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Immunology and Infection

गैर इनवेसिव Published: May 8, 2017 doi: 10.3791/55180
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

Summary

यह पेपर फ्लोरोसेंट इमेजिंग के आवेदन को एक सक्रिय ऑप्टिकल इमेजिंग जांच का उपयोग करके बताता है कि सूजन के दो अलग-अलग प्रयोगात्मक मॉडलों में महत्वपूर्ण मैट्रिक्स मेटलॉप्रोटीनिस के विवो गतिविधि की कल्पना करने के लिए।

Abstract

यह पत्र सूजन के दो अलग-अलग माउस मॉडल में विवो प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल इमेजिंग (ओआई) के माध्यम से इमेजिंग मैट्रिक्स मेटलॉप्रोटीनसेस (एमएमपी) -सक्रियता वाले फ्लोरोसेंट जांच के माध्यम से एक गैर-इनवेसिव विधि का वर्णन करता है: एक संधिशोथ गठिया (आरए) और एक संपर्क अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया (सीएचआर) मॉडल। निकट अवरक्त (एनआईआर) विंडो (650 950 एनएम) में तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाश 650 एनएम नीचे तरंग दैर्ध्य की तुलना में गहरा ऊतक पैठ और न्यूनतम संकेत अवशोषण की अनुमति देता है। प्रतिदीप्ति OI का उपयोग करके प्रमुख लाभ यह है कि यह विभिन्न पशु मॉडलों में सस्ती, तेज और आसान है।

सक्रियनीय फ्लोरोसेंट जांच उनके निष्क्रिय राज्यों में ऑप्टिकली चुप हैं, लेकिन प्रोटीज द्वारा सक्रिय होने पर अत्यधिक फ्लोरोसेंट बन जाते हैं। सक्रिय एमएमपी ऊतक के विनाश की ओर ले जाता है और विलंब-प्रकार की अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं (डीटीआरआर) जैसे आरए और सीएचआर जैसे रोगों की प्रगति के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसके अलावा, एमएमपी हैंउपास्थि और हड्डी में गिरावट के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीज़िज और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के जवाब में मैक्रोफेज, फाइब्रोब्लास्ट्स और क्रोंड्रोसाइट्स द्वारा प्रेरित होते हैं। यहां हम एक ऐसी जांच का उपयोग करते हैं जो एमएमपी-2, -3, -9 और -13 की प्रमुख एमएमपी द्वारा सक्रिय हो जाती है और आरए में एमएमपी गतिविधि के करीब अवरक्त प्रतिदीप्ति ओआई के लिए इमेजिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करती है और बीमारी की प्रेरण के 6 दिनों के बाद भी नियंत्रित होती है स्वस्थ कान की तुलना में तीव्र कान (1x चुनौती) और पुरानी (5x चुनौती) सीआरआर के साथ चूहों में दाएं कान पर।

Introduction

रूमेटीइड गठिया (आरए) या सोरायसिस वल्गरिस जैसे ऑटोइम्यून बीमारियों को विलंबित प्रकार के अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं (डीटीआरआर) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। 1 आरए एक आम स्वप्रतिरक्षी बीमारी है, जो कि एरोसिव सिनोव्हाइटिस और संयुक्त विनाश की विशेषता है। 2 इन्फ्लैमड संधिशोथ जोड़ों में घुसपैठ और भड़काऊ कोशिकाओं के प्रसार को प्रदर्शित किया जाता है, जो सूक्ष्म भड़काऊ कोशिकाओं की बढ़ती हुई अभिव्यक्ति है जो पॅनस गठन, उपास्थि और हड्डियों के विनाश के लिए पैदा होती है। 3 , 4 मैट्रिक्स मेटलॉप्रोटीनसेस (एमएमपी) द्वारा कोलेजन जैसे बाह्य मैट्रिक्स अणुओं का विच्छेद, ऊतक रूपांतरण और एंजियोजेनेसिस के लिए आवश्यक है और ऊतक विनाश का कारण बनता है। 5 , 6 संपर्क अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रियाओं (सीएचआर) एक ऑक्सीडेटिव फट के लिए अग्रणी neutrophils के एकत्रीकरण द्वारा विशेषता है। 7 आरए के समान, सीएचआर में एमएमपी शामिल हैंपुरानी सूजन स्थापित करने के लिए टिशू रूपांतरण, सेल माइग्रेशन और एंजियोजेनेसिस में वेद।

आरए की जांच के लिए, ग्लूकोज -6-फॉस्फेट isomerase (GPI) -सिराम इंजेक्शन माउस मॉडल इस्तेमाल किया गया था। जीपीआई के खिलाफ एंटीबॉडी युक्त ट्रांसजेनिक कश्मीर / बीएक्सएन चूहों से 8 सीरम को भोलेदार बीएएलबी / सी चूहों में अंतःक्षेपण किया गया था जिसके बाद जीवापी-सीरम इंजेक्शन (1.1 देखें) के बाद 6 दिन में गले में सूजन के साथ अधिकतम गले में 24 घंटे के भीतर गठिया की सूजन शुरू हुई। पुराने सीएचआर का विश्लेषण करने के लिए, पेट पर सीएनबीएनएलएल / 6 चूहों को ट्रिनीट्रोक्लोरोबेंजेन (टीएनसीबी) के साथ संवेदनशील किया गया था। संवेदीकरण के 1 सप्ताह के बाद दाएं कान को चुनौती दी गई थी (1.1 और 1.2 भी देखें)।

