Icke-invasiv Published: May 8, 2017 doi: 10.3791/55180

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Johannes Schwenck^1,2, Florian C. Maier¹, Manfred Kneilling^1,3, Stefan Wiehr¹, Kerstin Fuchs¹

¹Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, ²Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, ³Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

Summary

Denna uppsats förklarar tillämpningen av fluorescerande avbildning med en aktiverbar optisk avbildningssond att visualisera aktiviteten av viktiga matrismetalloproteinaser in vivo i två olika experimentella modeller av inflammation.

Abstract

I detta dokument beskrivs en icke-invasiv metod för bildbehandling av matrismetalloproteinaser (MMP) -aktivitet med en aktiverbar fluorescerande prob, via in vivo- fluorescensoptisk bildbehandling (OI), i två olika musmodeller av inflammation: en reumatoid artrit (RA) och en kontakt Överkänslighetsreaktion (CHR) -modell. Ljus med våglängd i det nära infraröda (NIR) fönstret (650-950 nm) möjliggör en djupare vävnadspenetration och minimal signalabsorption jämfört med våglängder under 650 nm. De stora fördelarna med fluorescens OI är att det är billigt, snabbt och enkelt att implementera i olika djurmodeller.

Aktiverbara fluorescerande prober är optiskt tysta i deras inaktiverade tillstånd men blir mycket fluorescerande när de aktiveras av ett proteas. Aktiverade MMP leder till destruktion av vävnad och spelar en viktig roll för sjukdomsprogression vid fördröjd typ överkänslighetsreaktioner (DTHR), såsom RA och CHR. Dessutom är MMP: ernyckel proteaser för brosk och bennedbrytning och induceras av makrofager, fibroblaster och kondrocyter som svar på proinflammatoriska cytokiner. Här använder vi en sond som aktiveras av de viktigaste MMP som MMP-2, -3, -9 och -13 och beskriva ett avbildningsprotokoll för nära infraröd fluorescens OI av MMP-aktivitet i RA och kontrollmöss 6 dagar efter sjukdomsinduktion samt såsom i möss med akut (1x utmaning) och kronisk (5x utmaning) CHR på höger öra jämfört med friska öron.

Introduction

Autoimmuna sjukdomar såsom reumatoid artrit (RA) eller psoriasis vulgaris är graderade såsom fördröjd typ hypersensitivitetsreaktioner (DTHRs). ^En RA är en vanlig autoimmun sjukdom som kännetecknas av erosiv synovit och leddestruktion. ² Inflammerade artritiska leder visar infiltration och proliferation av inflammatoriska celler, en ökad expression av pro-inflammatoriska celler som leder till pannus-bildning, brosk och ben graven. ^{3, 4} Klyvningen av extracellulära matrismolekyler, såsom kollagen av matrismetalloproteinaser (MMP), är väsentlig för vävnadsomvandling och angiogenes och orsakar vävnadsförstörelse. ^{5, 6} Kontakt överkänslighetsreaktioner (CHR) kännetecknas av aggregering av neutrofiler leder till en oxidativ burst. ⁷ I likhet med RA, MMP i CHR är involved i vävnadsomvandling, cellmigration och angiogenes i syfte att upprätta kronisk inflammation.

Att undersöka RA, var glukos-6-fosfatisomeras (GPI) -serum injektion musmodell användes. ⁸ Serum från transgena möss K / BxN innehållande antikroppar mot GPI, injicerades i naiva BALB / c-möss efter vilket reumatisk inflammation började utveckla inom 24 h med ett maximum av ankelsvullnad på dag 6 efter GPI-seruminjektion (se 1,1). Att analysera kronisk CHR, var C57BL / 6-möss sensibiliserades med trinitrochlorobenzene (TNCB) på buken. Höger öra utmanades upp till 5 gånger med början en vecka efter sensibilisering (se även 1.1 och 1.2).

