Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Неинвазивная Published: May 8, 2017 doi: 10.3791/55180
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

Summary

В данной статье объясняется применение флуоресцентной визуализации с использованием активируемого оптического зонда для визуализации активности in vivo ключевых матричных металлопротеиназ в двух различных экспериментальных моделях воспаления.

Abstract

В настоящей статье описывается неинвазивный метод визуализации активности матриксных металлопротеиназ (MMP) с помощью активируемого флуоресцентного зонда с помощью флуоресцентной оптической визуализации in vivo (OI) в двух различных моделях воспаления мыши: ревматоидный артрит (RA) и контакт Реакции гиперчувствительности (CHR). Свет с длиной волны в окне ближней инфракрасной области (NIR) (650 - 950 нм) обеспечивает более глубокое проникновение ткани и минимальное поглощение сигнала по сравнению с длинами волн ниже 650 нм. Основные преимущества использования флуоресцентного OI в том, что он дешевый, быстрый и простой в реализации на различных моделях животных.

Активируемые флуоресцентные датчики оптически бесшумны в своих инактивированных состояниях, но становятся очень флуоресцентными при активации протеазой. Активированные MMP приводят к разрушению тканей и играют важную роль для прогрессирования болезни в реакциях гиперчувствительности замедленного типа (DTHRs), таких как RA и CHR. Кроме того, ММПосновные протеазы для хряща и деградации кости и индуцированный макрофагами, фибробластами и хондроцитов в ответ на про-воспалительных цитокинов. Здесь мы используем зонд, который активируется с помощью ключевых ММР, как ММР-2, -3, -9 и -13 и описывать протокол обработки изображений для ближней инфракрасной флуоресценции OI активности ММП в РА и контрольных мышей через 6 дней после индукции заболевания, а также а у мышей с острой (1x вызов) и хроническую (5x вызов) CHR на правом ухе по сравнению со здоровыми ушами.

Introduction

Аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит (РА) или вульгариты псориаза, классифицируются как реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTHR). 1 РА - распространенное аутоиммунное заболевание, характеризующееся эрозивным синовитом и разрушением суставов. 2 Воспаленные артритные суставы демонстрируют инфильтрацию и пролиферацию воспалительных клеток, повышенную экспрессию провоспалительных клеток, приводящих к образованию паннуса, разрушению хряща и кости. 3 , 4 Расщепление молекул внеклеточного матрикса, таких как коллаген матриксными металлопротеиназами (ММР), является существенным для преобразования ткани и ангиогенеза и вызывает разрушение тканей. 5 , 6 Реакции гиперчувствительности (CHR) характеризуются агрегацией нейтрофилов, приводящей к окислительному взрыву. 7 Подобно RA, MMP в CHR являются внутреннимивед в преобразовании тканей, миграции клеток и ангиогенеза, с тем чтобы установить хроническое воспаление.

Для исследования RA, была использована глюкоза-6-фосфат-изомеразы (ГПИ) мышиная модель -serum инъекции. 8 в сыворотке трансгенных мышей К / BXN , содержащих антитела против GPI, вводили в нативных Balb / C мышей , после чего ревматические воспаления начали развиваться в течение 24 ч с максимумом лодыжки набухания на 6 день после инъекции GPI-сыворотки (см 1.1). Для анализа хронического CHR, C57BL / 6 мышей сенсибилизировали trinitrochlorobenzene (TNCB) на животе. Правое ухо был брошен вызов до 5 раз, начиная с 1 неделю после сенсибилизации (смотри также 1.1 и 1.2).

Неинвазивный небольшое животное О.И. является методом , основанным на исследовании в естественных условиях fluorescent-, chemiluminescent- и биолюминесцентных-сигналов, которые в основном используются в доклинических исследованиях. Полученные полуколичественные данные дают полное представление о MolecТельных механизмов в органах и тканях здоровых, а также больных моделей экспериментальных животных, и позволяет проводить продольные наблюдения ( например, для оценки профилей терапевтического ответа in vivo ). Большим преимуществом продольных исследований является уменьшение числа животных, поскольку одни и те же животные могут быть измерены в последующих исследованиях в нескольких временных точках, вместо того чтобы использовать разных мышей в момент времени. Разрешение OI позволяет детализировать функциональное отображение органов и даже более мелких структур тканей у подопытных животных.