गैर-विनाशकारी छोटे जानवर ओआई फ्लोरोसेंट की जांच में विस्फोट के आधार पर एक तकनीक है, जो किमिल्युमिनेन्सेंट- और बायोल्यूमेन्सेंट-सिग्नल है, जो मुख्यतः पूर्व-क्लिनिक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। अधिग्रहीत अर्द्ध-मात्रात्मक डेटा को अणुओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करता हैअंगों और ऊतकों में स्वस्थ और साथ ही रोगग्रस्त प्रायोगिक जानवरों के मॉडल में न्यूरल तंत्र, और अनुदैर्ध्य अनुवर्ती माप ( जैसे विवो में चिकित्सीय प्रतिक्रिया प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए) को सक्षम करता है। अनुदैर्ध्य अध्ययनों का एक बड़ा फायदा पशु संख्या में कमी है, क्योंकि एक ही जानवर को समय-समय पर विभिन्न चूहों का उपयोग करने के बजाय कई समय बिंदुओं पर अनुवर्ती अध्ययन में मापा जा सकता है। ओआई के संकल्प प्रायोगिक जानवरों में अंगों के विस्तृत कार्यात्मक इमेजिंग और यहां तक ​​कि छोटे ऊतक संरचनाओं की अनुमति देता है।

एक संकीर्ण संचरण स्पेक्ट्रम के साथ विशिष्ट उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग, हल्के निरोधक "अंधेरे बॉक्स" और एक संवेदनशील चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा द्वारा बिखरे हुए प्रकाश से संरक्षण, जो कई उपकरणों में ठंडा किया जाता है -70 डिग्री सेल्सियस तक , प्रतिदीप्ति संकेतों की अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील माप की अनुमति देता है

उत्तेजना के साथ फ्लोरोसेंट एजेंटों का उपयोग करके- औरनिकट-अवरक्त प्रतिदीप्ति खिड़की (650 - 950 एनएम) में उत्सर्जन-स्पेक्ट्रा, संकेत-टू-शोर अनुपात में काफी सुधार किया जा सकता है। निकट-अवरक्त प्रतिदीप्ति खिड़की हीमोग्लोबिन और पानी से संकेत के एक अपेक्षाकृत कम अवशोषण और साथ ही कम पृष्ठभूमि ऑटो प्रतिदीप्ति द्वारा विशेषता है। 9 यह छोटे जानवरों के ऊतकों में 2 सेमी तक की पैठ की गहराई की अनुमति देता है। ओआई-जांच प्रत्यक्ष रूप से एक लक्ष्य को संबोधित कर सकते हैं ( जैसे प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी द्वारा) या लक्ष्य टिश्यू ( जैसे प्रोटीयस द्वारा) में सक्रिय किया जा सकता है। सक्रियता योग्य ओआई जांच ऑप्टिटेक्शनल उनके निष्क्रिय फार्म में चुप हैं क्योंकि फ़ॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) की वजह से शमन की आशंका है, जो अणु में उत्तेजना ऊर्जा को दूसरे डोमेन में स्थानांतरित करती है। यदि डाई को साफ किया जाता है (उदाहरण के लिए एक प्रोटीज़ द्वारा) ऊर्जा अब अणु के भीतर स्थानांतरित नहीं हुई है और ओआई द्वारा एक फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाया जा सकता है। इससे उच्च विशिष्टता वाले ओआई जांच के डिजाइन की अनुमति मिलती हैअलग जैविक प्रक्रियाओं और उत्कृष्ट संकेत से शोर-अनुपातों के लिए y।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल जानवरों की तैयारी में विस्तार से बताते हैं, छवि एमएमपी -2, -3, -9 और विवो में -13 गतिविधि और सूजन के दो प्रयोगात्मक मॉडल (आरए, CHR) के लिए एक सक्रिय OI जांच का उपयोग कर OI माप।

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Protocol

इस पत्र में वर्णित सभी प्रक्रियाओं, प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के दिशानिर्देशों और अंतरराष्ट्रीय मानकों का पालन किया गया था और स्थानीय पशु कल्याण और देश आयोग Tuebingen, जर्मनी की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। 8 - 12 हफ्ते का पुराने बीएएलबी / सी और सी 57 बीएल / 6 चूहों को 12 घंटे पर रखा गया: 12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र और आईसीसी में स्थित और 2 से 5 के समूह में 22 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर मानक पर्यावरणीय परिस्थितियों में पानी और भोजन का उपयोग

1. सामग्री तैयार करना

  1. इन्जेक्शन से पहले सीधे संबंधित डेटा शीट के अनुसार अवरक्त प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए ओआई डाई को पतला करें। वीआईओ में एमएमपी को मापने के लिए सक्रिय OI डाई (680 एनएम पर एक उत्तेजना के साथ व्यावसायिक जांच) 1.5 एमएल 1 एक्स पीबीएस में 20 एनएमएल की एकाग्रता में उपयोग के लिए तैयार है। उपयोग करने से पहले हल को धीरे से हिलाओ या भंवर। ओआई डाई को 2 से 8 डिग्री सेल्सियस तक रोका जा सकता है, जब तक रोशनी से सुरक्षित नहीं हो जाता। अंतःशिरा ( iv ) इंजेक्शन के लिए एक शिरापरक कैथेटर तैयार करना 0.9% खारा समाधान (50 एमएल में हेपरिन के 10 इंजेक्शन इकाइयां) युक्त एक 20 यू (0.5 एमएल) इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें, और एक पॉलीथिलीन कैथेटर से जुड़ी 30 गेज सुई का प्रयोग करें। ओ आई डाई के 2 एनएमओएल प्रति माउस की अनुशंसित खुराक इंजेक्शन

