Abstract
Dans ce manuscrit, nous décrivons d'abord le protocole de fabrication d'une puce microfluidique, avec des points d'or et des régions revêtues de fibronectine sur le même substrat de verre, qui contrôle précisément la génération de bulles en tandem et des cellules individuelles à motifs à proximité avec des emplacements bien définis et des formes. On démontre ensuite la génération de bulles en tandem en utilisant deux lasers puisés illuminant une paire de points d'or avec un temps de retard peu microsecondes. Nous visualisons l'interaction bulle-bulle et la formation de jet par imagerie à haute vitesse et de caractériser le champ d'écoulement résultante à l'aide d'images de particules (PIV). Enfin, nous présentons quelques applications de cette technique pour l'analyse cellulaire unique, y compris la cellule poration de la membrane avec absorption macromolécule, déformation de la membrane localisée déterminée par les déplacements des billes de intégrine de liaison attachés, et la réponse de calcium intracellulaire de l'imagerie ratiométrique. Nos résultats montrent que un flux d'éjection rapide et directionnelle est proproduite par l'interaction tandem bulle, qui peut imposer une contrainte de cisaillement très localisée sur la surface d'une cellule cultivée à proximité. En outre, les différents effets biologiques peuvent être induites en modifiant la résistance de l'écoulement de jet en réglant la distance de sécurité de la cellule pour les bulles en tandem.
Introduction
Il y a une reconnaissance croissante que l' hétérogénéité cellulaire, résultant de l'expression stochastique des gènes, des protéines et des métabolites, existe au sein d' une grande population de cellules et sert un principe fondamental en biologie pour permettre l'adaptation de la cellule et de l' évolution 1. Par conséquent, il est souvent imprécis et peu fiable pour utiliser des mesures en vrac sur la population pour comprendre la fonction des cellules individuelles et de leurs interactions. Le développement de nouvelles technologies pour l' analyse unicellulaire est donc d' un grand intérêt dans la recherche biologique et pharmacologique, et peut être utilisé, par exemple, pour mieux comprendre les voies et les processus de signalisation clés en biologie des cellules souches et la thérapie du cancer 2-4. Au cours des dernières années, l'émergence de plates - formes microfluidiques a grandement facilité l' analyse unicellulaire, où le positionnement, le traitement et l' observation de la réponse de cellules individuelles ont été réalisées avec des stratégies d' analyse nouvelles 5.
Cavitation joue un rôle important dans un large éventail d'applications biomédicales, y compris le traitement des cancers par ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) 6, la fragmentation non-invasive de calculs rénaux par lithotritie par ondes de choc (SWL) 7, l' administration de médicaments ou d'un gène par sonoporation 8, et la destruction récemment rapporté des cellules ou des tissus par hydrodynamique bulle cavitation 9,10. Malgré cela, les processus dynamiques de bulle (s) de cavitation interactions avec les tissus biologiques et les cellules ne sont pas bien compris. Ceci est dû au caractère aléatoire de cavitation d'initiation et de bulle dynamique produites par les ultrasons, les ondes de choc et de la pression hydraulique locale; en outre, il y a un manque de permettre des techniques pour résoudre les réponses intrinsèquement complexes et rapides de cellules biologiques, en particulier au niveau d'une seule cellule.
En raison de ces défis, il est pas surprenant que très peu d'études ont abeillen signalé pour étudier les interactions bulle de cellules dans des conditions expérimentales bien contrôlées. Par exemple, la poration de la membrane des cellules individuelles en suspension piégée 11 et la grande déformation impulsif des globules rouges humains 12 ont été démontrées en utilisant des bulles générées par laser uniques dans des canaux microfluidiques. Cette dernière technique, cependant, ne peut produire de très petites déformations dans des cellules eucaryotes en raison de la présence du noyau 13. Par ailleurs, il est difficile de contrôler les effets biologiques en aval lorsque l'on traite les cellules en suspension. Dans d' autres études, l' échographie excitation d'un micro - bulles lié à la cellule (ou agent de contraste pour ultrasons) pour produire la poration de la membrane et / ou des réponses du calcium intracellulaire dans les cellules adhérentes individuelles a été rapporté 8. Membrane poration de cellules adhérentes simples peut également être produit en utilisant des bulles tandem laser généré dans une mince couche de liquide contenant Trypan solution bleu absorbant la lumière 14, oupar une bulle de gaz oscillante produite par des impulsions laser d' une microseconde irradiant au moyen d' un substrat optiquement absorbant dans microchambres 15. Par comparaison, le substrat d'absorption optique présente un avantage par rapport à la solution de bleu de Trypan laser absorbant parce que ce dernier est toxique pour les cellules. Plus important encore, les bulles de laser générées sont plus contrôlable en termes de taille des bulles et de l'emplacement que des bulles acoustiquement excités. Néanmoins, dans toutes ces études antérieures, la forme de la cellule, l' orientation et les conditions d'adhésion ne sont pas contrôlées, ce qui peut influencer sensiblement la réponse cellulaire et bioeffets produites par des contraintes mécaniques 16.
