forskjellige bioeffekter bli indusert ved å endre styrken av høytrykks-spylestrømningen ved å justere veggavstanden fra cellen til tandem-bobler.
Introduction
Det er en økende erkjennelse av at cellulær heterogenitet, som oppstår fra den stokastiske ekspresjon av gener, proteiner og metabolitter, eksisterer i en stor cellepopulasjon og tjener som et grunnleggende prinsipp i biologi for at cellene skulle tilpasning og evolusjon 1. Derfor er det ofte unøyaktig og upålitelig å benytte populasjonsbaserte massemålinger for å forstå funksjonen av de enkelte celler og deres vekselvirkninger. Utvikle ny teknologi for enkelt-celle analyse er derfor av stor interesse for biologisk og farmakologisk forskning, og kan anvendes, for eksempel for å bedre forstå de viktigste signalveier og prosesser i stamcellebiologi og cancerterapi 2-4. I de senere år har fremveksten av microfluidic plattformer meget lettere enkelt-celle-analyse, hvor posisjoneringen, behandling og observasjon av responsen fra individuelle celler er blitt utført med nye analytiske strategier 5.
Kavitasjon spiller en viktig rolle i et mangfoldig spekter av biomedisinske applikasjoner, inkludert behandling av kreft ved høy intensitet fokusert ultralyd (HIFU) 6, non-invasiv fragmentering av nyrestein av sjokkbølgen lithotripsy (SWL) 7, narkotika eller genet levering ved sonoporation 8, og den nylig rapportert ødeleggelse av celler eller vev ved å hydrodynamisk kavitasjon boble 9,10. Til tross for dette er de dynamiske prosesser av kavitasjon boble (e) interaksjoner med biologisk vev og celler er ikke godt forstått. Dette skyldes tilfeldig i kavitasjon innvielses og boble dynamikk produsert av ultralyd, sjokkbølger, og lokale hydraulisk trykk; dessuten er det en mangel på slik at teknikker for å løse de iboende komplekse og rask respons av biologiske celler, spesielt på enkeltcellenivå.
På grunn av disse utfordringene, er det ikke overraskende at svært få studier har been rapportert å undersøke boble-celle interaksjoner under godt kontrollerte eksperimentelle forhold. For eksempel, membran poration av individuelle celler fanget i suspensjon 11 og impulsive store deformasjoner av menneskelige røde blodceller 12 er påvist ved hjelp av lasergenererte enkeltbobler i microfluidic kanaler. Den sistnevnte teknikk, kan imidlertid bare fremstille meget liten deformasjon i eukaryote celler på grunn av tilstedeværelsen av kjernen 13. Dessuten er det vanskelig å overvåke nedstrøms bioeffekter ved behandling av celler i suspensjon. I andre studier har ultralyd eksitasjon av en celle-bundet med mikrobobler (eller ultralydkontrastmiddel) for fremstilling av membranen poration og / eller intracellulære kalsium-respons i enkelt adherente celler er rapportert 8. Membran poration av enkle adherente celler kan også fremstilles ved hjelp av lasergenererte tandem bobler i et tynt væskelag som inneholder lysabsorberende Trypan blå løsning 14, ellerav en oscillerende gassboble som genereres av mikro laserpulser bestråling gjennom et optisk absorberende substrat i microchambers 15. Når sammenlignet, har det optisk absorberende substrat en fordel i forhold til laser-absorberende Trypan blå løsning, fordi den sistnevnte er toksisk for cellene. Enda viktigere, lasergenererte bobler er mer kontrollerbar i form av boblestørrelse og plassering enn akustisk glade bobler. Ikke desto mindre, i alle disse tidligere studier, celle form, orientering og adhesjon betingelser ble ikke kontrollert, noe som i vesentlig grad kan påvirke celleresponsen og bioeffekter produsert av mekaniske spenninger 16.
For å overvinne disse ulemper i tidligere undersøkelser, har vi nylig utviklet et forsøkssystem for bobledannelse, celle mønster, boble-boble-celleinteraksjoner, og sanntids-bioanalyser av cellerespons i et mikrofluidbrikken konstruert ved hjelp av en unik kombinasjon av microfabrication techniques. Tre viktigste funksjonene som skiller våre eksperimentelle system fra andre i feltet er: 1) fordelingen av mikron-størrelse gull prikker på glasset underlaget å aktivere lokalisert laser absorpsjon for bobledannelse 17; 2) mønstring av mikronstørrelse øyene ekstracellulære matriks (ECM) for celle adhesjon på det samme substratet til å styre både plasseringen og formen av de enkelte celler; og 3) komprimering av den dimensjon av boble-bubble-celle-interaksjon domene fra 3d til en kvasi-2D plass for å forenkle i planet visualisering av boble-boble interaksjoner, spyling strømningsfelt, celle deformasjon, og bioeffekter, alt tatt i en strømlinjeformet bildesekvens (figur 1d).