2. रुमेटीयड गठिया और क्रोनिक संपर्क अतिसंवेदनशीलता रिएक्शन का प्रेरण

  1. संधिशोथ:
    1. आरए को प्रेरित करने के लिए ग्लूकोज -6-फॉस्फेट isomerase (GPI) 1: 1 के साथ 1x पीबीएस (200 μL) के साथ एंटीबॉडी (एबी) युक्त 100 μL सीरम को मिलाएं (प्राप्त की गई / बीएक्सएन चूहों 10 से प्राप्त) -80 डिग्री सेल्सियस पर पतला सीरम को स्टोर करें आरए को शामिल करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को मोनैक एट अल द्वारा वर्णित किया गया है । 8
    2. आरए को प्रेरित करने के लिए, प्रत्येक माउस को अपनी पूंछ से धीरे से ऊपर उठाएं और दिन के 0 पर पतला सीरम इंट्राटेरटोनियल ( आईपी ) के 200 μL इंजेक्षन करें।वह प्रयोग इंजेक्शन के बाद माउस सीधे अपने पिंजरे में रखता है।
    3. वैकल्पिक रूप से, एबी इंजेक्शन के पहले प्रत्येक एंकल के टखने व्यास को मापें और "गठिया स्कोर" ( चित्रा 1 ए ) को परिभाषित करें। यांत्रिक मापने वाले यंत्र (माइक्रोमीटर) का उपयोग करते हुए जीपीआई-सीरम के बाद दिन 6 तक टखने की गहराई मापना जारी रखें
    4. आरआई चूहों की पूंछ नस में सक्रिय एमओपी गतिविधि में मापन करने के लिए सक्रिय OI डाई (चरण 1.1 - 1.2) इंजेक्षन करें GPI- सीरम इंजेक्शन के बाद दिन 5 और नियंत्रण चूहों की पूंछ नस में। पूंछ नस इंजेक्शन के बाद ऑप्टिकल इमेजिंग प्रयोगों 24 घंटे प्रदर्शन
  2. अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया से संपर्क करें:
    1. सी 57 बीएल / 6 चूहों के संवेदीकरण के लिए, एसीटोन / तेल के 4: 1 मिश्रण में 5% टीएनसीबी समाधान तैयार करें।
    2. 100% ऑक्सीजन (1.5 एल / मिनट) में वाष्पीकृत की गई 1.5% आईसोफ्लूरन का उपयोग करके सी 57 बीएल / 6 चूहों को एनेस्थेटेज़ करें। एक बार चूहों anesthetized हैं, यह एक आत्म पागल में जगह है ई नाक शंकु (एक 5 एमएल पॉलीथीन सिरिंज कटौती, 1.5 वॉल्यूम% isoflurane ट्यूब से जुड़ा हुआ है) और संज्ञाहरण बनाए रखें। संवेदनाहट के दौरान आंखों की सूखापन को रोकने के लिए जानवरों पर नज़र रखी जानवरों पर आंखों की मरहम लगाने का प्रयोग करें।
    3. पेट को सावधानी से दाढ़ी (2 x 2 सेमी) छोटे जानवर बाल ट्रिमर का उपयोग कर। त्वचा को घायल करने से बचें, क्योंकि इससे जानवर के भीतर अनिर्दिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत हो सकते हैं और अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं।
    4. पशु को संवेदनशील बनाने के लिए 100 μL पिपेट का उपयोग करके मुंडा पेट क्षेत्र में धीरे-धीरे 5% TNCB समाधान के 80 μL को लागू करें। माउस को धीरे से अपने पिंजरे में रखकर सावधानी बरतने के लिए सुनिश्चित करें कि माउस की आंखों को कॉर्नियल की चोट से बचने के लिए बिस्तर के संपर्क में नहीं आते हैं और वसूली चरण के दौरान शरीर के तापमान को कम करने से बचें।
    5. संवेदीकरण के छह दिन बाद, एक 1% टीएनसीबी समाधान (एसीटोन / तेल के 9: 1 मिश्रण में भंग) तैयार करें और दाएं कान पर 20 μL को तीव्र और पुरानी सीएचएसआर को छीलने के लिए एक विंदुक के साथ लागू करें।"> 1
      1. 1% TNCB समाधान एक 100 μL पिपेट का उपयोग कर के 20 μL के साथ सही कान के दोनों किनारों पर 1 चुनौती के साथ शुरू और चुनौती हर दूसरे दिन CHR बटोर पांच बार (संवेदीकरण के बाद दिन 15) अप करने के लिए दोहराने (चित्रा 1 बी) । कान मोटाई मापने दैनिक, एक माइक्रोमीटर मापने डिवाइस का उपयोग कर।
    6. सक्रिय OI डाई (कदम 1.1-1.2) CHR चूहों 12 घंटे चुनौती के बाद इन विवो में एमएमपी गतिविधि को मापने के लिए (680 एनएम पर उत्तेजना के साथ एक व्यावसायिक जांच) इंजेक्षन। ऑप्टिकल इमेजिंग प्रयोगों 24 घंटे के बाद पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन करना (iv)।

3. ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए पशु तैयारी

  1. स्विच माउस चाओ कम या गैर प्रतिदीप्ति चाओ (जैसे, मैंगनीज मुक्त) ऑटो प्रतिदीप्ति के हस्तक्षेप (700 एनएम के आसपास) से बचने के लिए इस्तेमाल किया OI एजेंटों के प्रतिदीप्ति संकेत के साथ करने के लिए (कम से कम 3 दिन इमेजिंग से पहले)।
  2. पशु में रखेंएक संज्ञाहरण बॉक्स के लिए और 1.5 वॉल isoflurane% ऑक्सीजन (1.5 एल / मिनट) के साथ वाष्पीकृत (ऑक्सीजन हवा से बदला जा सकता है, लेकिन एक प्रयोग के भीतर मानकीकृत करने की आवश्यकता है) का उपयोग कर anesthetize।
  3. जब माउस दिख संज्ञाहरण है, एक स्व-निर्मित नाक शंकु में रखें (एक कट 5 एमएल polyethylene सिरिंज, 1.5 खंड isoflurane% ट्यूब से जुड़ा द्वारा निर्माण) और संज्ञाहरण बनाए रखें।
  4. लक्ष्य साइट (2 सेमी x 2 सेमी) एक छोटे पशु बाल ट्रिमर के प्रयोग पर ध्यान से पशु दाढ़ी। त्वचा को घायल करने से बचें, के रूप में इस जानवर के भीतर unspecific फ्लोरोसेंट संकेतों को जन्म दे सकता है और अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं।
    नोट: बाल OI दौरान प्रतिदीप्ति संकेत अवशोषित कर सकते हैं (माउस तनाव पर निर्भर है, और अधिक या कम अवशोषण मनाया जाता है) ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र के आधार पर।
  5. Iv इंजेक्शन के लिए, गर्म पानी में माउस की पूंछ जगह, vasodilation प्रेरित करने के लिए, धीरे शराब के साथ इंजेक्शन स्थल पर त्वचा को साफ, और कम से कैथेटर रखकर शुरूपूंछ के बाहर का साइट। जगह "कट" सुई के किनारे में, 20 डिग्री के कोण पूंछ नस में पर और सिरिंज फिर से निलंबित करके कैथेटर की सही रखने का परीक्षण करें।
  6. कैथेटर सही ढंग से रखा जाता है, तो सिरिंज की जगह और OI जांच (2 nmol) इंजेक्षन। इंजेक्शन के बाद, सिरिंज की जगह और 0.9% खारा पूरी तरह से स्पष्ट polyethylene ट्यूब के मृत मात्रा का हल का 25 μL इंजेक्षन।
    नोट: इस्तेमाल किया OI डाई के ऊतक आधा जीवन समय विवो में एमएमपी गतिविधि को मापने के लिए (680 एनएम पर उत्तेजना के साथ एक व्यावसायिक जांच) 72 घंटे है। एक पूर्ण निकासी सुनिश्चित करने के लिए डाई के एक फिर से इंजेक्शन एक पूर्व इंजेक्शन के बाद 7 दिनों की तुलना में पहले अनुशंसित नहीं है।

4. ऑप्टिकल इमेजिंग

  1. एक काले रंग की प्लास्टिक या कागज चादर दृश्य के क्षेत्र (FOV) के केंद्र में OI-स्कैनर के ब्लैक बॉक्स में रखें।
  2. एक मापने प्रोटोकॉल सेट करें और सही तरंगदैर्ध्य चुनें (उत्तेजना: 680 ± 10 एनएम और ईमिशन: 700 ± 10 एनएम) और इमेजिंग पैरामीटर
    नोट: कुछ ओआई सिस्टमों में, कई इमेजिंग रंगों के लिए सेटअप पूर्व-परिभाषित है
  3. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए सही प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर (निर्माता द्वारा प्रदान) खोलें और सिस्टम को इनिशियलाइज़ करें। अधिकांश सीसीडी कैमरों को अपने काम के तापमान में ठंडा करने की जरूरत है, और यह 10 मिनट लग सकता है। विश्वसनीय परिणाम के लिए, सिस्टम तैयार होने तक प्रतीक्षा करें।
  4. विवो इमेजिंग सिस्टम अधिग्रहण कंट्रोल पैनल में पॉप अप करें और चयनित प्रत्येक फ़िल्टर जोड़ी अनुक्रम में एक छवि का प्रतिनिधित्व करेंगे। इस मामले में, 680 ± 10 एनएम और 700 ± 10 एनएम क्रमशः के साथ वाणिज्यिक डाई के लिए फिल्टर जोड़े और एक उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक छवि प्राप्त करें, और माप (प्रेस "अधिग्रहण अनुक्रम" दबाएं)। अधिक विस्तृत निर्देशों के लिए, निर्माता के मैनुअल को देखें।
  5. छवियों को उचित रूप से लेबल करें और जानकारी को "छवि संपादित करें" में सहेजेंलेबल "खिड़की, पॉप अप होगा जो निम्नलिखित" प्राप्त अनुक्रम "।
  6. OI डाई के इंजेक्शन से पहले प्रत्येक जानवर की एक आधारभूत स्कैन ले लो, या पृष्ठभूमि संकेत अंतर करने के लिए भोली नियंत्रण जानवरों का उपयोग करें।
  7. OI डाई की पूंछ नस इंजेक्शन के बाद ज,, FOV के केंद्र में जानवरों जगह एक स्थिति OI सिस्टम में उच्चतम संकेत मापने के लिए, और माप शुरू करते हैं।
    नोट: महत्वपूर्ण: हाइपोथर्मिया काफी इमेजिंग एजेंट के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं। सुनिश्चित करें कि मंच जानवर की हाइपोथर्मिया से बचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से ऊपर गरम किया जाता है सुनिश्चित करें। इमेजिंग 1 से 5 चूहों के समूह में जानवरों के साथ एक साथ किया जा सकता है। पशुओं की संख्या के आधार पर एक ही समय में मापने के लिए FOV के आकार का चयन करें। आप क्या प्रत्येक माउस दिख रहा है की जाँच करने के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि ले सकते हैं।

5. डेटा विश्लेषण

ध्यान दें: छवि सॉफ्टवेयर निम्नलिखित का उपयोग कर डेटा विश्लेषण करेंनिर्माता के प्रोटोकॉल