Pour remédier à ces inconvénients dans les études précédentes, nous avons récemment mis au point un système expérimental pour la génération de bulles, patron de cellules, interactions bulle-bulle de cellules, et en temps réel des essais biologiques de la réponse cellulaire dans une puce microfluidique construit en utilisant une combinaison unique de microfabrication techniques. Les trois principales caractéristiques qui distinguent notre système expérimental des autres dans le domaine sont: 1) la formation de motifs de points d'or de taille micronique sur le substrat de verre pour permettre l' absorption du laser localisé pour la génération de bulles 17; 2) la formation de motifs d'îlots de taille micronique de la matrice extracellulaire (ECM) pour l'adhérence des cellules sur le même substrat pour contrôler à la fois l'emplacement et la géométrie des cellules individuelles; et 3) la compression de la dimension du domaine d'interaction bulle-bulle-cellule de la 3D à un espace-2D quasi pour faciliter la visualisation dans le plan d'interactions bulle-bulle, jet champs d'écoulement, la déformation de la cellule, et bioeffets, tous capturés dans une séquence d'imagerie simplifiée (figure 1d).
Figure 1: La puce et les schémas des différents dosages microfluidique. a) Une puce microfluidique assemblé avec des canaux rempli d'encre bleue pour la visualisation. b) une région à l' intérieur de la puce microfluidique avec des cellules à motifs et les points d'or (la distance entre les deux points d'or à proximité de 40 um). De nombreuses paires d'unités de travail peuvent être disposés dans un canal. c) l' image Close-up d'une unité de travail unique constitué d'une paire de points d'or et une cellule HeLa adhéré à la région de cellule de motif. d) Représentation schématique du fonctionnement du dispositif. Une seule cellule adhère et se répand sur le "H" île en forme revêtue de fibronectine. Une paire de bulles de cavitation (tandem à bulles) avec opposition de phase d' oscillation sont produites par des faisceaux lumineux de laser pulsé sur les points d'or (voir la figure 4a), conduisant à la génération d'un jet rapide et localisée se déplaçant vers la cellule cible à proximité. La cellule peut être déformé, porée pour l' absorption macromoléculaire, et / ou stimuler une réponse de calcium, en fonction de la distance de sécurité (S d) de la cellule à la bulle en tandem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Cette plate-forme peut être combiné avec des dosages de fluorescence et des billes fonctionnalisées fixées à la surface cellulaire pour les effets biologiques induits par cavitation. En particulier, cette plate-forme ouvre la voie à des tests fiables et quantifiables au niveau d'une seule cellule. Jusqu'à présent, nous avons utilisé le dispositif pour l'analyse des bulles d'air en tandem induit la déformation de la membrane cellulaire, la poration de la cellule et l'absorption intracellulaire, la viabilité, l'apoptose et la réponse du calcium intracellulaire. Dans le protocole suivant, nous décrivons le processus de fabrication de puces et de la procédure d'analyse des divers effets biologiques mentionnés ci-dessus. Par ailleurs, les opérations de la puce sont également décrits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microfabrication
NOTE: Toutes les procédures de microfabrication sont effectuées dans une salle blanche. Un masque de chrome est conçu avant la microfabrication, voir la figure 2.
Figure 2: Représentation schématique de la conception du canal dans la puce microfluidique et les dimensions des unités de travail. a) la conception des masques des PDMS microcanaux alignés (vert) et les motifs sur le substrat (bleu et rouge) verre. b) image agrandie de la conception du masque dans une section représentative des tableaux de travail de l' unité. c) Schéma d'une unité de travail montrant un motif de cellule (bleu) et une paire de points d'or (rouge). Toutes les échelles de longueur sont affichés en bas à droite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une larger version de ce chiffre.
- Or dot patterning
REMARQUE: La zone de chaque point d'or est conçu pour être à l'intérieur de 25 à 30 pm2, de sorte qu'il est assez grand pour absorber l' énergie du laser pour la génération de bulles, mais assez petit pour éviter des cellules individuelles qui y adhèrent. Un schéma de principe pour la réalisation de points d'or est représentée sur la figure 3a.- Slide verre nettoyage (dans une hotte chimique)
- Rincer la lame de verre avec de l' acétone suivie de l' alcool isopropylique (IPA), puis le sécher avec N 2 flux.
- Faire tremper la lame dans une solution de piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) pendant 10 min.
- Retirez la lame, le rincer avec de l' eau DI, puis sécher avec N 2 flux.
- Cuire la lame de verre sur une plaque chauffante à 120 ° C pendant 10 min.
- Traiter la lame dans un asher de plasma à 100 W pendant 90 s.
- Spin-revêtement (hotte spin-coating)
- Tourner sur une plaque chauffante et attendre jusqu'à ce que la température est stable à 95 ° C.
- Suivez la procédure de revêtement:
1000 rpm pendant 5 s avec un / s rampe de 500 rpm;
puis 3000 tours par minute pendant 30 s avec un / s rampe de 1000 rpm. - Fixer la lame de verre nettoyé sur la tournette en appliquant un vide.
- Couvrez la surface de glissement avec P-20 et commencer la recette de revêtement.
- Répétez le processus de revêtement pour photoresist NFR négatif.
- Cuire la lame à 95 ° C pendant 60 s et attendre jusqu'à ce qu'il se refroidit à la température ambiante.
- Photolithographie
- Monter le masque de chrome sur le aligneur de masque et assurez-vous que le côté du motif est orienté vers le bas vers la diapositive.
- Réglez la recette de photolithographie en mode d'exposition dur avec 9 s de l'exposition aux UV et rapidement aligner le substrat de verre avec le masque.