Noninvasive litet djur OI är en teknik baserad på utredning av fluorescent-, chemiluminescent- och bioluminescerande-signaler, som huvudsakligen används i preklinisk forskning in vivo. Den förvärvade semikvantitativ data som ger insikter i MolecUlar mekanismer i organen och vävnaderna hos såväl friska som sjuka experimentella djurmodeller, och möjliggör longitudinella uppföljningsmått ( t.ex. att utvärdera terapeutiska responsprofiler in vivo ). En stor fördel med longitudinella studier är minskningen av djurtal eftersom samma djur kan mätas i uppföljningsstudier vid flera tidpunkter istället för att använda olika möss per tidpunkt. Upplösningen av OI möjliggör detaljerad funktionell bildbehandling av organ och till och med mindre vävnadsstrukturer i försöksdjur.

Användningen av specifika excitations- och emissionsfilter med ett smalt transmissionsspektrum, ett skydd mot spridda ljus genom en ljusbeständig "mörk låda" och en känslig laddad kopplad enhet (CCD) -kamera som kyls i många enheter ner till -70 ° C , Möjliggör mycket specifika och känsliga mätningar av fluorescenssignaler.

Genom att använda fluorescerande medel med excitations- ochUtsläppsspektra i det nära infraröda fluorescensfönstret (650-950 nm), signal-till-brus-förhållandena kan förbättras signifikant. Det nära infraröda fluorescensfönstret kännetecknas av en relativt låg absorption av signalen med hemoglobin och vatten såväl som en låg bakgrunds-auto-fluorescens. ⁹ Detta möjliggör ett penetrationsdjup på upp till 2 cm i vävnaden hos små djur. OI-sonder kan adressera ett mål direkt ( t.ex. av en fluorescensmärkt antikropp) eller kan aktiveras i målvävnaden ( t.ex. genom proteaser). Aktiverbara OI-sonder är optiskt tysta i sin inaktiverade form på grund av Förster-resonansenergiöverföringen (FRET) till en släckningsdel, vilken överför excitationsenergin inuti molekylen till en annan domän. Om färgämnet klyvs (med ett proteas till exempel) överförs energin inte längre inom molekylen och en fluorescerande signal kan detekteras av OI. Detta möjliggör konstruktion av OI-sonder med hög specifikitetY för tydliga biologiska processer och utmärkt signal-till-brus-förhållanden.

Följande protokoll förklarar i detalj preparatet av djuren, OI-mätningarna med användning av en aktiverbar OI-sond till bild MMP-2, -3, -9 och -13-aktivitet in vivo och två experimentella modeller av inflammation (RA, CHR).

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta dokument följde riktlinjerna och internationella normer för vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av den lokala kommittén för djurskydd och etikk i Landkommissionen Tuebingen, Tyskland. 8-12 veckor gamla BALB / c och C57BL / 6-möss hölls på en 12 h: 12 h ljus: mörk cykel och inrymdes i IVC och standardiserade miljöförhållanden vid 22 ± 1 ° C i grupper om 2-5 med vatten och Mat åtkomst ad libitum .

1. Materialberedning

1. Späd OI-färgämnet för nära infraröd fluorescensavbildning enligt respektive datablad direkt före injektionen. Det aktiverbara OI-färgämnet (kommersiell sond med en excitation vid 680 nm) för att mäta MMPs in vivo är redo att användas i en koncentration av 20 nmol i 1,5 ml 1x PBS. Skaka eller virvel skaka lösningen före användning. OI-färg kan förvaras vid 2 - 8 ° C i upp till 6 månader när det skyddas mot ljus. För intravenös (iv) injektioner förbereda en venös kateter. Använda en 20 U (0,5 ml) insulinspruta fylld med 0,9% saltlösning (innehållande 10 injektions enheter heparin i 50 ml), och en 30-gauge nål fäst till en polyetenkateter. Injicera den rekommenderade dosen av 2 nmol per mus av OI färgämne.