Figur 1: mikrofluid brikken og skjematisk av ulike analyser. a) En montert microfluidic chip med kanaler fylt med blått blekk for visualisering. b) Et område inne i mikrofluid brikke med mønstrede celler og gull prikker (avstanden mellom de to gull prikkene i nærhet er 40 um). Mange par av arbeidsenheter kan være anordnet i en kanal. c) Close-up bilde av en enkelt arbeidsenhet bestående av et par gullprikker og en HeLa celle levd opp til celle-mønster regionen. d) Skjematisk av driften. En enkelt celle holder og sprer seg på "H" -formet øy belagt med fibronektin. Et par av kavitasjonsbobler (tandem skum) med anti-fase oscillasjonen blir produsert ved å belyse pulsert laserstråler på gull prikkene (se figur 4a), som fører til generering av en rask og lokalisert stråle beveger seg mot målcellen i nærheten. Cellen kan være deformert, porated for makromolekylære opptak, og / eller stimulert med en kalsium-respons, avhengig av veggavstanden (S d) i cellen til tandem boble.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne plattformen kan videre kombineres med fluorescensanalyser og funksjonaliserte perler festet til celleoverflaten for kavitasjon-indusert bioeffekter. Spesielt, åpner denne plattformen veien for pålitelig og kvantifiserbare analyser på enkeltcellenivå. Inntil nå har vi benyttet anordning for analyse av tandem boble-indusert cellemembran deformasjon, celle poration og intracellulære opptaket, levedyktighet, apoptose, og intracellulær kalsiumrespons. I den etterfølgende protokoll beskriver vi prosessen for fremstilling brikken, og fremgangsmåten for å analysere de forskjellige bioeffekter nevnt ovenfor. Videre er driften av brikken også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microfabrication
MERK: Alle microfabrication prosedyrer er utført i et renrom. En krom Masken er laget før microfabrication, se figur 2.
Figur 2: Skjematisk av kanalen design i mikrofluid brikken og dimensjonene av de arbeidende enheter. a) Maske av de innrettede PDMS microchannels (grønt) og mønstrene på glassubstratet (blå og rød). b) Forstørret bilde av masken design i en representativ del av arbeidsenheten matriser. c) Skjematisk fremstilling av en arbeidsenhet som viser en celle mønster (blå) og et par av gull prikker (rød). Alle lengdeskala vises nederst til høyre. Klikk her for å se et LARger versjon av denne figuren.
- Gold dot mønster
MERK: Arealet av hver gull dot er konstruert for å være innenfor 25-30 mikrometer 2, slik at den er stor nok til å absorbere laserenergi for bobledannelse, men liten nok til å unngå individuelle celler festet seg til det. Et skjematisk diagram for gull dot fabrikasjon er vist i figur 3a.- Glass skyve rengjøring (i en kjemisk hette)
- Spyl glass-slide med aceton etterfulgt av isopropylalkohol (IPA), og deretter tørke den med N2 strømning.
- Sug raset i piraja løsning (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) i 10 min.
- Ta ut lysbildet, skyll den med DI vann, og tørk den med N 2 flow.
- Bake glass-slide på en varmeplate ved 120 ° C i 10 min.
- Unn raset i en plasma asher på 100 W i 90 s.
- Spin-belegg (spin-coating hette)
- Slå på en kokeplate og vent til temperaturen er stabil ved 95 ° C.
- Følg belegget prosedyre:
1000 rpm i 5 s med en 500-rpm / s rampe;
deretter 3000 rpm i 30 s med en 1000 rpm / s rampe. - Fest renset glass-slide på spin-belegger ved å påføre et vakuum.
- Dekk glideflate med P-20 og start belegg oppskrift.
- Gjenta belegningsprosessen for IFV-negative fotoresist.
- Stek raset ved 95 ° C i 60 s og vent til den er avkjølt til romtemperatur.
- Fotolitografi
- krom masken festet inn på maske aligner og sørg for at mønsteret siden vender ned mot lysbildet.
- Sett fotolitografi oppskriften til hardt eksponeringsmodus med 9 s av UV eksponering og raskt justere glasset underlaget med masken.
- Etter gjennomføring av UV-eksponering, bake raset ved 956 C i 1 min, og deretter la den avkjøles til romtemperatur.
- Utvikling
- Utvikle mønsteret på lysbildet i fremkallerløsning for 60 s.
- Fjern lysbildet fra utbygger, skylle den med DI vann, og tørk den med N 2 flow.
- Sjekk mønsteret geometri under et mikroskop, og måle og registrere funksjonen størrelse.
- Gold nedfall (E-stråle fordamping) og lift-off
- Stek raset ved 120 ° C i 5 min, og la den avkjøles til romtemperatur.
- Rengjør lysbilde med plasma i ioneetsning (RIE) maskin i 90 s ved 500 Torr og 100 W.
- Depositum 5 nm Ti og 15 nm av Au på lysbildet ved hjelp av en E-stråle fordamper 17.