- Après la réalisation de l'exposition aux UV, cuire la lame à 956; C pendant 1 min, puis laissez-le refroidir à la température ambiante.
- Développement
- Développer le motif sur la diapositive dans une solution de développement pendant 60 s.
- Retirer la lame du développeur, rincer avec de l' eau DI, et le sécher avec N 2 flux.
- Vérifiez la géométrie du motif sous un microscope, et mesurer et enregistrer la taille de la fonction.
- Dépôt d'or (évaporation par faisceau d' électrons) et lift-off
- Cuire la diapositive à 120 ° C pendant 5 min, et le laisser refroidir à la température ambiante.
- Nettoyer la lame avec le plasma dans la machine de gravure ionique réactive (RIE) pendant 90 s à 500 Torr et 100 W.
- Dépôt de 5 nm de Ti et 15 nm de Au sur la diapositive à l' aide d' un évaporateur E-faisceau 17.
- Faire tremper la lame pendant une nuit dans un récipient en verre contenant photoresist solvant pour éliminer le repos de l'or sur le dessus du NFR résister décapant.
- Récupérer la diapositive, rincer it avec de l' acétone suivie d'IPA et le sécher avec N 2 flux.
- Sécher la lame sur une plaque chaude à 115 ° C avant de le nettoyer dans le plasma asher d'oxygène à 100 W pendant 90 s.
- Slide verre nettoyage (dans une hotte chimique)
- Moléculaire-assemblage de motifs par lift-off (MAPL)
Remarque: La zone de chaque île de fibronectine est réglé pour être dans les 700-900 pm 2 pour faciliter la cellule adéquate HeLa propagation dans une zone carrée , tout en minimisant les chances de multiples cellules d' agrégation sur l'île. Un schéma pour la préparation d'îlots de cellules patterning est représentée sur la figure 3b.- Revêtement de Spin
- Répétez l'étape 1.1.2, mais utiliser photoresist S1813-positive et une température de 115 ° C.
- photolithographie alignés
- Monter le masque de chrome sur le aligneur de masque et assurez-vous que le côté avec le motif est orienté vers le bas en direction de la lame avec lapoints d'or.
- Réglez la recette de photolithographie en mode d'exposition dur avec 9 s de l'exposition aux UV.
- Alignez le masque dessus avec la glissière inférieure à l'aide des repères d'alignement situés sur le bord du masque, comme une référence spatiale.
- Vérifiez la partie centrale du masque et vérifiez que les caractéristiques de modèle sont correctement alignés.
- Terminez l'exposition aux UV sans post-cuisson.
- Développement
- Répétez l' étape 1.1.3 , mais avec 45 s de développement avant le séchage sur une plaque chauffante et la préservation de N 2 stockage.
- Revêtement de Spin
- Traitement chimique
- Préparer la solution de passivation: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG dans du tampon HEPES 10 mM.
- Récupérer la diapositive à partir de N 2 stockage et le nettoyer à l' aide RIE avec le réglage des paramètres: 500 Torr pression, puissance 100 W, et 90 s durée.
- Introduire à la pipette une goutte de solution passivante sur un morceau de film de paraffine. </ Li>
- Sandwich la solution avec le film et la diapositive, faire en sorte que le côté avec le motif fonctionnalités est orientée vers le bas vers le film; éviter la formation de bulles.
- Attendez 45 min avant de retirer la lame du film.
- Faire tremper la lame consécutivement dans photoresist décapant, décapant photoresist et de l'eau DI (1: 1), et de l'eau déminéralisée, et agiter dans un bain à ultrasons pendant 90 s pour chaque trempage.
- Sécher la lame sur une plaque pour enlever l'humidité avant de le sceller dans un dessiccateur et le stocker dans un réfrigérateur.
- assemblage Chip
- Répéter les étapes 1.1.1-1.1.4, mais avec SU8-2025 négatif résine photosensible et le réglage du paramètre appelé le protocole visé Microchem 18, pour préparer un moule en silicone avec un photomasque.
- Fabriquez un microcanal PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x P x H) et une petite dalle de PDMS (800 structure rainurée um-large) en utilisant la lithographie douce.
- Percez le microchannel pour les ports d'accès de fluide et propre avec du ruban adhésif, puis avec de l'IPA.
- Protéger la zone à motif du substrat en verre avec la plaque en PDMS et d'appliquer RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) pour éliminer PLL-g-PEG de la zone périphérique.
- Traiter le microcanaux avec une dose réduite de RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), puis l'aligner sur le substrat de verre imprimé (avec la petite dalle de PDMS enlevée); amener le micro-canal et le substrat en verre à motif en contact conformationnelle sous un stéréoscope.
Figure 3: Schémas pour la microfabrication et la puce ensemble. a) Modèle de points d'or sur le substrat de verre. b) Préparation du substrat de verre pour la formation de motifs de cellule par l' intermédiaire MAPL. c) Assemblée du canal microfluidique avec une liaison de plasma. Voir la liste des matières pour les définitions of les abréviations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Attachement cellulaire
REMARQUE: Les cellules Hela sont maintenues en routine dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques / anti-mitotique solution à 1% dans un incubateur de culture cellulaire. Un schéma de principe pour la fixation de l' assemblage de puce et de la cellule est représentée sur la figure 3c.- Amorçage de la puce avec du PBS pendant 30 min à 1 pl / min, puis faire infuser une solution de fibronectine (50 pg / ml dans du PBS, 1 ul / min) pendant 45 min.