2. Induktion av reumatoid artrit och kronisk Kontakt Överkänslighet Reaction

1. Reumatoid artrit:
   1. Späd 100 | il av serum (vunnits från K / BxN-möss ¹⁰⁾ som innehåller antikroppar (AB) mot glukos-6-fosfatisomeras (GPI) 1: 1 med 1 x PBS (200 | il) för att inducera RA. Lagra det utspädda serum vid -80 ° C. Detaljerade förfaranden för induktion av RA beskrivs av Monach et al. ^8.
   2. Att inducera RA, lyfta varje mus försiktigt genom svansen och injicera 200 ul av det utspädda serumet intraperitoneala (ip) på dag 0 av tHan experimenterar. Efter injektionen placera musen direkt tillbaka i buret.
   3. Eventuellt mäta vristdiametrarna för varje vrist, före AB-injektioner och definiera ett "artritisk poäng" ( Figur 1A ). Fortsätt mätning av fotledsvullnad dagligen fram till dag 6 efter GPI-serum med en mekanisk mätanordning (mikrometer).
   4. Injicera det aktiverbara OI-färgämnet (steg 1.1 - 1.2), för att mäta in vivo MMP-aktivitet iv i svansvenen hos RA-möss På dag 5 efter GPI-seruminjektion och i svansvenen hos kontrollmöss. Utför optiska avbildningsexperiment 24 timmar efter injektion av svansvenen.
2. Kontakta överkänslighetsreaktion:
   1. För sensibilisering av C57BL / 6-möss, bereda en 5% TNCB-lösning upplöst i en 4: 1-blandning av aceton / olja.
   2. Anaesthetize C57BL / 6-möss med 1,5% isofluran förångad i 100% syre (1,5 liter / min). När mössen är bedövade placerar du den i en självkänsla En näskegel (en skuren 5 ml polyetylenspruta, ansluten till 1,5 volymprocent isofluranröret) och upprätthåller anestesi. Applicera veterinära ögonsalva på bedövade djur för att förhindra att ögonen torkar medan de bedövas.
   3. Raka noggrant (2 x 2 cm) magen med en liten djurhår trimmer. Undvik att skada huden, eftersom det kan leda till ospecificerade fluorescerande signaler inom djuret och kan påverka resultaten av studien.
   4. Applicera 80 μL av 5% TNCB-lösningen långsamt i området med rakat buk med en 100 μl pipett för att sensibilisera djuret. Placera musen försiktigt tillbaka i buret och se till att musens ögon inte kommer i kontakt med sängkläderna för att undvika hornhinneskador och undvika låga kroppstemperaturer under återhämtningsfasen.
   5. Sex dagar efter sensibilisering, bereda en 1% TNCB-lösning (upplöst i en 9: 1-blandning av aceton / olja) och applicera 20 μL i höger öra med en pipett för att framkalla akut och kronisk CHSR."> 1
      1. Börja med den 1: ^e utmaningen på båda sidor av högra örat med 20 μL 1% TNCB-lösning med en 100 μL pipett och upprepa utmaningen varannan dag upp till fem gånger (dag 15 efter sensibilisering) för att framkalla CHR ( Figur 1B ) . Mät öra tjockleken dagligen, med hjälp av en mikrometer mätanordning.
   6. Injicera det aktiverbara OI-färgämnet (en kommersiell sond med excitation vid 680 nm) (steg 1.1-1.2) för att mäta MMP-aktivitet in vivo i CHR-möss 12 h efter utmaningen. Utför optiska bildbehandlingsexperiment 24 timmar efter injektion i svansvenen ( iv ).