Использование специальных фильтров возбуждения и эмиссии с узким спектром пропускания, защита от рассеянного света светонепроницаемым «темным ящиком» и чувствительной камерой с заряженным соединением (CCD), которая охлаждается во многих устройствах до -70 ° C , Позволяет проводить высокоспецифичные и чувствительные измерения сигналов флуоресценции.

При использовании флуоресцентных агентов с возбуждением иСпектры излучения в ближнем инфракрасном диапазоне флуоресценции (650-950 нм), отношения сигнал-шум могут быть значительно улучшены. Окно флуоресценции в ближней инфракрасной области характеризуется относительно низким поглощением сигнала гемоглобином и водой, а также низкой автофлуоресценцией фона. 9 Это позволяет глубине проникновения до 2 см в ткани мелких животных. OI-зонды могут непосредственно адресовать мишень ( например , антителом, меченным флуоресценцией) или могут быть активированы в ткани-мишени ( например , протеазами). Активируемые зонды OI оптически бесшумны в своей инактивированной форме из-за резонансной передачи энергии Ферстера (FRET) в тушащуюся часть, которая передает энергию возбуждения внутри молекулы в другой домен. Если краситель расщепляется (например, протеазой), энергия больше не переносится внутри молекулы, и флуоресцентный сигнал может быть обнаружен OI. Это позволяет конструировать датчики OI с высокой специфичностьюY для различных биологических процессов и отличных отношений сигнал / шум.

Следующий протокол подробно объясняет подготовку животных, измерения OI с использованием активируемого зонда OI для изображения MMP-2, -3, -9 и -13 активности in vivo и две экспериментальные модели воспаления (RA, CHR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, описанные в этом документе, соответствуют руководящим принципам и международным стандартам по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены местным Комитетом по благосостоянию животных и этике Комиссии по делам страны Тюбинген, Германия. Мышей линии BALB / c и C57BL / 6 в возрасте 8-12 недель держали в 12 ч: 12 ч светлого-темного цикла и помещали в IVC и стандартизованные условия окружающей среды при 22 ± 1 ° С группами по 2-5 с водой и Доступ к пище ad libitum .

1. Подготовка материала

  1. Разбавьте краситель OI для получения флюоресценции в ближней инфракрасной области в соответствии с соответствующим листом данных непосредственно перед инъекцией. Активируемый OI краситель (коммерческий зонд с возбуждением при 680 нм) для измерения MMPs in vivo готов к использованию в концентрации 20 нмоль в 1,5 мл 1 × PBS. Аккуратно встряхните или встряхните раствор перед использованием. Краситель OI можно хранить при температуре 2-8 ° C в течение 6 месяцев при условии защиты от света. Для внутривенных ( iv ) инъекций готовят венозный катетер. Используйте шприц для инсулина объемом 20 U (0,5 мл), наполненный 0,9% солевым раствором (содержащий 10 инъекционных единиц гепарина в 50 мл) и иглу 30 калибра, прикрепленную к полиэтиленовому катетеру. Внесите рекомендуемую дозу 2 нмоль на мышь ОИ красителя.

2. Индукция ревматоидного артрита и реакции гиперчувствительности при хроническом контакте