- En attendant, la culture trypsiniser cellulaire avec 0,25% de trypsine-EDTA, lavez - les dans un milieu de culture, les cellules individuelles de centrifugeuses, et reconstituer la suspension cellulaire dans préchauffé (37 ° C) milieu de culture à 5x10 6 cellules / mL.
- Remplacer la solution de fibronectine avec du PBS et rincer la puce à 10 pi / min pendant 5 min.
- Injecterla suspension cellulaire préparée dans la puce, arrêter l'écoulement, la pince de sortie, et à maintenir la puce dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 min.
- Libérer la sortie de la puce et rincer avec le milieu de culture cellulaire à 10 ul / min pendant 5 min. Réduire le débit de perfusion du milieu de culture à 0,75 ul / min et maintenir la culture cellulaire pendant 2 h dans l'incubateur.
2. Bubble Generation and Flow Visualization
REMARQUE: Un schéma du montage expérimental est représenté sur la figure 4a pour la génération tandem bulle et l'interaction de flux résultant avec une seule cellule cultivée à proximité dans un canal microfluidique.
- Génération tandem bulles avec deux lasers et commande de synchronisation
- Placez la puce microfluidique sur la scène d'un microscope inversé et aligner les foyers de deux pulsés lasers Nd: YAG (λ = 532 nm, durée d'impulsion 5 ns) sur une paire de motifs de points d'or b séparésy 40 um.
- Utiliser un générateur de retard numérique pour déclencher les deux lasers avec un retard de temps d'environ 2,5 ms pour produire deux bulles initiées au niveau des points d'or.
- Ajuster l'énergie de sortie du laser (~ 10 uJ) pour produire un diamètre maximal des bulles à l'intérieur de 50 ± 2 um.
- Synchroniser une caméra à grande vitesse (exposition de 200 ns et 2 millions d'images par seconde (fps)) pour les lasers et saisir la dynamique de l'expansion de la bulle, l'effondrement, l'interaction bulle-bulle, et la formation de jet.
- Quantification de la vitesse du jet
- Enregistrer la position de la pointe de jet (J 1) à l'extrémité proximale de la première bulle (B 1) et l'extrémité distale de B 1, à partir de la génération de la seconde bulle (B 2) et se terminant par le touché de J 1 en direction de l'extrémité distale de B 1; voir le schéma de la figure 5a.
- adapter Linéairement l'évolution temporelle de la position de both proximal (pointe du jet) et les extrémités distales. Calculer la pente de la position de la pointe par rapport à la courbe de temps de l'extrémité proximale afin de déterminer la vitesse du jet. L'intersection des deux lignes indique le temps jet d'atterrissage. Plus de détails peuvent être trouvés dans la référence 19.
- Visualisation du champ d'écoulement induite bulle tandem
- Préparer 1 um de polystyrène (PS), la suspension de billes dans de l'eau déminéralisée (2,6% p / v) et injecter les perles dans la puce microfluidique.
- Générer des bulles en tandem comme décrit à l'étape 2.1.1-2.1.3.
- Notez la dynamique tandem à bulles à l'aide d'une caméra vidéo à haute vitesse à un taux d'encadrement de 5 M fps avec un temps d'exposition de 100 ns.
- Téléchargez la séquence d'images acquises dans un logiciel de PIV commercial.
- Diviser chaque image en petites fenêtres d'interrogation de 16 x 16 pixels (px) avec un chevauchement de 75%.
- Appliquer à plusieurs passes itération et les filtres régionaux pour réduire les erreurs dans le domaine de la vitesse de calcul, etsortie les résultats dans une carte du vecteur vitesse.
Figure 4: Schéma du dispositif expérimental et l' enregistrement de l' image. a) Montage expérimental pour la génération tandem bulle. b) la séquence temporelle utilisée pour différents types d'acquisitions d'images. FL: microscopie à fluorescence, BF: champ lumineux, IFT: temps intertrame. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
3. unicellulaire Analyse et effets biologiques
REMARQUE: La bulle est produite en tandem à côté des cellules cibles, ainsi que les effets biologiques obtenus sont étudiés d'une manière dépendant de la distance entretoise. La séquence temporelle des différents types d'acquisitions d'images est représenté sur la figure 4b.
- Membrane poration et l' absorption macromoléculaire
NOTE: L'absorption de macromolécules extra-cellulaires dans la cellule cible est caractérisée par la diffusion progressive de la membrane iodure de propidium imperméant (PI) par le biais du site de poration de la membrane cellulaire.- Suite à l' étape 1.5, remplacer le milieu de culture ordinaire ( par exemple, DMEM) avec une solution de PI (100 pg / ml dans du DMEM) fonctionnant à un débit de perfusion de 0,5 ul / min pendant toute l'expérience.
- La programmation du logiciel de commande du microscope pour sélectionner automatiquement le PI cube fluorescent sur la tourelle rotative et synchroniser la synchronisation de la caméra CCD avec l'excitation de la fluorescence PI pour capturer des images de fluorescence avec un temps d'exposition de 200 ms.
- Après les deux foyers laser sont alignés sur une paire de points d'or à côté d'une cellule cible, record à la fois champ clair (BF) et la fluorescence (FL) images avant le traitement tandem bulle.