3. Djurberedning för optisk bildbehandling

1. Byt muschow (minst 3 dagar före bildbehandling) till låg eller icke-fluorescenschow ( t ex manganfri) för att undvika störning av auto-fluorescens (omkring 700 nm) med fluorescenssignalen hos de använda OI-agenserna.
2. Lägg djuret itill en anestesi rutan och söva med användning 1,5 vol% isofluran förångas med syre (1,5 L / min) (syre kan ersättas av luft men måste standardiserade inom ett experiment).
3. När musen synligt sövda, placera den i en self-made noskonen (build av en ml spruta polyeten snitt 5, som är ansluten till 1,5 volym-% isofluran rör) och upprätthålla anestesi.
4. Raka djuret försiktigt på målstället (2 cm x 2 cm) med användning av ett litet djur hår trimmer. Undvik att skada huden, eftersom detta kan leda till ospecifika fluorescerande signaler inom djuret och kan påverka resultaten av studien.
   OBS: Hår kan absorbera fluorescenssignalen under OI (beroende på musstammen, mer eller mindre absorption noteras), beroende på regionen av intresse (ROI).
5. För iv-injektion, placera svansen på musen i värmt vatten, för att inducera vasodilatation, försiktigt rengöra huden vid injektionsstället med alkohol, och börja genom att placera katetern vidSvansens distala plats. Placera nålens "snitt" kant i en vinkel på 20 ° i svansvenen och testa den korrekta placeringen av katetern genom att suspendera sprutan igen.
6. Om katetern är korrekt placerad, byt ut sprutan och injicera OI-sonden (2 nmol). Efter injektion byt ut sprutan och injicera 25 μL 0,9% saltlösning för att fullständigt rensa den döda volymen av polyetenröret.
   OBS: Vävnads halveringstiden för det använda OI-färgämnet (en kommersiell sond med excitation vid 680 nm) för mätning av MMP-aktivitet in vivo är 72 h. För att säkerställa ett fullständigt godkännande rekommenderas inte en injektion av färgen tidigare än 7 dagar efter en tidigare injektion.

4. Optisk bildbehandling

1. Placera ett svart plast- eller pappersark i den svarta lådan i OI-scannern mitt i synfältet (FOV).
2. Ställ in ett mätprotokoll och välj rätt våglängd (excitation: 680 ± 10 nm och eUppdrag: 700 ± 10 nm) och bildningsparametrar.
   OBS! I vissa OI-system är inställningen för flera bildfärger fördefinierade.
3. För att välja rätt protokoll för fluorescensbilder, öppna bildhanteringsprogrammet (tillhandahållet av tillverkaren) och initiera systemet. De flesta CCD-kameror måste svalna till sin arbetstemperatur, och det kan ta 10 minuter. För pålitliga resultat vänta tills systemet är klart.
4. Observera in vivo bildhanteringssystem förvärv kontrollpanelen dyker upp och varje valda filterpar representerar en bild i sekvensen. I detta fall förvärva en bild med filterparen för den kommersiella färgen med och en excitations- och emissionsvåglängd på 680 ± 10 nm respektive 700 ± 10 nm och starta mätningen (Tryck på "Acquire-sekvens"). För mer detaljerade instruktioner, se tillverkarens bruksanvisning.
5. Märka bilderna på rätt sätt och spara informationen i "Redigera bildEtiketter" fönstret som dyker upp efter 'Acquire sekvensen'.
6. Ta en baslinje genomsökning av varje djur före injektionen av OI färgämnet, eller använd naiva kontrolldjur att differentiera bakgrundssignalen.
7. h efter svansveninjektion av OI färgämnet, placera djuren i centrum av FOV, i stånd att mäta den högsta signalen i OI systemet, och börja mätningarna.
   OBS: Viktigt: Hypotermi kan avsevärt påverka fördelningen av avbildningsmedel. Se till att steget upphettas till 37 ° C för att undvika hypotermi hos djuret. Avbildning kan utföras samtidigt med djur i grupper om 1 till 5 möss. Välj storleken på FOV, beroende på antalet djur för att mäta samtidigt. Du kan ta ett ljust fält bilden för att kontrollera om varje mus är synlig.

5. Dataanalys

OBS: Utför dataanalys med hjälp av bildbehandlingsprogram eftertillverkarens protokoll.