  1. Ревматоидный артрит:
    1. Разбавьте 100 мкл сыворотки (полученной у мышей K / BxN 10 ), содержащей антитела (AB) против глюкозо-6-фосфат-изомеразы (GPI) 1: 1, с 1 × PBS (200 мкл), чтобы индуцировать RA. Хранить разбавленную сыворотку при -80 ° C. Подробные процедуры индукции RA описаны Monach et al. 8 .
    2. Чтобы индуцировать RA, аккуратно поднимите каждую мышь за хвост и введите 200 мкл разведенной сыворотки внутрибрюшинно ( ip ) в день 0 tОн экспериментирует. После инъекции поместите мышь прямо в клетку.
    3. При необходимости измерьте диаметры лодыжек каждой лодыжки перед инъекциями АБ и определите «артритный показатель» ( рисунок 1A ). Продолжать измерение набухания голеностопного сустава ежедневно до 6 дня после GPI-сыворотки с использованием механического измерительного устройства (микрометра).
    4. Внесите активируемый OI краситель (шаг 1.1 - 1.2), чтобы измерить in vivo активность MMP в хвостовой вене мышей RA На 5-й день после инъекции GPI-сыворотки и в хвостовую вену контрольных мышей. Выполните эксперименты с оптической визуализацией через 24 ч после инъекции хвостовой вены.
  2. Контакт с реакцией гиперчувствительности:
    1. Для сенсибилизации мышей C57BL / 6 готовят 5% раствор TNCB, растворенный в смеси ацетон / масло 4: 1.
    2. Обезболить мышей C57BL / 6, используя 1,5% изофлуран, испаренный в 100% кислороде (1,5 л / мин). Когда мышей подвергают анестезии, поместите их в сумасшедшего е носовой конус (разрез 5 мл шприц полиэтилена, подключенный к 1,5% по объему изофлуран трубы) и поддержания анестезии. Нанесите ветеринара глазную мазь на наркотизированных животных, чтобы предотвратить сухость глаз в то время как под наркозом.
    3. Бритье тщательно брюшную полость (2 х 2 см), используя небольшое животное машинки для стрижки волос. Избегайте повреждая кожу, так как это может привести к неспецифическим флуоресцентным сигналам внутри животного и может повлиять на результатах исследования.
    4. Применяют 80 мкл 5% раствора медленно TNCB на бритой области живота с помощью 100 мкл пипетки для привлечения внимания животного. Поместите мышь аккуратно обратно в клетку Стараясь, чтобы обеспечить, что глаз мыши не вступает в контакте с подстилкой, чтобы избежать травм роговицы и избежать низких температур тела во время фазы восстановления.
    5. Через шесть дней после сенсибилизации, готовят 1% -ный раствор TNCB (растворенного в 9: 1 смеси ацетон / масло) и применить 20 мкл на правом ухе с помощью пипетки, чтобы вызвать острый и хронический ЧСР.«> 1
      1. Начните с 1 -го испытания по обеим сторонам правого уха с помощью 20 мкл 1% -ного раствора TNCB с использованием 100 мкл пипетки и повторите пробу каждый второй день до пяти раз (день 15 после сенсибилизации), чтобы вызвать CHR ( рисунок 1B ) , Измеряйте толщину ушей ежедневно, используя микрометрический измерительный прибор.
    6. Внедрить активируемый OI краситель (коммерческий зонд с возбуждением при 680 нм) (шаг 1.1-1.2) для измерения активности MMP in vivo у мышей с CHR через 12 ч после заражения. Выполните эксперименты с оптической визуализацией через 24 ч после введения хвостовой вены ( iv ).