- Sug sleiden over natten i et glassbeger inneholdende fotoresist fjerner løsningsmiddel for å fjerne gullet hviler på toppen av NFR motstå.
- Hent raset, flush jegt med aceton etterfulgt av IPA, og tørk den med N 2 flow.
- Tørk lysbildet på en varm plate ved 115 ° C før du rengjør den i oksygen plasma asher på 100 W i 90 s.
- Glass skyve rengjøring (i en kjemisk hette)
- Molekylær-montering mønster av lift-off (MAPL)
Merk: Arealet av hver fibronektin belagt øya er satt til å være innenfor 700-900 mikrometer 2 til rette for tilstrekkelig HeLa celle spredning i en firkant regionen samtidig minimere sjansene for flere celler samles på øya. Et skjematisk diagram for fremstilling av celle-mønster øyene er vist i figur 3b.- spin belegg
- Gjenta trinn 1.1.2, men bruke S1813-positiv fotoresist og en temperatur på 115 ° C.
- justert fotolitografi
- krom masken festet inn på maske aligner og sørge for at siden med mønsteret ned mot lysbildet medgullprikker.
- Sett fotolitografi oppskriften til hardt eksponeringsmodus med 9 s av UV eksponering.
- Rett inn toppen maske med bunnen lysbildet bruker justeringsmerkene, som ligger rundt kanten av masken, som en romlig referanse.
- Sjekk den sentrale delen av masken og kontrollere at mønster funksjonene er riktig justert.
- Fullfør UV eksponering uten en post-bake.
- Utvikling
- Gjenta trinn 1.1.3, men med 45 s med utvikling før tørking på en kokeplate og bevare lagring N2.
- spin belegg
- kjemisk behandling
- Fremstille den passiverende løsning: 0,5 mg / ml PLL-g-PEG i 10 mM HEPES-buffer.
- Hent lysbildet fra oppbevarings N 2 og rengjør den ved hjelp RIE med parameteren innstilling: 500 Torr press, 100 W effekt, og 90-s varighet.
- Pipetter en dråpe av passiviserende oppløsning på et stykke parafin film. </ Li>
- Sandwich løsningen med filmen og raset, og pass på at siden med mønsteret funksjoner vender ned mot film; unngå dannelse av bobler.
- Vent i 45 minutter før du fjerner lysbilde fra filmen.
- Sug raset fortløpende i fotoresist remover, fotoresist remover og DI vann (1: 1), og DI vann, og agitere den i en ultralydbad i 90 s for hver suge.
- Tørk lysbildet på en varmeplate for å fjerne fuktighet før tetting i en eksikator og lagrer den i et kjøleskap.
- chip montering
- Gjenta trinn 1.1.1-1.1.4, men med SU8-2025-negative fotoresist og parameterinnstilling omhandlet kalt Microchem protokollen 18, for å fremstille en silikonformen med en fotomaske.
- Fabrikere en PDMS microchannel (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x W x H) og en liten PDMS skive (800 mikrometer brede spor struktur) ved hjelp av myk litografi.
- Punch microchannel for væskeåpninger og rengjør den med tape og deretter med IPA.
- Skjerme det mønstrede område av glassubstratet med PDMS skive, og anvende RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) for å fjerne PLL-g-PEG fra det perifere området.
- Unn microchannel med en redusert dose av RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), og deretter justere den til mønstrede glass substrat (med den lille PDMS skive fjernet); bringe microchannel og mønstrede glass underlaget i konforme kontakt under et stereoskop.
Figur 3: Skjematisk diagram for microfabrication og chip montering. a) Mønster av gullprikker på glasset underlaget. b) Fremstilling av glassubstratet for celle mønster via MAPL. c) Montering av microfluidic kanal med plasma binding. Se Materials List for definisjonene of forkortelsene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Cell vedlegg
MERK: HeLa-celler blir rutinemessig opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS og 1% antibiotisk / antimitotisk oppløsning i en cellekulturinkubator. Et skjematisk diagram for det chip montering og cellebinding er vist i figur 3c.- Prime chip med PBS i 30 minutter ved 1 mL / min, og deretter sette mot fibronectin-løsning (50 ug / ml i PBS, 1 mL / min) i 45 min.
- Mens de venter, trypsineres cellekultur med 0,25% trypsin-EDTA, vaske dem i kulturmedium, sentrifugeres individuelle celler, og rekonstituere cellesuspensjonen i forvarmet (37 ° C) kulturmedium ved 5x10 6 celler / ml.
- Sett på fibronektin oppløsning med PBS og spyle brikken ved 10 mL / min i 5 min.
- Injiserden fremstilte cellesuspensjonen inn i brikken, stoppe strømmen, klemme utløpet, og opprettholde brikken i en cellekulturinkubator i 30 min.
- Slipp utløp og skyll chip med cellekulturmedium ved 10 mL / min for 5 min. Reduser perfusjon strømningsmengden av kulturmedium til 0,75 mL / min og opprettholde cellekulturen i 2 timer i inkubatoren.