1. För mätningar av RA, använda den kalibrerade enhet av fotonemissionen, såsom visas i fig 2, medan kronisk CHSR är avbildad som signalintensitet i procent (effektivitet).
2. För att rita ROI manuellt använda verktyget plattan. För analysen av RA bilderna använder ett standardiserat cirkel, placerade runt den högsta signalen i alla fotleder och tassar för varje djur. För att analysera CHSR, placera ROI runt hela höger och vänster öra enligt den ljusa fältbild.
3. För att mäta fotonemission eller signalintensitetsvärden i den specifika dragen ROI, tryck på "åtgärd". Systemet kommer att ge värden i dragen ROI för beskrivande statistisk analys.

Representative Results

För att inducera rheumatoid artrit (RA) i naiva BALB / c-möss injicerades djup ip med autoantikroppar (1: 1 utspädning med 1x PBS) mot GPI på dag 0. Den maximala inflammationen (svullnad i ankeln) i detta GPI-serum inducerades RA-modellen är på dag 6 efter injektion ¹¹ . Därför framställdes 2 nmol av det aktiverbara OI-färgämnet och injicerades iv i svansvenen hos artritmus och friska kontrolldjur på dag 5. 24 h efter injektion (dag 6) mösses bedövades och avbildades såsom beskrivs i avsnitt 3 ( Figur 1A ).

För att inducera CHR sensibiliserades C57BL / 6-möss med 5% TNCB på dag 0 vid den rakade buken. På dag 7 efter sensibilisering började den 1: ^e utmaningen på högra örat med 1% TNCB. Upp till fem utmaningar (dag 15) utfördes för att inducera kronisk inflammation. ⁷ 12 h efter the senaste utmaning, 20 nmol av OI färgämnet injicerades iv. På dag 15, 24 timmar efter injektion, var OI utfördes såsom beskrivits ovan (Figur 1B).

Figur 2 visar en klart förstärkt fluorescens signal i baktassarna, fotleder och framben hos RA-mus på dag 6 efter sjukdomsinduktion, jämfört med kontroll vrister (Figur 2A). Biodistribution analys av MMP-aktivitet i organen hos RA möss och friska möss uppvisade en starkt förstärkt signal i baktassarna, anklar och fore tassar uteslutande i lederna i RA-möss. Interestingly, bestämde vi en förbättrad MMP-signal i båda njurarna hos alla uppmätta RA-möss, jämfört med njurarna hos friska kontrollmöss (figur 2A; höger). Dessutom mätte vi en förbättrad MMP signal i lever och tarm oavsett om möss lider av RA. Inga skillnader mellan RA och friska möss återfanns i tHan bukspottkörtel, lunga, mjälte och hjärta.

Under kronisk CHR (fem TNCB-utmaningar vid höger öra) uppmättes mycket ökad MMP-aktivitet på höger inflammerat öra jämfört med det friska vänster kontrollöret ( Figur 2B ).

Således indikerar våra data en viktig roll för MMP-aktivitet under sjukdomsprogression i båda inflammatoriska sjukdomsmodellerna.

Verktyg för bioluminescens och fluorescens möjliggör kvantifiering av exempelvis pmol av fluorokrom eller antalet celler som uttrycker fluorescens. Data kan visas i 1. Räkningar: visar en okalibrerad mätning av fotonhändelsen på kameran. 2. Radiance (fotoner): Indikerar en kalibrerad mätning av fotonemissionen i "fotoner / sekund / cm ² / steradian", vilket är Rekommenderas för luminescensavbildning eller 3. RAdiant Effektivitet (fluorescens): visar fluorescensutstrålning per incidens excitationskraft, rekommenderad för fluorescensmätningar.

En stor fördel med att arbeta med strålningsenheter vid analys av OI-bilder är att kamerainställningarna kan ändras under ett experiment, och det har ingen inverkan på själva bilderna eller de uppmätta ROI-data som gör det möjligt att jämföra bilder från olika IVIS-system.