3. Подготовка животных к оптической визуализации

  1. Переключайте мышиную чау (по крайней мере, за 3 дня до получения изображения) на низкокалорийную или нефлуоресцентную чау-чау ( например , без марганца), чтобы избежать интерференции автофлуоресценции (около 700 нм) с сигналом флуоресценции используемых OI-агентов.
  2. Поместите животное вВ анестезиологическую камеру и обезболивают, используя 1,5 об.% Изофлурана, испаренного кислородом (1,5 л / мин) (кислород можно заменить воздухом, но его необходимо стандартизовать в рамках одного эксперимента).
  3. Когда мышь заметно обезболена, поместите ее в самодельный носовой конус (создайте разрезным 5-мл полиэтиленовым шприцем, подключенным к 1,5-процентной трубке изофлурана) и поддерживайте анестезию.
  4. Тщательно очистите животное на целевом участке (2 см x 2 см) с помощью маленького триммера для волос животных. Избегайте травмирования кожи, так как это может привести к неспецифическим флуоресцентным сигналам внутри животного и может повлиять на результаты исследования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Волоски могут поглощать сигнал флуоресценции во время OI (в зависимости от деформации мыши, наблюдается более или менее поглощение) в зависимости от области интереса (ROI).
  5. Для внутривенной инъекции поместите хвост мыши в подогретую воду, чтобы вызвать вазодилатацию, аккуратно очистите кожу в месте инъекции спиртом и начните с размещения катетера приДистальный участок хвоста. Поместите «разрезанный» край иглы под углом 20 ° в хвостовую вену и проверьте правильность установки катетера путем повторного суспендирования шприца.
  6. Если катетер установлен правильно, замените шприц и введите зонд OI (2 нмоль). После инъекции, замените шприц и введите 25 мкл 0,9% солевого раствора, чтобы полностью очистить мертвый объем полиэтиленовой трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время полужизни ткани используемого красителя OI (коммерческий зонд с возбуждением на 680 нм) для измерения активности MMP in vivo составляет 72 часа. Чтобы обеспечить полный клиренс, повторная инъекция красителя не рекомендуется раньше, чем через 7 дней после предыдущей инъекции.

4. Оптическое изображение

  1. Поместите черный пластиковый или бумажный лист в черный ящик OI-сканера в центре поля зрения (FOV).
  2. Настройте протокол измерений и выберите правильную длину волны (возбуждение: 680 ± 10 нм и eМиссия: 700 ± 10 нм) и параметры изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В некоторых системах OI настройка для нескольких образов красителей предварительно определена.
  3. Чтобы выбрать правильный протокол для флуоресцентной визуализации, откройте программное обеспечение для обработки изображений (предоставленное производителем) и инициализируйте систему. Большинство ПЗС-камер должны охладиться до рабочей температуры, и это может занять 10 минут. Для получения надежных результатов подождите, пока система не будет готова.
  4. Наблюдайте, как всплывает панель управления процессом получения изображений in vivo , и каждая выбранная пара фильтров будет отображать одно изображение в последовательности. В этом случае приобретите одно изображение с парами фильтров для коммерческого красителя с длиной волны возбуждения и излучения 680 ± 10 нм и 700 ± 10 нм соответственно и начните измерение (нажмите «Приобрести последовательность»). Более подробные инструкции см. В руководстве изготовителя.
  5. Пометьте изображения соответствующим образом и сохраните информацию в «Редактировать изображение».Ярлыки ", которое появится после" Приобретать последовательность ".
  6. Проведите базовое сканирование каждого животного перед инъекцией красителя OI или используйте наивных контрольных животных для дифференциации фонового сигнала.
  7. Ч после введения хвостовой вены краски OI, поместите животных в центр поля зрения, чтобы измерить самый высокий сигнал в системе OI и начать измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Важно: Гипотермия может существенно влиять на распределение визуализирующих агентов. Удостоверьтесь, что стадия нагрета до 37 ° C, чтобы избежать переохлаждения животного. Изображения могут быть выполнены одновременно с животными в группах от 1 до 5 мышей. Выберите размер FOV в зависимости от количества животных для измерения в одно и то же время. Вы можете сделать яркое полевое изображение, чтобы проверить, видна ли каждая мышь.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните анализ данных с использованием программного обеспечения для обработки изображений, следующего заПротокол изготовителя.