- Utilisez un logiciel de contrôle de microscope immédiatementlancer un laps de temps de fluorescence d'enregistrement d'image de la cellule cible, peu de temps après l'étape 2.1 pour capturer l'historique du absorption de PI.
- Déformation de la membrane
- Préparer des billes de 1 pm (1% p / v, activés avec un carbodiimide soluble dans l'eau) et de les fonctionnaliser avec le peptide 2000 (100 pg / ml dans du PBS).
- Suite à l' étape 1.5, incuber les cellules attachées avec les perles fonctionnalisées à une densité de 1x10 9 billes / mL à 37 ° C pendant 30 min.
- Répétez l'étape 2.1 pour produire des bulles tandem à côté de la cellule cible et enregistrer la déformation de la cellule avec une caméra ultra-haute vitesse fonctionnant à un taux de 5 millions de fps de cadrage.
- Identifier une triade de 3 perles qui restent sur le plan d'imagerie tout au long de l'expérience et de compiler leur position de (x 1, y 1) (x 2, y 2), et (x 3, y 3) les coordonnées dans l'expérience.
- Calculer la superficie de la triade avant et after le traitement tandem à bulles en utilisant la formule:
- Calculer la souche de la zone comme:
- Sur la base des coordonnées des trois sommets avant et après le traitement de la bulle en tandem, calculer la déformation et la zone principale souche locale suivant les protocoles établis 20,21.
- Viabilité et apoptose
NOTE: FITC Annexin V marque les cellules, y compris les apoptotiques, par l'externalisation de la phosphatidylsérine (fluorescence verte). PI marque les noyaux des cellules nécrotiques (fluorescence rouge). imagerie du champ lumineux est utilisé pour documenter la morphologie des cellules et pour aider à l'identification de la viabilité cellulaire et l'apoptose.- Notez la position de chaque cellule traitée dans le canal microfluidique (facilitée par les étiquettes d'adresse dans le canal, voir la figure 2b
- Incuber les cellules traitées dans le milieu de culture cellulaire pendant 2 h avant de perfuser la puce avec une solution de FITC Annexine V pendant 15 min. Les cellules positives présentent une fluorescence verte.
- Répétez l'étape 3.3.2 24 h après le traitement tandem de bulle pour étudier les effets biologiques à long terme dans les cellules ciblées.
- Réponse de calcium
- Mélanger 3 ul de Fura-2 heures la solution mère (1 mg / ml dans du DMSO) avec 3 ul de 10% p / v de Pluronic F-127 dans 500 ul de milieu sérique réduit pour préparer la solution de marquage finale (6 uM).
- Suite à l'étape 1.5, remplacer le milieu de culture cellulaire avec la solution de marquage et incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 40 min (1 pl / de débit de perfusion min).
- Remplir le canal avec le milieu de sérum réduit (0,75 ul / débit de perfusion de minutes) avant de commencer l'expérience cellulaire.
- Lancer l'imagerie ratiométrique (longueur d'onde: 340/380 nm, une exposition de 50 ms)de la cellule cible en utilisant le système PTI commercial.
- Après 10 s de l'imagerie ratiométrique de la cellule au niveau de repos, produire des bulles en tandem comme dans l'étape 2.1; premier enregistrement avec un temps de intertrame (IFT) de 0,1 s pendant 1 min, puis augmenter l'IFT à 1 s pour un autre min, et augmentation supplémentaire de 5 s après 2 min.
- Utiliser le logiciel PTI pour calculer le rapport R = F340 / F380 dans la région d'intérêt (ROI), qui est proportionnelle à la concentration de calcium intracellulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La plate-forme microfluidique décrit dans ce travail peut être utilisé pour étudier les interactions bulle-bulle et d'analyser une variété de bioeffets induite par cavitation au niveau d'une seule cellule. Ici, nous présentons plusieurs exemples pour démontrer une variété d'études et d'essais biologiques expérimentales qui peuvent être effectuées dans notre système expérimental. Nous allons d' abord illustrer les interactions transitoires de bulles en tandem avec la formation du jet, la visualisation du champ d'écoulement qui en résulte, et le calcul de la vitesse du jet (figure 5a). Des exemples , nous présentons ensuite en tandem de bulle provoquée par la déformation localisée de la membrane cellulaire (figure 5b), mis en évidence la poration de la membrane avec l' absorption de PI (Figure 5c), et la réponse du calcium intracellulaire (figure 5d). D'autres exemples, tels que la viabilité cellulaire et l'apoptose des dosages, peuvent être trouvés dans la référence 22.
figure 5a montre un exemple de la double bulle interaction avec la formation d' un jet, capturée par imagerie à grande vitesse, et le champ d'écoulement qui en résulte révélée par le PIV. Plus précisément, à la suite de son expansion maximale, l'effondrement de la première bulle B 1 (produit à 0 ms) est déformé asymétriquement par l'expansion rapide de la seconde bulle B 2 (produit à 2,5 ms), conduisant à la formation d'une "vers le haut" jet (J 1) à 3,4 ms et le débit d'éjection ultérieure, illustrée à 5,4 ps. La vitesse moyenne du jet est déterminée par la pente d'une ligne équipée pour la position de l'extrémité proximale (ou pôles) de B 1 avant l' atterrissage (c. -à- contact avec l'extrémité distale de B 1) en fonction du temps. La vitesse moyenne du jet se révèle augmenter de 20 à 58 m / s lorsque le diamètre maximal de B 2 augmente de 40 à 60 um. Sur la base des résultats de l'analyse PIV, le flux d'éjection directionnelle autour de la tandem bulle est de l'ordre de 10 m / s et est confiné à l'intérieur d'une largeur de l'ordre de 10 pm. Il est donc capable de produire une contrainte de cisaillement impulsif et localisée et gradient de contrainte sur une cellule cible cultivées à proximité.