Intresseområdet (ROI) anger det specifika intresseområdet från användaren i en optisk bild. I verktygsfältet kan man rita 3 olika avkastning: mätning (mäter signalintensiteten i avkastningens avkastning), genomsnittlig bakgrund (mäter den genomsnittliga signalintensiteten i det användardefinierade området för bakgrunden) eller motivet ROI (identifierar ett ämne i en bild).

Om ämnet disSpelar en hög ospecifik bakgrundssignal i sig, erhåller en bakgrundskorrigerad ROI-mätning genom att subtrahera bakgrundssignalen (ROI) från mål-ROI. Ställ in bildminimum nära noll för att bestämma automatisk fluorescens eller naturligt förekommande bakgrundsluminiscens i bilden. Länk bilden till en självdefinierad (användarspecifik) bakgrundsbild (ROI) som uppmättes främst till den uppmätta specifika bilden.

Halvkvantitativa analyser av bilderna utfördes genom att teckna standardiserade intressanta regioner (ROI) i både artritiska och ankler, såväl som i inflammade och friska öron med hjälp av Living Image-mjukvaran. Endast beskrivande statistiska analyser utfördes på in vivo data i detta manuskript på grund av otillräckligt antal djur. Analys av signalintensiteten hos artritiska och friska ankler eller tassar visade en 7-faldig förbättrad MMP-signalintensitet vid artrit, jämfört med kontrollanlar. En tre gånger högre MMP signalintensiteten detekterades i de främre tassarna hos artritiska möss jämfört med den för de friska djur (Figur 3A).

Analys av öron med akut och kronisk CHR jämfört med den vänstra oemotsagda styr öra visade en signifikant ökad MMP-signalen även efter det att en ^st utmaning, vilket ytterligare ökade efter ^{3: e} och förblev på samma nivå tills ^{5: e} utmaningen (figur 3B) . Som en följd av förorening med kontaktallergenet på vänster öra på grund av repning av mössen, bestämde vi en något ökad MMP-signalen i den vänstra (ej TNCB utmanad) styr öra. Resultaten indikerar en viktig roll av MMP, vittnade av en högt ökad fluorescens signal under GPI-artrit och kronisk inflammation, mätt med OI.

belastning / 55.180 / 55180fig1.jpg"/>
Figur 1: RA och CHR Model, Time sjukdomsförloppet Induktion och tidpunkter för OI. (A) Tidsförlopp för RA-induktion i BALB / c-möss (B) och kronisk CHR induktion i C57BL / 6-möss. Översikt av respektive in vivo imaging tidpunkt och associerade insprutnings tidpunkter av OI färgämnet för mätning MMP-aktivitet i båda modellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: MMP OI i RA, CHR och kontrolldjur. (A) Representativa resultat av den uppmätta MMP-aktivitet i en artritisk mus 6 dagar efter GPI-artritinduktion och en hälsosam kontrollmus (vänster sida). Signifikant högre signal (Strålande (p / s / cm ² / sr)) intensity observerades i artros jämfört med friska musen. Bilden till höger visar MMP-aktivitet i baktassarna och inkluderar anklarna, främre tassar, pankreas, lunga, mjälte, hjärta, njurar, lever och tarm av en offrad GPI-artrit mus efter OI färgämne injektion. OI avslöjade en hög signal i främre tassar, fotleder och baktassarna hos RA-möss och levern och tarmen oavsett om möss injicerades med GPI-serum (RA möss) eller kontrollserum (friska kontrollmöss). (B) MMP fluorescenssignal i öron med kronisk CHR (vänster) och kontrolldjur (höger). Den inflammerade högra örat (utmanade 5 gånger) visar en höggradigt ökad signal jämfört med kontroll öron. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