  1. Для измерений RA используйте градуированную единицу излучения фотонов, как показано на рисунке 2 , тогда как хронический CHSR изображается как интенсивность сигнала в процентах (эффективность).
  2. Чтобы рисовать ROI вручную, используйте инструментальную панель. Для анализа изображений RA используют стандартизованный круг, расположенный вокруг самого высокого сигнала во всех лодыжках и лапах каждого животного. Чтобы проанализировать CHSR, поместите ROI вокруг всего правого и левого уха в соответствии с ярким изображением поля.
  3. Чтобы измерить значения выбросов фотонов или интенсивности сигнала в определенном обратном ROI, нажмите «measure». Система будет предоставлять значения в обратном ROI для описательного статистического анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы индуцировать ревматоидный артрит (RA) у наивных мышей BALB / c, животных инъецировали ip с помощью аутоантител (разведение 1: 1 с помощью 1x PBS) против GPI в ​​день 0. Максимальное воспаление (опухоль голеностопного сустава) в этой индуцированной GPI сыворотке Модель RA на 6-й день после инъекции 11 . Таким образом, 2 нмоль активируемого красителя OI готовили и инъецировали iv в хвостовую вену артритных мышей и здоровых контрольных животных на 5 день. Через 24 ч после инъекции (день 6) мышей анестезировали и визуализировали, как описано в разделе 3 ( Рисунок 1A ).

Чтобы индуцировать CHR, мышей C57BL / 6 сенсибилизировали 5% TNCB в день 0 на бритой брюшной полости. На 7-й день после сенсибилизации начался 1 -й вызов в правом ухе с использованием 1% TNCB. Для индукции хронического воспаления было выполнено до пяти испытаний (15-й день). Через 12 ч послее последний вызов, 20 нмоль НМП красителя вводят внутривенно. На день 15, 24 ч после инъекции, О.И. проводили , как описано выше (фиг.1В).

Фигура 2 показывает явно усиливается сигнал флуоресценции в задние лапы, лодыжки и передние лапы мыши РА на 6 -й день после индукции заболевания, по сравнению с контрольными лодыжек (рис. 2а) Биологическое анализ активности ММП в органах мышей РА и здоровых мышей показали сильно расширенный сигнал в задних лапах, щиколотках и передних лапах исключительно в суставах мышей РА. Интересно, что мы определили усиленный сигнал ММР в обеих почках мышей всех измеренных РА, по сравнению с почками здоровых контрольных мышей (фигура 2А, справа). Кроме того, мы измерили усовершенствованную сигнал ММР в печени и кишечнике независимо от того, страдает ли мышей от RA. Никаких различий между РА и здоровых мышей были обнаружены в тОн поджелудочной железы, легких, селезенки и сердца.

Во время хронического CHR (пять проблем с TNCB в правом ухе) мы измерили высокую активность MMP на правом воспаленном ухе по сравнению со здоровым левым контрольным ухом ( рисунок 2B ).

Таким образом, наши данные указывают на важную роль активности ММП в ходе прогрессирования заболевания в обеих моделях воспалительных заболеваний.

Набор инструментов для биолюминесценции и флуоресценции позволяет количественно определить, например, пмоль флюорохрома или число клеток, которые экспрессируют флуоресценцию. Данные могут отображаться в 1. Граф: отображает некалиброванное измерение падения фотона на камеру, 2. Излучение (фотоны): указывает калиброванное измерение эмиссии фотонов в «фотонах / секундах / см 2 / стерадиан», что является Рекомендуется для получения изображений люминесценции или 3. Radiant Эффективность (флуоресценция): показывает блеск излучения флуоресценции за мощности падающего возбуждения, рекомендуется для измерений флуоресценции.

Большое преимущество работы с сиянием единицами при анализе OI изображений, что настройки камер могут быть изменены в течение одного эксперимента, и это не имеет никакого влияния на сам или измеренные данные ROI изображений, что в дальнейшем позволяет сравнивать изображения с различных систем Ivis.

Область интереса (ROI) указывает на определенную область интереса со стороны пользователя в оптическом изображении. Панель инструментов позволяет рисовать 3 различных трансформирования: измерение (измерение интенсивности сигнала в ROI изображения), средний фон (меры средней интенсивности сигнала в пользовательском определенной области для фона), или при условии ROI (идентифицирует субъекта животного в изображение).

Если объект съемки дисиграет высокие фоновый сигнал неспецифических себя, получить измерение ROI фона скорректированного путем вычитания фонового сигнала (ROI) от целевого ROI. Установите минимум изображения близко к нулю, чтобы определить автоматическую флуоресценцию или естественного происхождение фона люминесценции в изображении. Ссылка на изображении в самоопределяемом (пользователь специфический) фоновое изображение (ROI), которые были измерены в первую очереди для измеренного конкретного изображения.