  1. आरए की माप के लिए, चित्रा 2 में दिखाए गए अनुसार फोटान उत्सर्जन की कैलिब्रेटेड इकाई का उपयोग करें, जबकि पुरानी सीएचएसआर को प्रतिशत (दक्षता) में संकेत तीव्रता के रूप में चित्रित किया गया है।
  2. ROIs मैन्युअल रूप से आकर्षित करने के लिए, उपकरण प्लेट का उपयोग करें आरए चित्रों के विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत सर्कल का उपयोग करें, प्रत्येक जानवर के सभी टखनों और पंजे में उच्चतम संकेत के आसपास रखा गया। सीएचएसआर का विश्लेषण करने के लिए, चमकीले क्षेत्र की छवि के अनुसार पूरे दाएं और बाएं किनारों के आसपास ROI को रखें
  3. विशिष्ट खींचा आरओआई में फोटॉन उत्सर्जन या संकेत तीव्रता मानों को मापने के लिए, "उपाय" दबाएं प्रणाली वर्णनात्मक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए तैयार आरओआई में मूल्य प्रदान करेगी।

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Representative Results

भोले बीएएलबी / सी चूहों में संधिशोथ संधिशोथ (आरए) को प्रेरित करने के लिए, जानवरों को प्रति दिन जीपीआई के खिलाफ स्वत: एंटीबॉडी (1: 1 कमजोर पड़ने से 1x पीबीएस) के साथ आईपी लगाया गया। इस जीपीआई-सीरम में अधिकतम सूजन (टखने की सूजन) प्रेरित आरए मॉडल दिन 6 पोस्ट इंजेक्शन 11 पर है इसलिए, सक्रिय OI डाई के 2 एनएमएल तैयार किया गया था और दिन में 5 बार गठिया चूहों और स्वस्थ नियंत्रण जानवरों की पूंछ नस में तैयार किया गया था। इंजेक्शन (दिन 6) के बाद 24 घंटे, चूहों की संवेदनाहट और चित्रा 3 ( चित्रा 1 ए )

सीआरआर को प्रेरित करने के लिए, सी 57 बीएल / 6 चूहों को 5% टीएनसीबी के मुकाबले दिन 0 पर मुंह में उतार दिया गया था। 7 दिन के बाद संवेदीकरण 1% TNCB का उपयोग करते हुए दाएं कान पर 1 बड़ी चुनौती शुरू हुई। पुरानी सूजन को प्रेरित करने के लिए पांच चुनौतियों (15 दिन) का प्रदर्शन किया गया। 7 12 वीं के बाद एचई अंतिम चुनौती, OI डाई के 20 nmol iv इंजेक्ट किया गया था। दिन 15, 24 घंटे के बाद इंजेक्शन पर, OI के रूप में ऊपर (चित्रा 1 बी) में वर्णित किया गया था।

चित्र 2 प्रदर्शित करता है हिंद पंजे, टखने और रोग प्रेरण के बाद 6 दिन पर आरए माउस के सामने पंजे में एक स्पष्ट रूप से बढ़ाया प्रतिदीप्ति संकेत, एड़ियों (चित्रा 2A) को नियंत्रित करने के तुलना में। आरए चूहों के अंगों और स्वस्थ चूहों में एमएमपी गतिविधि के biodistribution विश्लेषण हिंद पंजे, टखने में एक जोरदार बढ़ाया संकेत प्रदर्शन किया और आरए चूहों के जोड़ों में विशेष रूप से पंजे सामने। दिलचस्प बात यह है कि हम, सभी मापा आरए चूहों के दोनों गुर्दे में एक बेहतर एमएमपी संकेत निर्धारित जब स्वस्थ नियंत्रण चूहों (चित्रा 2A; दाएं) के गुर्दे की तुलना में। इसके अलावा, हम में से चूहों आरए से ग्रस्त है कि क्या परवाह किए बिना जिगर और आंत में एक उन्नत एमएमपी संकेत मापा जाता। आरए और स्वस्थ चूहों के बीच कोई मतभेद टी में पाए गएवह अग्न्याशय, फेफड़े, तिल्ली और दिल

जीर्ण सीएचआर (दाहिने कान में पांच टीएनसीबी चुनौतियां) के दौरान, हमने स्वस्थ बाएं नियंत्रण कान ( चित्रा 2 बी ) की तुलना में सही सूजन वाले कान पर अत्यधिक वृद्धि हुई एमएमपी गतिविधि को मापा।

इस प्रकार, हमारा डेटा सूक्ष्म बीमारियों के मॉडल दोनों में रोग की प्रगति के दौरान एमएमपी गतिविधि की एक प्रमुख भूमिका का संकेत दे रहा है।

बायोल्युमिनेसिसेंस और फ्लोरेसेंस के लिए टूलसेट की मात्रा का ठहराव, उदाहरण के लिए fluorochrome के pmol या प्रतिदीप्ति व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के लिए अनुमति देते हैं। डेटा 1 में प्रदर्शित किया जा सकता है। गणना: कैमरे पर फोटान घटना की एक अनारिलिब्रेटेड माप प्रदर्शित करता है, 2. रेडियंस (फोटॉन्स): "फोटॉन / सेकंड / सेमी 2 / स्टेरेडियन" में फोटान उत्सर्जन की कैलिब्रेटेड मापन दर्शाता है, जो कि Luminescence इमेजिंग या 3. आर के लिए सिफारिश कीअनुकूली दक्षता (प्रतिदीप्ति): प्रत्यावर्तन माप के लिए सिफारिश की गई प्रति घटना उत्तेजना शक्ति प्रति प्रतिदीप्ति उत्सर्जन चमक,।

ओआई चित्रों का विश्लेषण करते समय चमक यूनिटों के साथ काम करने का एक बड़ा फायदा यह है कि एक प्रयोग के दौरान कैमरे की सेटिंग्स को बदला जा सकता है, और इसका चित्रों या मापन आरओआई डेटा पर कोई असर नहीं पड़ता है, जो आगे की छवियों की तुलना में अलग-अलग आईवीआईएस प्रणालियों से तुलना करने की अनुमति देता है।

ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) ऑप्टिकल छवि में उपयोगकर्ता से ब्याज के विशिष्ट क्षेत्र को इंगित करता है उपकरण पट्टी 3 विभिन्न ROI आकर्षित करने में सक्षम है: माप (छवि के आरओआई में संकेत की तीव्रता को मापता है), औसत पृष्ठभूमि (पृष्ठभूमि के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित क्षेत्र में औसत संकेत तीव्रता को मापता है) या विषय आरओआई (एक विषय जानवर की पहचान करता है एक छवि)।

यदि विषय disएक उच्च अनुचित पृष्ठभूमि सिग्नल खेलता है, लक्ष्य आरओआई से पृष्ठभूमि संकेत (आरओआई) घटाकर पृष्ठभूमि-सही ROI माप प्राप्त करें स्वत: प्रतिदीप्ति या स्वाभाविक रूप से आपकी छवि में पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसिस होने के लिए निर्धारित छवि न्यूनतम शून्य के करीब सेट करें। छवि को स्व-परिभाषित (उपयोगकर्ता विशिष्ट) पृष्ठभूमि छवि (आरओआई) से लिंक करें, जो मुख्य रूप से मापा विशिष्ट छवि के लिए मापा गया था।

चित्रों के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण को गठिया और नियंत्रण एंकल दोनों में ब्याज (आरओआई) के मानकीकृत क्षेत्रों को ड्राइंग करके, साथ ही लिविंग इमेज सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करते हुए सूजन और स्वस्थ कानों में भी प्रदर्शन किया गया। जानवरों की अपर्याप्त संख्या के कारण केवल इस पांडुलिपि में विवो डेटा में वर्णनात्मक सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। गठिया और स्वस्थ टखनों या पंजे की सिग्नल की तीव्रता का विश्लेषण ने गठिया पर नियंत्रण के मुकाबले गठिया में 7 गुना बढ़ाया एमएमपी संकेत तीव्रता दिखायी। एक 3 गुना अधिक एमएमपी संकेत तीव्रता स्वस्थ जानवरों (चित्रा 3 ए) की तुलना में गठिया के चूहों के सामने पंजे में खोजा गया था।

छोड़ दिया चुनौती नियंत्रण कान की तुलना में तीव्र और जीर्ण CHR साथ कान के विश्लेषण से 1 चुनौती है, जो आगे 3 के बाद वृद्धि हुई है और 5 वीं चुनौती जब तक एक ही स्तर पर बने रहे के बाद भी एक काफी वृद्धि हुई एमएमपी संकेत से पता चला है (चित्रा 3 बी) । बाएं कान पर संपर्क एलर्जी की वजह से चूहों की खरोंच के साथ संदूषण का एक परिणाम के रूप में, हम दाएं कोने में आपको थोड़ी वृद्धि हुई एमएमपी संकेत निर्धारित (TNCB नहीं चुनौती दी) नियंत्रण कान। परिणाम, एमएमपी की एक महत्वपूर्ण भूमिका, GPI-गठिया और जीर्ण सूजन के दौरान एक अत्यधिक वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा दिखाई संकेत मिलता है के रूप में OI द्वारा मापा।

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चित्र 1: OI के लिए आरए और CHR मॉडल, रोग प्रेरण के समय पाठ्यक्रम और समय अंक। (ए) C57BL / 6 चूहों में BALB में आरए प्रेरण / ग चूहों (बी) और पुरानी CHR प्रेरण के समय पाठ्यक्रम। Vivo इमेजिंग समय बिंदु में संबंधित का अवलोकन और दोनों मॉडल में एमएमपी गतिविधि को मापने के लिए OI डाई के जुड़े इंजेक्शन समय इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: आर ए, CHR और नियंत्रण पशु में एमएमपी OI। (ए) 6 दिन GPI-गठिया प्रेरण और एक स्वस्थ नियंत्रण माउस (बाईं ओर) के बाद एक गठिया के माउस में मापा एमएमपी गतिविधि के प्रतिनिधि का परिणाम है। काफी अधिक संकेत (रेडियंस (पी / एस / सेमी 2 / sr)) पूर्णांकensity स्वस्थ माउस की तुलना में गठिया में मनाया गया। सही पर छवि हिंद पंजे में एमएमपी गतिविधि प्रदर्शित करता है और टखनों, सामने पंजे, अग्न्याशय, फेफड़े, तिल्ली, हृदय, गुर्दे, OI डाई इंजेक्शन के बाद जिगर और एक बलिदान GPI-गठिया माउस की आंत भी शामिल है। OI सामने पंजे, टखनों और आरए चूहों के हिंद पंजे में एक उच्च संकेत और जिगर और आंत कि क्या चूहों GPI सीरम (आरए चूहों) या नियंत्रण सीरम (स्वस्थ नियंत्रण चूहों) का इंजेक्शन दिया गया हो पर्दाफाश किया। पुरानी CHR (बाएं) और नियंत्रण जानवरों (दाएं) के साथ कान में (बी) एमएमपी प्रतिदीप्ति संकेत। सूजन दाएं कान (चुनौती दी 5 बार) कान नियंत्रित करने के लिए की तुलना में एक उच्च बढ़ाया संकेत प्रदर्शित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2 <br /> चित्रा 3: सूजन और स्वस्थ टखने की अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण और कान ऊतक OI का उपयोग करना। (ए) आरए में प्रतिदीप्ति संकेत और सामने पंजे और टखने के जोड़ों में स्वस्थ पशुओं के अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण। गठिया सामने पंजे और टखने के जोड़ों को प्रदर्शित एक काफी (** पी <0.05) (n = 3) उच्च एमएमपी संकेत स्वस्थ टखने के जोड़ों और सामने पंजे की तुलना में। डेटा ± एसडी मतलब के रूप में प्रस्तुत किया है। (बी) को छोड़ दिया और 1 के बाद सही (चुनौती दी) कान, 3 और 5 वीं चुनौती की अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण। एमएमपी संकेत 5 वीं चुनौती के लिए पहले से काफी वृद्धि हुई है और पहले से ही 3 चुनौती (** पी <0.05) (n = 3) (नियंत्रण कान आंशिक रूप से TNCB के साथ दूषित कर रहे हैं के बाद सही चुनौती दी कान में एक अधिकतम संकेत तीव्रता से पता चला चूहों खरोंच की वजह से। यह एक बेहतर संकेत है जो महत्वपूर्ण नहीं था) का उत्पादन किया। डेटा मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है± SEM। 2 पूंछ विद्यार्थी t- परीक्षण सूजन (GPI-गठिया एड़ियों, सही इलाज किया कान) और नियंत्रण के बीच मतभेद का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था दोनों मॉडलों के लिए (नियंत्रण एड़ियों, अनुपचारित कान छोड़ दिया)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पूर्वकालीन अनुसंधान में विवो आणविक इमेजिंग में गैर-इनवेसिव के लिए ओआई एक बहुत उपयोगी, तेज और सस्ती उपकरण है। ओआई की एक विशेष शक्ति सूजन की प्रतिक्रियाओं जैसे अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं की निगरानी करने की क्षमता है। इसके अलावा, ओआइ एक दिन की एक विस्तृत अवधि के लिए एक बीमारी के दौरान पालन करने के लिए अनुमति देता है, दिन से लेकर सप्ताह तक।