<Br /> Figur 3: Halvkvantitativ analys av inflammerade och friska ankler och öronvävnad med användning av OI. (A) Halvkvantitativ analys av fluorescenssignalen i RA och friska djur i främre tassar och fotled. Artritiska främre tassar och fotled leder upp en signifikant (** p <0,05) (n = 3) högre MMP-signal jämfört med friska ankelfogar och främre tassar. Data presenteras som medelvärdet ± SD. (B) Halvkvantitativ analys av vänster och höger (utmanad) öron efter 1: ^a , 3: ^e och 5 ^{: e} utmaningen. MMP-signalen ökas signifikant från första till ^femte utmaningen och visade redan en maximal signalintensitet i det högra utmanade örat efter den ^tredje utmaningen (** p <0,05) (n = 3) (Kontrollörerna är delvis förorenade med TNCB På grund av att musen repade. Detta gav en förbättrad signal som inte var signifikant). Data presenteras som medelvärdet± SEM. Den 2-tailed studentens t-test användes för att analysera skillnaderna mellan inflammation (GPI-artritiska ankler, högerbehandlade öron) och kontroll (ankler, obehandlade öron) för båda modellerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

OI är ett mycket användbart, snabbt och billigt verktyg för icke-invasiv in vivo molekylär bildbehandling i preklinisk forskning. En särskild styrka hos OI är förmågan att övervaka mycket dynamiska processer som inflammatoriska reaktioner. Dessutom tillåter OI att man följer en sjukdomsförlopp under en längre tidsperiod, från dag till vecka.

OI har flera fördelar jämfört med andra in vivo bildhanteringsmodaliteter såsom positron-emission tomografi (PET) eller magnetisk resonans imaging (MRI), eftersom det är mycket tid- och kostnadseffektivt. Hög genomströmningsanalys med upp till fem djur per förvärv är möjlig. Dessutom finns ett stort antal prober, riktade mot många olika biologiska processer, tillgängliga. ¹² För att ge ytterligare anatomisk information kan OI kombineras med andra bildtekniker såsom MR eller röntgen. En annan begränsning är dess låga vävnadspenetrationsdjup jämfört t ex till funktionell PET imaging. Dessutom en stor mängd prober syftar på många olika biologiska mål finns. ¹²

Effekter av anestesi bör inte underskattas i in vivo imaging. Medan specifika effekter av anestesi på OI resultaten inte är väl karakteriserade har vår grupp visat i flera studier påverkan av anestesi på PET imaging resultat. ^{13, 14, 15} till exempel, Fuchs et al. analyserade blodparametrar, såsom pCO _2, pH och laktat före och efter PET med användning av olika andning och anestesiprotokoll. Det visades att, betydande förändringar i pCO ₂ och laktatnivåer i sövda jämfört med medvetna syre- eller luftandnings möss ledde till betydande förändringar i PET resultat. ¹⁴ De drar slutsatsen att denna effekt orsakas huvudsakligen av syre andning och subsequent till respiratorisk acidos hos djur, vilket leder till de olika resultat i PET imaging.

Standardisering av anestesi parametrar som O ₂ -concentrations och doser av bedövningsmedel, liksom förebyggande av hypotermi hjälp för att undvika systematiska fel. Naturligtvis är OI begränsad av fysikaliska egenskaper t ex ljusspridande, vävnadsauto fluorescens- och ljusdämpning ^9. Flera grupper är itu med dessa problem genom att kombinera de makroskopiska resultat från OI med andra tekniker som in vivo fluorescensmikroskopi eller flödescytometri.