Пол-количественный анализ изображений проводили путем составления стандартных областей интереса (трансформирования) в обеих подагрических и контроле лодыжек, а также в воспаленных и здоровых ушах с помощью программного обеспечения Жизни изображений. Только описательные статистические анализы были проведены на данных в естественных условиях в этой рукописи, из - за недостаточное количество животных. Анализ интенсивности сигнала артритных и здоровых лодыжек или лап показал 7-кратную повышенную интенсивность сигнала на ММР в артрите, по сравнению с контрольными лодыжками. А 3 раза выше , интенсивность сигнала ММР был обнаружен в передних лап страдающих артритом мышей по сравнению с здоровых животных (фиг.3А).

Анализ ушей с острой и хронической CHR по сравнению с левым безраздельного контроля уха показала значительно увеличенный сигнал ММР , даже после того, как 1 - й вызов, что еще больше возросла после 3 - го и оставался на том же уровне до 5 - го вызова (фигура 3В) , Как следствие загрязнения с контактным аллергеном на левое ухо из-за царапин мышей, мы определили, немного увеличенный сигнал ММР в левом (не TNCB оспариваемый) контроль ухо. Полученные результаты указывают на важную роль ММР, проявленными сильно увеличенным флуоресцентного сигнала в течение GPI-артрита и хронического воспаления, как измерено с помощью OI.

Load / 55180 / 55180fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Модель RA и CHR, временной курс индукции заболевания и временные точки для OI. (A) Временной ход индукции RA у мышей BALB / c (B) и хроническая индукция CHR у мышей C57BL / 6. Обзор соответствующего момента времени формирования изображений in vivo и соответствующих точек времени впрыска красителя OI для измерения активности MMP в обеих моделях. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: OI MMP в RA, CHR и контрольных животных. (A) Репрезентативные результаты измеренной активности MMP у артритной мыши через 6 дней после индукции GPI-артрита и здоровой мыши контроля (слева). Значительно более высокий сигнал (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) intСоответствие наблюдалось в артритах по сравнению со здоровой мышей. Изображение справа показывает активность MMP в задних лапах и включает в себя лодыжки, передние лапы, поджелудочную железу, легкие, селезенку, сердце, почки, печень и кишечник жертвы GPI-артритной мыши после инъекции красителя OI. OI обнаружил высокий сигнал в передних лапах, лодыжках и задних лапах мышей RA, печени и кишечника независимо от того, вводили мышей сыворотку GPI (мыши RA) или контрольную сыворотку (здоровые контрольные мыши). (B) Флуоресцентный сигнал MMP в ушах с хроническим CHR (слева) и контрольным животным (справа). Воспламененное правое ухо (оспаривается 5 раз) показывает очень усиленный сигнал по сравнению с контрольными ушами. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2 <Br /> Рисунок 3: Полуколичественный анализ воспаленных и здоровых лодыжек и тканей уха с помощью OI. (A) Полуколичественный анализ сигнала флуоресценции в RA и здоровых животных в передних лапах и голеностопных суставах. Артритические передние лапы и голеностопные суставы показывают значительно (** p <0,05) (n = 3) более высокий ММП сигнал по сравнению со здоровыми суставами голеностопного сустава и передними лапами. Данные представлены как среднее ± SD. (B) Полуколичественный анализ левого и правого (запрограммированных) ушей после 1 -го , 3 -го и 5 -го испытаний. Сигнал ММП значительно повышается с первого до 5 -го вызова и уже показал максимальную интенсивность сигнала в правом оспариваемом ухе после 3 -го заражения (** р <0,05) (n = 3) (Ушные ушки частично загрязнены TNCB Из-за царапин мышей. Это привело к усилению сигнала, который не был значительным). Данные представлены в виде среднего± SEM. Двухсторонний t-критерий Стьюдента использовался для анализа различий между воспалением (GPI-артритные лодыжки, правые обработанные уши) и контролем (контрольные лодыжки, оставленные необработанными ушами) для обеих моделей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OI очень полезный, быстрый и недорогой инструмент для неинвазивного в естественных условиях молекулярной визуализации в доклинических исследованиях. Особая прочность OI является возможностью контролировать высоко динамические процессы, такие как воспалительные реакции. Кроме того, OI позволяет следить за ходом болезни в течение длительного периода времени, начиная от нескольких дней до нескольких недель.