ओआई के विवो इमेजिंग रूपरेखाओं जैसे पॉज़िट्रॉन-एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) में अन्य के पास कई फायदे हैं, क्योंकि यह बहुत ही समय-और लागत प्रभावी है अधिग्रहण के अनुसार अधिकतम पांच जानवरों के साथ उच्च-थ्रुपुट विश्लेषण संभव है। इसके अलावा, कई अलग-अलग जैविक प्रक्रियाओं को लक्षित करने के लिए बड़ी संख्या में जांचें उपलब्ध हैं। 12 आगे शारीरिक संरचना प्रदान करने के लिए, ओआई को अन्य इमेजिंग तकनीकों जैसे एमआरआई या एक्स-रे के साथ जोड़ा जा सकता है एक अन्य सीमा इसकी कम ऊतक पैठ गहराई है जैसे कि एफunctional PET इमेजिंग। इसके अलावा कई अलग अलग जैविक लक्ष्यों पर निशाना जांच की एक बड़ी राशि उपलब्ध हैं। 12

संज्ञाहरण के प्रभाव vivo इमेजिंग में में कम करके आंका नहीं होना चाहिए। जबकि OI परिणामों पर संज्ञाहरण के विशेष प्रभाव अच्छी तरह से विशेषता नहीं कर रहे हैं, हमारे समूह PET इमेजिंग परिणामों पर संज्ञाहरण के प्रभाव कई अध्ययनों में दिखाया गया है। 13, 14, 15 उदाहरण के लिए, फुच्स एट अल। ऐसे पीसीओ 2, पीएच और लैक्टेट के रूप में विश्लेषण किया रक्त पैरामीटर, पहले और बाद में पीईटी अलग श्वास और संज्ञाहरण प्रोटोकॉल का उपयोग स्कैन करता है। यह दिखाया गया था कि, पीसीओ 2 में महत्वपूर्ण परिवर्तन और सचेत ऑक्सीजन या हवा सांस लेने चूहों की तुलना में anesthetized में लैक्टेट स्तर पीईटी परिणाम में महत्वपूर्ण परिवर्तन का नेतृत्व किया। 14 वे निष्कर्ष है कि इस आशय मुख्य रूप से ऑक्सीजन श्वास और subsequen के कारण होता हैपीईटी इमेजिंग में विभिन्न परिणामों के लिए अग्रणी, जानवरों में श्वसन एसिडोसिस के लिए टी।

संज्ञाहरण मापदंडों का मानकीकरण, जैसे ओ 2- एकाग्रता और संवेदनाहारी दवाओं की खुराक, साथ ही हाइपोथर्मिया की रोकथाम व्यवस्थित विफलताओं से बचने में सहायता करती है। बेशक, ओआई भौतिक गुणों से सीमित है जैसे प्रकाश बिखरने, ऊतक ऑटो-प्रतिदीप्ति और प्रकाश क्षीणन 9 कई समूहों ओआई के मैक्रोस्कोपिक परिणामों को विवो फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी या फ्लो साइटमैट्री जैसे अन्य तकनीकों के साथ जोड़कर इन समस्याओं को संबोधित कर रहे हैं।

एमएमपी-विशिष्ट सक्रियण फ्लोरोसेंट जांच द्वारा एमएमपी गतिविधि के विवो इमेजिंग में सीएचएस जैसे सूजन के कई प्रयोगात्मक मॉडलों में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन मस्तिष्क कीश्मिया, 16 महाधमनी, 17 मोनोकार्डियल अवरोधन जैसे रोगों में भी 18और एथेरोस्क्लोरोटिक सजीले टुकड़े 1 9 और साथ ही विभिन्न ट्यूमर मॉडल भी हैं। 20

उदाहरण के लिए, कोर्टेज-रेटामोजो एट अल एमएमपी सक्रियण जांच में इंजेक्शन लगाने से पहले एलसीडी वायुमार्ग की सूजन के एक मॉडल में एमएमपी की विवो गतिविधि की जांच की गई, पहले संवेदनशील माउस में इंवैनल एप्लीकेशन के अंतराल आवेदन के बाद 24 घंटे। 21 एमएमपी गतिविधि के स्थान की पहचान करने के लिए इस समूह के संयुक्त टोमोग्राफिक ओआई, एनआईआर फाइबर ऑप्टिक ब्रोन्कोस्कोपी और इंट्र्रावोलल माइक्रोस्कोपी, बीमारी और उपचार की प्रतिक्रिया को अधिक विस्तार से देखने के लिए। 21