Un autre exemple représenté sur la figure 5b illustre la déformation de la membrane cellulaire induite par l'écoulement de jet directionnel et localisée produite par le tandem des bulles au bras de fer distance S d = 40 nm. La déformation de la membrane et de récupération sont mises en évidence par le déplacement d'une bille fonctionnalisée (indiquée par la ligne en pointillé jaune) fixée au bord d'attaque de la membrane cellulaire. La souche de zone locale peut être calculée à partir des coordonnées d'une triade de billes adjacentes. Un schéma du changement de la superficie maximale calculée à différents endroits sur la surface des cellules est indiquée dans le milieu. Le bord d'attaque est principalement tendue (voir les cercles verts), tandis que le bord de fuite ou latcôtés plu- de la cellule sont compressés (comme indiqué par les cercles rouges), ce qui indique une hétérogénéité dans la déformation de la cellule produite par le flux de projection tandem bulle induite. La variation temporelle de la souche de la zone à la fine pointe de la cellule est illustrée sur la droite. Il est composé de quelques oscillations rapides au début, suivis par une extension importante et soutenue d'environ 100 ps (FWHM) et une reprise progressive subséquente sur une échelle de temps de quelques ms.
En outre, la grande déformation de la zone et la souche solidaire à la cellule bord d' attaque peuvent être responsables de la poration de la membrane cellulaire observée à petite S d, comme le montre la La figure 5c. Au petit Sd ( à savoir, 10 um, ou , dans certains cas, 20 pm) et de l' intermédiaire Sd ( à savoir, la majorité des 20 et 30 pm), une rupture de la membrane localisée est induite, ce qui conduit à une absorption ponctuelle de PI extracellulaire enle cytosol. Si l'intensité du PI à l'intérieur de la cellule ne cesse d'augmenter, sans saturation, la nécrose se produit. En comparaison, si l'intensité de la PI est un ordre de grandeur inférieur et atteint un plateau dans les 10 s après le traitement de la bulle en tandem, poration réparables avec la survie cellulaire sera probablement se produire, qui est en outre soutenu par le changement minimal dans la morphologie des cellules. Au grand S d (ie, 40 pm), l' absorption de PI négligeable est trouvée après traitement à bulles en tandem, ce qui indique non-poration négligeable ou. La cellule peut survivre avec une croissance régulière et la prolifération 22. Dans l' ensemble, les résultats montrent une transition claire en réponse cellulaire de la nécrose, par réparables poration de la membrane, à la non-poration dans la gamme de S d ≈ 20-40 um.
Enfin, nous montrons les résultats de l'imagerie ratiométrique de la réponse du calcium intracellulaire provoquée par des bulles en tandem dans des cellules individuelles à différentes Sd, en particulier dans la plage sublétale de S d = 30 à 50 um (figure 5d). Le rapport d'intensité est proportionnelle à la quantité de calcium intracellulaire. Au petit S d (ie, 30 pm ou, dans certains cas, 40 um), une vague de calcium voyageant à partir du bord d' attaque au bord de fuite est clairement observé dans les quelques secondes qui suivent le traitement tandem bulle. Après le calcium intracellulaire atteint un pic de concentration, il se désintègre lentement vers le niveau de repos en quelques minutes. En revanche, au grand S d (ie, une majorité de 50 um, ou dans certains cas, 40 pm), l'augmentation du calcium intracellulaire est beaucoup plus doux, et pas clairement visible vague de calcium voyage peut être identifié. Ces deux réponses calciques différentes peuvent également être distingués de leurs profils de rapport en fonction du temps d'intensité, avec des différences significatives dans l'amplitude de crête du rapport d'intensité et le temps de montée du niveau de repos au picvaleur. S à un encore plus grand d ( à savoir, supérieure à 60 pm), aucune réponse de calcium peut être observée. Le pourcentage de cellules HeLa présentant des réponses de calcium à différents S d est résumé dans la figure 5d ( à droite).
Dans l' ensemble, nos résultats ont démontré que, en modifiant la puissance du flux de jet (ou le changement S d), une variété d'effets biologiques peuvent être produits dans des cellules HeLa individuelles dans des conditions de culture similaire, ce qui est vraisemblablement en corrélation avec l'amplitude et la durée de la déformation mécanique imposée à la membrane cellulaire 22.