О. имеет несколько преимуществ по сравнению с другими методами в естественных условиях визуализации , таких как позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) или магнитно - резонансная томография (МРТ), так как это очень много времени, и экономически эффективным. Анализ высокой пропускной способностью до пяти животных на приобретение возможно. Кроме того, большое число зондов, ориентированное много различных биологических процессов, доступно. 12 Для обеспечения дополнительной анатомической информации, О.И. можно комбинировать с другими методами визуализации , такие как МРТ или рентген. Другое ограничением является его глубиной проникновения в ткани низки по сравнению , например , с йСоскабливание ПЭТ. Кроме того, имеется большое количество зондов, нацеленных на множество различных биологических целей. 12

Эффекты анестезии не следует недооценивать в визуализации in vivo . Хотя конкретные эффекты анестезии на результаты ОИ недостаточно хорошо охарактеризованы, наша группа показала в нескольких исследованиях влияние анестезии на результаты визуализации ПЭТ. 13 , 14 , 15 Например, Fuchs et al. Анализировали параметры крови, такие как pCO 2 , pH и лактат до и после ПЭТ-сканирований с использованием различных протоколов дыхания и анестезии. Было показано, что значительные изменения уровней pCO 2 и лактата при анестезии по сравнению с сознательными кислородом или дыхательными дыхательными мышцами приводили к значительным изменениям в результатах ПЭТ. 14 Они делают вывод, что этот эффект главным образом обусловлен кислородным дыханием и последующимТ на респираторный ацидоз у животных, что приводит к различным результатам в ПЭТ-визуализации.

Стандартизация параметров анестезии, таких как концентрация O 2 и дозы анестезирующих препаратов, а также предотвращение переохлаждения помогают избежать систематических сбоев. Разумеется, OI ограничено физическими свойствами, например светорассеянием, аутофлуоресценцией ткани и ослаблением света 9 . Несколько групп решают эти проблемы, объединяя макроскопические результаты OI с другими методами, такими как флуоресцентная микроскопия in vivo или проточная цитометрия.

Получение in vivo активности MMP с помощью активируемых флуоресцентных зондов, специфичных для MMP, было использовано в нескольких экспериментальных моделях воспаления, таких как CHS, 7, но также при таких заболеваниях, как церебральная ишемия, 16 аневризм аорты, 17 инфаркт миокарда 18И атеросклеротические бляшки 19 , а также различные модели опухолей. 20

Например, Cortez-Retamozo et al. Исследовали in vivo активность ММР в модели воспаления аллергических дыхательных путей путем инъекции активируемого ММР зонда через 24 ч после интраназального применения овальбумина у ранее сенсибилизированных мышей. 21 Для определения местоположения активности ММП далее эта группа комбинировала томографический ОИ, волоконно-оптическую бронхоскопию и прижизненную микроскопию НИР, чтобы более детально отслеживать ход заболевания и ответ на лечение. 21

Другие подходы к измерению активности MMP in vivo в основном используют ингибиторы MMP, которые связываются с активным сайтом MMP. McIntyre et al. Описал обнаружение in vivo опухоли, ассоциированной с MMP-7, с использованием «флюорогенного субстрата на основе полимера», который действует как «протеолитик»IC маяк»для ММР в мышиной модели ксенотрансплантата. 22 Они показывают , что активность ММР-7 может быть обнаружена избирательно по оптической визуализации. 23 Кроме того, Olson и др. исследовались„активируемый клеточный проникающий пептиды“(ACPPs) , которые способны целевых много моделей опухолей ксенотрансплантатов, но не может адсорбировать в клетку , пока линкер не proteolyzed. Они исследовали ACPPs , которые являются селективными в отношении ММР-2 и ММР-9. 24, 25