विवो एमएमपी गतिविधि में मापने के लिए अन्य तरीकों में एमएमपी की सक्रिय साइट पर बाध्य होने वाले ज्यादातर एमएमपी का प्रयोग किया जाता है। मैकेन्टीर एट अल एक "पॉलीमर आधारित फ्लोरायोजेनिक सब्सट्रेट" का उपयोग करके विवो ट्यूमर से संबंधित- एमएमपी -7 का पता लगाया, जो कि "प्रोटीओलिटआईसी बीकन "के लिए एक माउस एक्सनॉर्फ़फ़्ट मॉडल में एमएमपी। [ 22] वे दिखाते हैं कि ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा एमएमपी -7 की गतिविधि का चयन किया जा सकता है। [ 23] आगे, ओल्सन एट अल ने" सक्रिय सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड "(एसीपीपी) की जांच की जो कि कई xenograft ट्यूमर मॉडल को लक्षित करते हैं, लेकिन जब तक कि लिंकर को प्रोटीलाइज्ड नहीं किया जाता है, तब तक सेल में विज्ञापन नहीं किया जा सकता। उन्होंने एसीपीपी की जांच की जो एमएमपी -2 और एमएमपी-9 के लिए चयनात्मक हैं। 24 , 25

एकल फोटान उत्सर्जन कंपॉमेटेड टोमोग्राफी (एसपीईसीटी) या पीईटी इमेजिंग के लिए रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ एमएमपी इनहिबिटरों का लेबलिंग एथेरोसलेरोसिस 26 और कैंसर 27 में एमएमपी अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए किया गया था। हाल के एक अध्ययन में एक प्रतिदीप्ति-लेबल एमएमपी अवरोधक की तुलना एमएमपी-सक्रियक जांच से की गई थी। 28 फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एमएमपी अवरोधक ने शोर को कम सिग्नल दिखायाअनुपात एक सक्रिय जांच की तुलना में, लेकिन एक छोटी तेज समय की आवश्यकता है।

नई बायोमार्कर का आकलन करने के pathophysiology के प्रमुख विशेषताओं का उपयोग किया और OI द्वारा मान्य किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, खतरे जुड़े आणविक पैटर्न के जवाब (damps) एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान एक प्रारंभिक घटना है। वोगी एट अल। एक Cy5.5 लीशमैनिया प्रमुख के साथ तीव्र कान त्वचा जिल्द की सूजन, कोलेजन प्रेरित गठिया और संक्रमण के मॉडल में alarmin S100A9 के खिलाफ एंटीबॉडी लेबल सूजन के प्रारंभिक लक्षणों के लिए संवेदनशील बायोमार्कर विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया। 29

अंत में, OI क्लिनिक पूर्व अनुसंधान, जो विवो में रोगों के नए तंत्र को उजागर करने, उपन्यास आणविक लक्ष्य की विशेषता है, साथ ही उपचारात्मक प्रभाव मॉनीटर कर सकता है के लिए एक तेज और कुशल पद्धति प्रतिनिधित्व करता है। फिर भी, पीईटी की तरह अधिक मात्रात्मक तकनीकों के साथ बाद में एक सत्यापन प्रक्रिया के लिए आवश्यक हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम डैनियल बकाला, नेटली अल्ल्मेयर और फंडा के लिए धन्यवाद करते हैं हम पांडुलिपि के संपादन के लिए जोनाथन कॉटन, ग्रेग बॉडेन और पॉल सोबिरन को धन्यवाद देते हैं। यह काम वर्नर सीमेंस फाउंडेशन और एबरहार्ड कार्ल यूनिवर्सिटी ट्यूबिंगन ('प्रोमोशनक्ललेग') के मेडिकल फैकल्टी और सीआरसी 156 (प्रोजेक्ट सी 3) के माध्यम से डीएफजी द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cornergel Gerhard Mann GmbH 1224635 ophthalmic ointment 
Forene Abbott GmbH 4831850 isoflurane
U40 insulin syringe Becton Dickinson and Company 324876
Heparin Sintetica 6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm Reichelt Chemietechnik GmbH+Co 28460 polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 G Becton Dickinson & Co. Ltd. 305106 30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer Vetland Medical Sales and Services LLC -
Artagain drawing paper Strathmore Artist Paper 446-8 coal black
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G Becton Dickinson and Company 305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene Sigma Aldrich GmbH 7987456F TNCB
MMPSense 680 Perkin Elmer  NEV10126 fluorescent imaging dye
Oditest  Koreplin GmbH C1X018 mechanical measurment
Miglyol 812 SASOL - Oil
 BALB/C, C57BL/6 Charles River Laboratories  - Mice used for experiements
PBS Sigma Aldrich GmbH For dilution of the RA serum 
Pipette (100 µL) Eppendorf  Used for TNCB application 
shaver  Wahl  9962 Animal hair trimmer
Living Image  Perkin Elmer  Imaging software to measure OI

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 123 प्रतिदीप्ति इमेजिंग मैट्रिक्स मेटलॉप्रोटीनसेस (एमएमपी) सूजन, रियुमेटोइड आर्थराइटिस (आरए) संपर्क अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया (CHR)
गैर इनवेसिव<em&gt; विवो में</em&gt; प्रतिदीप्ति भड़काऊ एमएमपी गतिविधि के ऑप्टिकल इमेजिंग एक सक्रिय फ्लोरोसेंट इमेजिंग एजेंट का प्रयोग
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Schwenck, J., Maier, F. C.,… More

Schwenck, J., Maier, F. C., Kneilling, M., Wiehr, S., Fuchs, K. Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent. J. Vis. Exp. (123), e55180, doi:10.3791/55180 (2017).

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