Figure 5: Résultats de l' interaction tandem à bulles, déformation de la membrane cellulaire, la poration de la membrane, et des tests de réponse du calcium. a) le mouvement fluide et le jetinduite par l'interaction tandem bulle. A gauche: les cadres sélectionnés montrant les interactions tandem bulle avec la formation de jet et le champ révélé par PIV couler. Les diamètres maximaux des deux bulles sont d'environ 50 ± 2 um. Moyen: Schéma des bulles jet tandem, illustrant l'axe central, l' origine des coordonnées (o), et des extrémités proximale et distale (ou pôles) de la première bulle B 1. À droite: Mesurée pole positions (avec erreur = ± 1 pm) à l'extrémité proximale et distale de B 1. b) la déformation de la membrane cellulaire. A gauche: La ligne en pointillé jaune étiquette le déplacement d'un bourrelet PS fixé au bord d'attaque de la membrane cellulaire, ce qui indique la déformation locale de la membrane et la récupération. Moyen: un schéma montrant la zone de pic des souches à différents endroits sur la surface de la cellule représentée sur la gauche. A droite: Les cours à temps des souches de la région au milieu du bord d'attaque de la cellule. Δ ε est le bas souche zone calculéeed sur les principales souches et Δ Δ est la souche de surface calculée sur la base du changement de géométrie triade. Plus de détails sur le calcul de la déformation de la zone et de l' analyse d'erreur sont documentés dans la référence 22. poration de c) de la membrane cellulaire. Gauche: les images de champ lumineux avant et après traitement tandem de bulle et time-lapse images de fluorescence de PI absorption (0 et 120 s). Les flèches blanches indiquent la direction d'écoulement du jet. Moyen: le changement typique de l'intensité de la PI moyenne en fonction du temps à l'intérieur des cellules. A droite: Les résultats statistiques du pourcentage de cellules subissant une nécrose (rouge), poration réparables (bleu), et non poration (vert) à différentes S d. Nombre de cellules traitées: N = 9, 14, 14 et 8 S d = 10, 20, 30 et 40, respectivement. L'erreur statistique est de ± 1 / √ N. d) réponse du calcium intracellulaire. Gauche: séquences d'images ratiométrique montrant les réponses de calcium intracellulaire de cellules individuelless au S d de 30 um et 50 um. Les flèches rouges indiquent la direction du jet. Moyen: profils de réponse typiques (courbes rapport à temps) à différents S d. A droite: la probabilité d'une réponse différente de calcium à Sd. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| distance de sécurité (S d) (pm) | nombre de Reynolds (Re) | moyenne contrainte de cisaillement (Pa) dans le plan yz |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163.85 | 323,61 |
| 60 | 105.08 | 42.21 |
Tableau 1: Une liste de paramètres pour la physique des flux à partir des résultats de PIV. Estimation du nombre de Reynolds et moyenne contrainte de cisaillement par rapport à différentes distances de sécurité (S d). Le plan YZ se réfère à la hauteur x plan de largeur de canal. La contrainte de cisaillement moyenne est estimée à partir d'une hauteur de 0 à 7,7 um à partir du bas du canal parce que la hauteur de la cellule dans le canal est d'environ 6-7 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse unicellulaire, en combinaison avec l' imagerie des cellules vivantes, a grandement amélioré notre compréhension des processus dynamiques et souvent variables dans des cellules individuelles, telles que le développement du phénotype et la réponse immunitaire 23. Contrairement à la culture cellulaire classique dans des boîtes ou flacons, systèmes microfluidiques permettent un contrôle précis du microenvironnement, jusqu'au niveau d'une seule cellule, en temps réel. Par conséquent, les progrès technologiques microfluidique et les techniques ont largement amélioré le débit et la reproductibilité de l'analyse unicellulaire. En intégrant la lithographie douce et la surface de motifs, les systèmes microfluidiques peuvent encore être conçus pour faciliter l'analyse en profondeur de la réponse d'une seule cellule à des schémas complexes de stimuli spatiotemporellement variables. Par exemple, les signaux chimiques ou mécaniques transitoires ont été livrés avec succès à des cellules individuelles , tandis que leurs réponses biologiques ou mécaniques ont été automatiquement enregistrées et analysées 24. En dépit de cette tendance générale, l'application de la microfluidique pour analyser les effets biologiques induits par cavitation au niveau cellulaire a été très limitée. Plus particulièrement, il a seulement été appliquée induite bulle membrane poration de cellules individuelles en suspension piégés par micropiliers 11. Dans la majorité des études sur les cellules adhérentes, l'avantage de contrôler la morphologie des cellules pour maintenir la cohérence dans les interactions dynamiques bubble-cellulaires est indisponible ou largement négligé.
Nous avons développé un système microfluidique pour contrôler avec précision l'initiation, l'expansion subséquente, et la dynamique de l'effondrement des bulles de cavitation; interactions bulle-bulle avec la formation de jet; et la forme de la cellule, l'orientation, le motif d'adhérence, et la distance d'écartement des bulles, ce qui permet un écoulement de jet reproductible à appliquer à des cellules individuelles dans des conditions expérimentales bien contrôlées. Ce système microfluidique roman est idéal pour la réalisation de st fondamentaleudies sur la bulle (s) de cavitation -Cell interactions qui sont pertinentes pour un large éventail d'applications d'ultrasons thérapeutiques, tels que SWL, HIFU et sonoporation. Nous avons démontré que notre système microfluidique peut être utilisé pour étudier les effets biologiques induits par divers cavitation, y compris la déformation de la membrane cellulaire, la membrane poration, la viabilité et la réponse de calcium, d'une manière plus contrôlable et reproductible. Plus particulièrement, le flux de jet directionnel produit par les bulles tandem nous permet de sonder la propriété et de calcium réponse mécanique dans des cellules individuelles sous contrainte des taux élevés qui ne sont pas bien caractérisées. Le stress mécanique impulsif localisée produite par un tel écoulement de jet ne peut être obtenue par des procédés classiques d' étirage, comme aspiration par micropipette 25 et l'utilisation de l' optique 26 et 27 pinces magnétiques. Bu unique En outre, contrairement aux études précédentes utilisant des agents de contraste ultrasonores 8,28-30 ou induite par laserbbles 31,32, notre système microfluidique offre un meilleur contrôle de la géométrie de la cellule et l' adhérence des conditions, réduisant ainsi leur effet substantiel sur la réponse cellulaire et bioeffets 16.