2. Bubble Generation og Flow visualisering
MERK: En skjematisk fremstilling av det eksperimentelle oppsettet er vist i figur 4a for tandem bobledannelse og den resulterende strømnings interaksjon med en enkelt celle dyrket i nærheten i et mikrofluidkanal.
- Generering av tandem bobler med to lasere og tidsstyring
- Plasser microfluidic chip på scenen av en invertert mikroskop og juster foci av to puls Nd: YAG lasere (λ = 532 nm, 5-ns puls varighet) på et par mønstrede gullprikker separert by 40 mikrometer.
- Bruke en digital forsinkelsesgenerator for å utløse de to lasere med en tidsforsinkelse på 2,5 mikrosekunder for å fremstille to bobler initiert på gull prikker.
- Juster laserutgangsenergi (~ 10 μJ) for å frembringe en maksimal diameter på boblene i løpet av 50 ± 2 um.
- Synkroniser et høyhastighetskamera (200-ns eksponering og 2 millioner bilder per sekund (fps)) for å lasere og fange dynamikken i boblen ekspansjon, kollaps, boble-boble interaksjon, og jet formasjon.
- Kvantifisering av strålehastighet
- Registrere posisjonen til strålespissen (J 1) ved den proksimale ende av den første boble (B 1) og den distale ende av B 1, som starter ved genereringen av den andre boble (B 2) og slutter med landings av J 1 mot den ytre enden av B 1; se skjematisk i figur 5a.
- Lineært passe tidsforløpet av posisjon for both proksimale (jet spissen) og de distale ender. Beregn helningen av spissposisjonen mot tid-kurven for den proksimale enden for å bestemme den strålehastigheten. Skjæringspunktet for de to linjene indikerer jet touchdown tid. Flere detaljer finner du i referanse 19.
- Visualisering av tandem bobleinduserte strømningsfeltet
- Fremstille en um av polystyren (PS) perlesuspensjon i DI-vann (2,6% vekt / volum) og injisere perlene inn i mikrofluid brikken.
- Generer tandem bobler som beskrevet i trinn 2.1.1-2.1.3.
- Noter tandem boble dynamikk ved hjelp av et høyhastighets videokamera i en innramming hastighet på 5 M fps med en 100-ns eksponeringstid.
- Last den oppkjøpte bildesekvensen til en kommersiell PIV programvare.
- Del hvert bilde i mindre forhørs vinduene 16 x 16 piksler (px) med 75% overlapping.
- Påfør multi-pass køyring og regionale filtre for å redusere feil i hastighetsfeltet beregning, ogutgangs resultatene i en hastighetsvektor kart.
Figur 4: Skjematisk av eksperimentelle oppsettet og bildeopptak. a) Eksperimentell oppsett for tandem boble generasjon. b) Tid sekvens brukes til ulike typer bildebehandlings oppkjøp. FL: fluorescens mikroskopi, BF: lyse feltet, IFT: inter tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Single-celle Analyse og bioeffekter
MERK: tandem boblefremstilles ved siden av målcellene, og de resulterende bioeffekter er studert i en veggavstanden avhengig måte. Den tidssekvens for ulike typer bilde kjøp er vist i figur 4b.
- Membran poration og makromolekylær opptak
MERK: Opptaket av ekstracellulære makromolekyler inn i målcellen er kjennetegnet ved gradvis diffusjon av membran impermeant propidiumjodid (PI) gjennom poration området på cellemembranen.- Følgende trinn 1.5, erstatte en vanlig kulturmedium (dvs. DMEM) med PI-oppløsning (100 ug / ml i DMEM) som kjører på en perfusjon strømningshastighet på 0,5 mL / minutt gjennom hele forsøket.
- Programmere mikroskop kontroll programvare for å velge automatisk PI fluorescerende kuben på den roterende turret og synkronisere timingen av CCD kamera med PI fluorescens eksitasjon å fange fluorescens bilder med en eksponeringstid på 200 ms.
- Etter at de to laserbrennpunktene er justert til et par av gull punkter ved siden av en målcelle, ta opp både lyse felt (BF) og fluorescens (FL) bilder før den tandem boblen behandling.
- Bruk mikroskop kontroll programvare for å umiddelbartstarter en tidsintervall fluorescens bildeopptak av målcellen kort tid etter trinn 2.1 for å fange historien til PI-opptak.
- membran deformasjon
- Fremstille en-um-kuler (1% w / v, aktivert med vannløselig karbodiimid) og funksjonalisere dem med peptid-2000 (100 ug / ml i PBS).
- Følgende trinn 1,5, inkuberes de festede celler med de funksjonaliserte perler i en tetthet på 1x10 9 perler / ml ved 37 ° C i 30 minutter.
- Gjenta trinn 2.1 til å produsere tandem bobler ved siden av målcellen og registrere mobil deformasjon med en ultra-high-speed kamera kjører på en innramming rate på 5 millioner fps.
- Identifisere en triade av 3 perler som forblir på bildeplanet gjennom hele eksperimentet og kompilere sine posisjoner som (x 1, y-1) (x 2, y 2), og (3 x, y 3) i eksperimentet koordinater.
- Beregne arealet av triaden før og afTER tandem boble behandling ved hjelp av formelen:
- Beregn belastningen området som:
- Basert på koordinatene til de tre hjørnene før og etter tandem boblen behandling, beregne den lokale hovedstammen og område belastning følge etablerte protokoller 20,21.
- Livskraftig og apoptose
MERK: FITC Annexin V etiketter celler, inkludert apoptotiske seg, gjennom eksternalisering av fosfatidylserin (grønn fluorescens). PI etiketter kjerner av nekrotiske celler (rød fluorescens). Bright feltet bildebehandling brukes til å dokumentere celle morfologi og å hjelpe til med identifisering av celle levedyktighet og apoptose.- Registrere posisjonen for hver behandlede celle i mikrofluidkanalen (kles ved adresseetiketter i kanalen, se figur 2b
- Inkuber de behandlede celler i cellekulturmediet i ytterligere 2 timer før perfusert brikken med FITC Annexin V-løsning i 15 min. Positive celler viser grønn fluorescens.
- Gjenta trinn 3.3.2 24 timer etter at tandem boble behandling for å studere de langsiktige bioeffekter i målrettede cellene.
- kalsium svar
- Bland 3 mL av Fura-2 AM stamoppløsning (1 mg / ml i DMSO) med 3 mL av 10% w / v Pluronic F-127 i 500 ul av redusert serummedium for å fremstille den endelige merking oppløsning (6 uM).
- Følgende trinn 1.5, erstatte cellekulturmediet med merking løsning og inkuberes ved romtemperatur i mørke i 40 min (1 mL / min perfusjonshastighet).
- Påfyll kanalen med redusert serum medium (0,75 mL / min perfusjon rate) før du starter celle eksperimentet.
- Begynn proporsjonal imaging (bølgelengde: 340/380 nm, 50-ms eksponering)av målcellen ved hjelp av kommersielt PTI-systemet.
- Etter 10 s med ratiometrisk avbildning av cellen ved hvilenivå, produsere tandem bobler som i trinn 2.1; første plate med en inter tid (IFT) av 0,1 s i 1 minutt, og deretter øker den IFT til 1 s for en annen min, og videre opp til 5 s etter 2 min.
- Bruk PTI programvare for å beregne forholdet R = F340 / F380 i området av interesse (ROI), som er proporsjonal med den intracellulære kalsiumkonsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mikrofluid plattformen som er beskrevet i dette arbeidet kan benyttes til å undersøke boble-boble interaksjoner og for å analysere en rekke kavitasjons-indusert bioeffekter ved enkeltcellenivå. Her presenterer vi flere eksempler for å demonstrere en rekke eksperimentelle studier og biologiske tester som kan utføres i vårt eksperimentelle system. Vi vil først illustrere de transiente interaksjoner av tandem bobler med jet formasjonen, visualiseringen av den resulterende strømningsfelt, og beregning av strålehastigheten (figur 5a). Vi vil da presentere eksempler på tandem boble-indusert lokalisert cellemembranen deformasjon (figur 5b), fant frem membran poration med PI opptak (figur 5c), og intracellulært kalsium respons (figur 5d). Andre eksempler, for eksempel celle levedyktighet og apoptose-assays, kan finnes i referanse 22.
Figur 5a viser et eksempel på tandem boblen interaksjon med stråledannelse, fanges opp av høyhastighets-avbildning, og den resulterende strømningsfeltet avslørt av PIV. Nærmere bestemt, etter sin maksimale utvidelse, blir sammenbruddet av den første boblen B 1 (fremstilt ved 0 us) forvrengt asymmetrisk ved den raske ekspansjonen av den andre boblen B 2 (produsert ved 2,5 us), som fører til dannelsen av en "oppadgående" trålen (J 1) på 3.4 mikrosekunder, og den etterfølgende spylestrømningen, som er vist på 5,4 us. Den gjennomsnittlige strålehastigheten er bestemt av helningen av en montert linje til stillingen av den proksimale ende (eller stang) av B 1 før landing (dvs. i kontakt med den distale ende av B 1) som funksjon av tiden. Den gjennomsnittlige strålehastigheten er funnet å øke fra 20 til 58 m / s når den maksimale diameter av B 2 øker fra 40 til 60 um. Basert på resultatene av PIV-analyse, retningsbestemt spylestrømmen rundt tandem boblen er av størrelsesorden 10 m / s og er begrenset innenfor en bredde i størrelsesorden 10 um. Det er således i stand til å produsere en impulsiv og lokalisert skjærspenninger og stress-gradient på en målcelle dyrket i nærheten.
Et annet eksempel er vist i figur 5b illustrerer den cellemembranen deformasjon induseres ved retningsbestemt og lokalisert spylestrømningen frembringes av tandem bobler på veggavstanden S d = 40 um. Membranen deformasjon og gjenvinning er fremhevet ved forskyvning av en funksjonalisert vulst (angitt av den gule stiplet linje) som er festet til den fremre kant av cellemembranen. Det lokale området belastning kan beregnes ut fra koordinatene for en triade av tilstøtende perler. En skjematisk av den beregnede maksimale området forandring på forskjellige steder på celleoverflaten, er vist i midten. Forkanten er primært strukket (se grønne sirkler), mens den bakre kant eller lattater sider av cellen er komprimert (som indikert av de røde sirkler), noe som indikerer heterogenitet i cellen deformasjon frembringes av tandem bobleinduserte strålestrømmen. Den tidsmessige variasjon av arealet belastning på cellen forkanten er illustrert på høyre side. Den består av et par raske svingninger i begynnelsen, etterfulgt av en stor og vedvarende strekk i ca 100 ps (FWHM) og en etterfølgende gradvis bedring på en tidsskala på flere ms.
Videre er det store området belastning og belastning integral på celle forkanten kan være ansvarlig for cellemembran poration observert ved liten S d, som vist i Figur 5c. Ved liten S d (dvs. 10 um, eller i noen tilfeller, 20 um) og mellomprodukt S d (dvs, de fleste av 20 og 30 um), en lokalisert membran avbrudd blir indusert, noe som fører til et ubetydelig opptak av ekstracellulært PI inn icytosol. Hvis PI intensitet inne i cellen fortsetter å øke uten metning oppstår nekrose. Til sammenligning, hvis PI intensitet er en størrelsesorden lavere og når et platå innen 10 s etter den tandem boblen behandling, vil repareres poration med sannsynlig celleoverlevelse forekomme, som er videre understøttet av den minimale endringer i cellemorfologi. Ved stor S d (dvs. 40 mikrometer), ubetydelig PI opptak blir funnet følgende tandem boble behandling, noe som indikerer ubetydelig eller ikke-poration. Cellen kan overleve med vanlig vekst og spredning 22. Alt i alt viser resultatene en klar overgang i cellerespons fra nekrose, gjennom repareres membran poration, til ikke-poration i området fra S d ≈ 20-40 um.
Til slutt viser vi resultatene av ratiometrisk avbildning av den intracellulære kalsium-respons utløst ved tandem-bobler i enkeltceller ved forskjellig Sd, spesielt i subletal området S d = 30-50 um (figur 5d). Intensiteten forholdet er proporsjonal med mengden av intracellulært kalsium. Ved liten S d (dvs. 30 um eller, i noen tilfeller, 40 um), en kalsium bølge som forplanter seg fra den fremre kant til den bakre kant er tydelig observert i løpet av få sekunder etter tandem boblen behandling. Etter den intracellulære kalsium når en maksimal konsentrasjon, avtar det langsomt tilbake til hvilenivå i løpet av få minutter. I motsetning til dette, i det store S d (dvs. et flertall av 50 um, eller i noen tilfeller, 40 um), økning av intracellulært kalsium er mye mildere, og ingen tydelig synlig tur kalsium bølge kan identifiseres. Disse to forskjellige kalsium responser kan også skilles fra de intensitetsforholdet versus tidsprofiler, med betydelige forskjeller i toppamplituden av den intensitetsforholdet og stigningstiden fra hvilenivå til toppverdi. På et enda større S d (dvs. over 60 um), kan ingen kalsium-respons observeres. Prosentandelen av HeLa-celler som viser kalsium-respons ved forskjellige S d er oppsummert i figur 5d (til høyre).
Alt i alt har våre resultater vist at, ved å endre styrken av høytrykks-spylestrøm (eller endrer S d), kan en rekke bioeffekter fremstilles i individuelle HeLa-celler under lignende dyrkningsbetingelser, som sannsynligvis korrelert med amplitude og varighet av den mekaniske deformasjonen pålagt på cellemembranen 22.
Figur 5: Resultater fra tandem boble samhandling, cellemembranen deformasjon, membran poration, og kalsium respons analyser. a) Fluid bevegelse og stråleindusert av tandem boble interaksjon. Venstre: Utvalgte bilder viser tandem boble samhandling med jet formasjon og flyte felt avslørt av PIV. Den maksimale diametere til de to bobler er omtrent 50 ± 2 um. Midten: Skjematisk av de jetting tandem bobler, som illustrerer senterakse, for koordinatene (o), og en proksimal og en distal ende (eller stolper) i den første boblen B 1. Høyre: Målt pole stillinger (med feil = ± 1 um) ved den proksimale og distale ende av B 1. b) Cell membran deformasjon. Venstre: Den gule stiplede linjen etiketter forskyvningen av en PS vulst er festet til den fremre kant av cellemembranen, noe som indikerer den lokale membranen deformasjon og gjenvinning. Midten: et skjema som viser toppareal stammer på forskjellige steder på celleoverflaten som vises til venstre. Høyre: Tids kurs i området stammer i midten av cellen ledende. Δ ε er området belastning beregnet based på hovedstammer og Δ Δ er området belastning beregnes på grunnlag av triaden geometri endres. Flere detaljer om området belastning beregning og feilanalyse er dokumentert i Reference 22. c) Cell membran poration. Venstre: lyse felt bilder før og etter tandem boble behandling og time-lapse fluorescens bilder av PI opptak (0 og 120 s). De hvite piler indikerer høytrykks-spylestrømningsretningen. Midten: den typiske forandring i gjennomsnittlig PI intensitet som funksjon av tiden inne i cellene. Høyre: statistiske resultatene av prosentandelen av celler som gjennomgår nekrose (rød), repareres poration (blå), og ikke-poration (grønn) ved forskjellig S d. Antall celler behandlet: N = 9, henholdsvis 14, 14 og 8 for S d = 10, 20, 30, og 40,. Den statistikken feil er ± 1 / √ N. d) Intracellulær kalsium respons. Venstre: sekvenser av Proporsjonellekspansjon bilder som viser de intracellulære kalsium svarene av enkelt celles ved S d på 30 mikrometer og 50 mikrometer. De røde pilene viser stråleretningen. Midten: typiske svarprofiler (ratio-time kurver) på ulike S d. Høyre: sannsynligheten for en kalsiumrespons på forskjellige S d. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| standoff avstand (S d) (um) | Reynolds tall (Re) | gjennomsnittlig skjærspenning (Pa) i YZ plan |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105,08 | 42.21 |
Tabell 1: En liste over parametere for strømningsfysikk fra PIV resultater. Anslått Reynolds tall og i gjennomsnitt skjærspenningen med hensyn til forskjellige avstands avstander (S d). YZ-plan refererer til kanalen bredde x høyde flyet. Den gjennomsnittlige skjærspenning blir estimert fra en høyde på 0 til 7,7 um fra kanalbunnen, fordi cellen høyde i kanalen er rundt 6-7 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-celle analyse, i kombinasjon med levende celle bildebehandling, har kraftig forbedret vår forståelse av de dynamiske og ofte variable prosesser i enkeltceller, som fenotype utvikling og immunrespons 23. I motsetning til den konvensjonelle cellekultur i retter eller kolber, microfluidic systemer gjør nøyaktig styring av mikromiljøet, ned til enkeltcellenivå, i sann tid. Følgelig, fremskritt innen mikrofluidteknologi og teknikker har i stor grad forbedret gjennomstrømning og reproduserbarheten av enkelt-celle analyse. Ved å integrere myk litografi og overflate mønster, kan microfluidic systemer bli ytterligere utviklet for å lette grundig analyse av en enkelt celle respons på komplekse mønstre av spatiotemporally variable stimuli. For eksempel har forbigående kjemiske eller mekaniske signaler er levert til enkeltceller mens deres biologiske eller mekanisk respons ble automatisk registrert og analysert 24. Til tross for denne generelle trenden, har anvendelsen av MicroFluidics til å analysere kavitasjon-indusert bioeffekter på cellenivå er svært begrenset. Mest spesielt, det har bare blitt brukt til boble-indusert membran poration av individuelle celler i suspensjon fanget av micropillars 11. I de fleste studier på heftende celler, er fordelen med å kontrollere cellemorfologi å opprettholde konsistens i dynamiske boble-celle interaksjoner enten utilgjengelig eller i stor grad neglisjert.
Vi har utviklet en mikrofluid system til nøyaktig kontroll initiering, påfølgende ekspansjon, og kollaps dynamikk kavitasjon bobler; boble-boble interaksjoner med jet formasjon; og celleform, orientering, adhesjon mønster, og standoff avstand fra boblene, og dermed gir for reproduserbar høytrykks-spylestrømningen som skal anvendes på individuelle celler under godt kontrollerte eksperimentelle betingelser. Denne romanen microfluidic systemet er ideelt for å utføre grunnleggende studies på kavitasjon boble (e)-celle interaksjoner som er relevante for et variert spekter av terapeutiske ultralyd programmer, for eksempel SWL, HIFU, og sonoporation. Vi har vist at vår mikrofluidsystem kan brukes til å undersøke ulike kavitasjon-indusert bioeffekter, inkludert cellemembranen deformasjon, membran poration, levedyktighet og kalsium-respons, i en mer kontrollerbar og reproduserbar måte. Mest spesielt retnings jetting flyt produsert av tandem bobler tillater oss å undersøke den mekaniske eiendom og kalsium respons i enkeltceller under høye strekk priser som ikke har blitt godt karakterisert. Den lokaliserte, impulsive mekaniske påkjenninger som produseres av en slik spylestrømningen ikke kan oppnås ved konvensjonelle strekk metoder, slik som mikropipette aspirasjon 25 og bruk av optiske og magnetiske 26 pinsett 27. Videre, i motsetning til tidligere studier ved bruk av ultralydkontrastmidler 8,28-30 eller laser-indusert enkelt bubbles 31,32, tilbyr vårt microfluidic system bedre kontroll av celle geometri og heft forhold, og dermed redusere deres betydelig effekt på cellulær respons og bioeffekter 16.