In vivo-avbildning av MMP-aktivitet genom MMP-specifika aktiverbara fluorescerande prober har använts i flera experimentella modeller av inflammation som CHS, ⁷ men även i sjukdomar som cerebral ischemi, ¹⁶ aortaaneurysm, ¹⁷ hjärtinfarkt ¹⁸och aterosklerotiska plack ¹⁹ samt olika tumörmodeller. ²⁰

Till exempel, Cortez-Retamozo et al. undersökte aktiviteten av MMP in vivo i en modell av allergisk inflammation i luftvägarna genom att injicera en MMP aktiverbar sond, 24 timmarna efter intranasal applicering av ovalbumin i tidigare sensibiliserade möss. ²¹ För att identifiera lokaliseringen av MMP-aktivitet vidare denna grupp kombinerade tomografiska OI, NIR fiberoptisk bronkoskopi och intravital mikroskopi för att övervaka sjukdomsförloppet och behandlingsrespons i större detalj. ²¹

Andra tillvägagångssätt för att mäta in vivo-MMP-aktivitet mestadels använda inhibitorer av MMP som binder till det aktiva stället i MMP. Mcintyre et al. beskrivits en in vivo tumörassocierat-MMP-7 detektion med användning av en "polymer-baserade fluorogena substrat", som fungerar som en "proteolytic beacon" för MMP i en mus xenograftmodell. ²² De visar att aktiviteten av MMP-7 kunde detekteras selektivt genom optisk avbildning. ²³ Vidare, Olson et al. undersöktes 'aktiverbara cellpenetrerande peptider' (ACPPs), vilka är i stånd att rikta många xenograft tumörmodeller, men kan inte adsorbera in i cellen tills länkaren proteolyseras. de undersökte ACPPs vilka är selektiva för MMP-2 och MMP-9. ^{24, 25}

Märkning av MMP-inhibitorer med radioaktiva isotoper för single-photon emission computed tomography (SPECT) eller PET imaging användes för att studera MMP-uttryck i ateroskleros ²⁶ och cancer ^27. I en färsk studie en fluorescensmärkt MMP-inhibitor jämfördes med en MMP-aktiverbart sond. ²⁸ Den fluorescensmärkt MMP-inhibitor visade en lägre signalbrusFörhållandet jämfört med en aktiverbar prob men krävde en kortare upptagstid.

Nya biomarkörer för att bedöma nyckelfunktionerna i patofysiologin kan utnyttjas och valideras av OI. Till exempel är svaret på fara associerade molekylära mönster (DAMPs) en tidig händelse under en inflammatorisk reaktion. Vogl et al. Använde en Cy5.5-märkt antikropp mot alarmin S100A9 i modeller av akut hudhudsdermatit, kollageninducerad artrit och infektion med Leishmania major för att utveckla känslig biomarkör för tidiga tecken på inflammation. ²⁹

Sammanfattningsvis representerar OI en snabb och effektiv metod för preklinisk forskning, som kan avtäcka nya mekanismer för sjukdomar in vivo , karakteriserande nya molekylära mål samt övervakning av terapeutiska effekter . En efterföljande valideringsprocess med mer kvantitativa tekniker som PET kan emellertid krävas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cornergel	Gerhard Mann GmbH	1224635	ophthalmic ointment
Forene	Abbott GmbH	4831850	isoflurane
U40 insulin syringe	Becton Dickinson and Company	324876
Heparin	Sintetica	6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm	Reichelt Chemietechnik GmbH+Co	28460	polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm
BD Regular Bevel Needles, 30 G	Becton Dickinson & Co. Ltd.	305106	30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer	Vetland Medical Sales and Services LLC	-
Artagain drawing paper	Strathmore Artist Paper	446-8	coal black
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G	Becton Dickinson and Company	305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene	Sigma Aldrich GmbH	7987456F	TNCB
MMPSense 680	Perkin Elmer	NEV10126	fluorescent imaging dye
Oditest	Koreplin GmbH	C1X018	mechanical measurment
Miglyol 812	SASOL	-	Oil
BALB/C, C57BL/6	Charles River Laboratories	-	Mice used for experiements
PBS	Sigma Aldrich GmbH		For dilution of the RA serum
Pipette (100 µL)	Eppendorf		Used for TNCB application
shaver	Wahl	9962	Animal hair trimmer
Living Image	Perkin Elmer		Imaging software to measure OI