Bien que notre technique est fiable et reproductible, il faut suivre le protocole prudemment pour assurer que le système expérimental est fidèlement reproduit. La qualité de la formation de motifs de surface dans le microcanal est principalement responsable de la reproductibilité des interactions bulle à bulle-cellule et la cascade d'effets biologiques en aval. Par exemple, pour des cellules HeLa, la zone de chaque point de l' or doit être de l' ordre de 25 à 30 um 2 pour assurer la génération de bulles stables , tout en empêchant les cellules d'adhérer. D'autre part, la zone de chaque île de fibronectine doit être autour de 700-900 pm 2 pour faciliter la diffusion de la adéquate d'une seule cellule dans un carré tout en réduisant le risque de multiples cellules formant des agrégats sur l'île. Alignemententre les points d'or et les îles revêtues de fibronectine doit être effectuée avec précision à l'aide de l'aligneur de masque pour maintenir l'erreur angulaire de 1 ° et l'erreur axiale de 0,5 um. En outre, ce système expérimental offre une polyvalence dans le suivi d' une série d'événements, avec leur échelle de temps modifiée par des ordres de grandeur (par exemple, la dynamique des bulles: ps, déformation cellulaire: ms, poration de la membrane: s, apoptose: h). Par conséquent, il est important de contrôler avec précision le moment de l'acquisition de l'image et l'enregistrement de chaque séquence en affinant les signaux de déclenchement (commandés par un générateur de retard numérique). La culture unicellulaire doit être bien maintenue dans le microcanal pour réduire au minimum la variation de cellule à cellule dans le phénotype (le plus souvent appelé morphologie). Par conséquent, un 2-heures d'incubation minimum est nécessaire pour la fixation des cellules et la diffusion sur les îles avant de procéder à un traitement de cellules en aval. Il est recommandé de toujours garder le débit dans le microchannel sous 3 ul / min, de sorte que la contrainte de cisaillement de l'écoulement produit par le milieu de culture circulant dans la cellule est dans l'intervalle physiologique.
Une limitation du courant de notre technique est que l'interaction tandem à bulles et le débit d'éjection résultant ne peuvent être appliquées à une cellule cible une fois, parce que les points d'or seront ablation par l'irradiation par laser. Cet inconvénient limite la capacité de notre système expérimental pour imiter les effets biologiques produites par des ultrasons thérapeutiques, où les cellules sont souvent exposées à des phénomènes de cavitation. Toutefois, cette limitation temporelle peut être atténué par l' application d'une autre couche mince de dioxyde de silicium pour protéger les points d'or de l' exposition directe dans le liquide 15. Dans l'ensemble, notre système microfluidique offre des conditions expérimentales bien contrôlées pour étudier les effets biologiques produites à partir de la bulle (s) de cavitation interactions -Cell et a plusieurs caractéristiques uniques. Tout d'abord, la taille et l'emplacement de la cavitation des bulles dans notre eSystème Xperimental peut être contrôlé avec précision en ajustant l'énergie laser incidente absorbée par les points d'or. Deuxièmement, la géométrie et l'adhésion des cellules individuelles sont normalisées par un patron de cellules afin de minimiser leurs effets sur les réponses cellulaires et bioeffets, conduisant à des résultats plus reproductibles. Troisièmement, les unités de travail parallèles dans la conception de la puce microfluidique rendent possible d'étudier les effets biologiques en aval, tels que la croissance cellulaire, la prolifération, et potentiellement l'expression des gènes, après une exposition de cavitation, puisque chaque cellule peut être traitée et contrôlée individuellement. En résumé, notre système microfluidique et de la méthodologie de créer des interactions bulle-bulle fiables pour étudier les effets biologiques des cellules individuelles avec une précision améliorée.
Notre puce de courant est conçu pour l'analyse des cellules HeLa individuelles. Toutefois, une modification des îlots de modèle pour d'autres lignées cellulaires mammaliennes sont également possibles. Plusieurs améliorations peuvent être apportées pour élargir davantage le applications de la puce. Par exemple, les substituts des molécules PLL-g-PEG pourraient être explorées pour arrêter les cellules à motifs individuels de migrer même après 24 h. En outre, de nouvelles conceptions de puces avec vannes microfluidiques peuvent être explorées pour contrôler le microenvironnement local des cellules, de sorte que les produits chimiques tels que les marqueurs de fluorescence ou de réactifs toxiques ne seront appliquées à un endroit précis, sans affecter les cellules dans d'autres régions de la puce . Grâce à ces améliorations, le système microfluidique présenté ici peut fournir des occasions d'étudier les effets biologiques à long terme de cellules individuelles, comme le métabolisme, la ségrégation, la différenciation et l'expression des gènes, après une exposition de cavitation ou stimuli mécaniques produites par un flux impulsif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al.
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H.
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