Mens vårt teknikk er pålitelig og reproduserbar, må man følge protokollen forsiktig for å sikre at den eksperimentelle systemet er korrekt gjengitt. Kvaliteten av overflate mønster i microchannel er primært ansvarlig for reproduserbarheten av boble-boble-celle interaksjoner og den kaskade av nedstrøms bioeffekter. For eksempel, for HeLa-celler, må arealet av hver gull dot være rundt 25-30 mikrometer 2 for å sikre stabil bobledannelse samtidig som den hindrer cellene i å klebe. På den annen side, har i området av hver fibronektin-belagt øy til å være rundt 700-900 um 2 for å lette tilstrekkelig spredning av en enkelt celle i et kvadrat og samtidig redusere faren for flere celler som danner aggregater på øya. Alignmentmellom gullprikker og fibronektin-belagte øyer må være nøyaktig utføres ved hjelp av masken aligner for å holde den vinkelfeil innenfor en ° og den aksielle feil i 0,5 um. Dessuten gir dette eksperimentelt system allsidighet i overvåking av en rekke hendelser, med sin tid skala varieres ved størrelsesordener (f.eks boble dynamikk: us, celle deformasjon: ms, membran poration: s, apoptose: h). Derfor er det viktig å nøyaktig styre tidspunktet for bildeopptak og registrering av hver sekvens ved å finjustere triggersignalene (som kontrolleres av en digital forsinkelsesgenerator). Den enkeltcellekultur må være godt opprettholdt i microchannel å minimalisere celle-til-celle variasjon i fenotype (for det meste referert til som morfologi). Derfor er en minimum to-timers inkubasjon nødvendig for cellebinding og spredning på øyene før du fortsetter med nedstrøms cellen behandling. Det anbefales å alltid holde strømningshastigheten i microchannel etter 3 mL / min, slik at flytskyvspenningen som produseres av det sirkulerende kulturmediet på cellen er innenfor det fysiologiske området.
En strømbegrensning av vår teknikk er at tandem boble interaksjon og den resulterende spylestrømningen kan bare brukes på en målcelle en gang, fordi gullet prikker skal ablateres med laserbestråling. Denne ulempe begrenser muligheten for vårt eksperimentelle system for å etterligne bioeffekter produsert av terapeutisk ultralyd, hvor cellene er ofte utsatt for kavitasjon arrangementer. Dette kan imidlertid temp begrensning kan lindres ved å påføre et tynt sjikt av silisiumdioksid for å beskytte gull prikkene fra direkte eksponering i væsken 15. Samlet vår microfluidic systemet tilbyr godt kontrollerte forsøksbetingelser for å undersøke bioeffekter produsert fra kavitasjon boble (e)-celle interaksjoner og har flere unike funksjoner. Først både størrelsen og plasseringen av kavitasjon bobler i vår experimental system kan kontrolleres nøyaktig ved å justere den innfallende laserenergi som absorberes av gull prikker. For det andre, blir geometrien og adhesjon av enkeltceller standardisert av celle mønster for å minimalisere deres effekter på celle responser og bioeffekter, fører til mer reproduserbare resultater. For det tredje, de parallelle arbeidsenhetene i mikrofluid chip utformingen gjør det mulig å studere nedstrøms bioeffekter, så som cellevekst, proliferasjon, og potensielt genekspresjon, etter eksponering kavitasjon, siden hver celle kan adresseres og overvåkes hver for seg. Oppsummert vår microfluidic system og metodikk skape pålitelige boble-boble interaksjoner å studere bioeffekter av individuelle celler med forbedret presisjon.
Vår nåværende brikken er utformet for analyse av enkelt HeLa-celler. Imidlertid er en modifikasjon av mønster øyene for andre pattedyrcellelinjer er også mulig. Flere forbedringer kan gjøres for å ytterligere utvide applikasjonerns av chip. For eksempel kan substitutter for de PLL-g-PEG-molekyler bli undersøkt for å stoppe enkelte mønstrede celler fra å migrere selv etter 24 timer. I tillegg kan nye chip design med microfluidic ventiler bli undersøkt for å styre den lokale mikromiljøet av cellene, slik at kjemikalier som fluorescens-markører eller giftige reagenser vil kun bli brukt på et bestemt sted, uten at det påvirker cellene i andre regioner av brikken . Med disse forbedringene kan microfluidic systemet presenteres her gir muligheter til å studere de langsiktige bioeffekter av enkeltceller, slik som metabolisme, segregering, differensiering og genuttrykk, etter kavitasjon eksponering eller mekaniske stimuli som produseres av en impulsiv flyt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al.
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H.
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