Маркировка ингибиторов ММР с радиоактивными изотопами для однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) или ПЭТ был использован для изучения экспрессии ММР при атеросклерозе 26 и 27 рака. В недавнем исследовании флуоресценции-меченого ингибитора ММП по сравнению с ММР-активируемого зонда. 28 Ингибитор флуоресцентно-меченого ММР показали более низкий сигнал к шумуСоотношение по сравнению с активируемым зондом, но требуется более короткое время поглощения.

Новые биомаркеры для оценки ключевых особенностей патофизиологии могут быть использованы и подтверждено OI. Например, реакция на опасность, связанные молекулярные модели (DAMPS) является ранним событием в воспалительной реакции. Вогль и др. используется Cy5.5 меченым антителом против alarmin S100A9 в моделях острого уха дерматит кожи, коллаген-индуцированного артрита и инфекции с Leishmania мажор для разработки чувствительного биомаркера для ранних признаков воспаления. 29

В заключении, О.И. представляет собой быстрый и эффективный метод доклинических исследований, который способен обнаруживать новые механизмы заболеваний в естественных условиях, характеризующий новые молекулярные мишени, а также мониторинг терапевтического эффекта. Тем не менее, последующий процесс проверки с более количественными методами, такими как ПЭТ может потребоваться.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Дэниел Бакала, Натали Алтмайер и FUNDA Cay за отличную техническую поддержку. Мы благодарим Джонатан Коттон, Грег Боуден и Пол Сауберан для редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Вернер Сименс-фонда и медицинского факультета Эберхард Карлс университета Тюбингена ( «» Promotionskolleg «») и по ГПД через CRC 156 (проект С3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cornergel Gerhard Mann GmbH 1224635 ophthalmic ointment 
Forene Abbott GmbH 4831850 isoflurane
U40 insulin syringe Becton Dickinson and Company 324876
Heparin Sintetica 6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm Reichelt Chemietechnik GmbH+Co 28460 polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 G Becton Dickinson & Co. Ltd. 305106 30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer Vetland Medical Sales and Services LLC -
Artagain drawing paper Strathmore Artist Paper 446-8 coal black
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G Becton Dickinson and Company 305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene Sigma Aldrich GmbH 7987456F TNCB
MMPSense 680 Perkin Elmer  NEV10126 fluorescent imaging dye
Oditest  Koreplin GmbH C1X018 mechanical measurment
Miglyol 812 SASOL - Oil
 BALB/C, C57BL/6 Charles River Laboratories  - Mice used for experiements
PBS Sigma Aldrich GmbH For dilution of the RA serum 
Pipette (100 µL) Eppendorf  Used for TNCB application 
shaver  Wahl  9962 Animal hair trimmer
Living Image  Perkin Elmer  Imaging software to measure OI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
  2. Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
  3. Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
  4. Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
  5. Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
  6. Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
  7. Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
  8. Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
  9. Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
  10. Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
  11. Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
  12. Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
  13. Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
  14. Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
  15. Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
  16. Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
  17. Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
  18. Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
  19. Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
  20. Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
  21. Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
  22. McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
  23. Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
  24. Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
  25. Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
  26. Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
  27. Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
  28. Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
  29. Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).

Tags

Иммунология выпуск 123 флуоресцентные изображения матричные металлопротеиназы (ММР) воспаление, ревматоидный артрит (RA) контактная реакция гиперчувствительности (CHR)
Неинвазивная<em&gt; In Vivo</em&gt; Флуоресцентная оптическая визуализация воспалительной активности ММП с использованием активируемого флуоресцентного средства визуализации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schwenck, J., Maier, F. C.,… More

Schwenck, J., Maier, F. C., Kneilling, M., Wiehr, S., Fuchs, K. Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent. J. Vis. Exp. (123), e55180, doi:10.3791/55180 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter