Summary
Dette dokumentet beskriver anvendelse av fluoriserende billeddannelse ved bruk av en aktiverbar optisk avbildning sonde for å visualisere den in vivo aktivitet av sentrale matriksmetalloproteinaser i to forskjellige forsøksmodeller for inflammasjon.
Abstract
Dette dokumentet beskriver en ikke-invasiv metode for avbilding matriks-metalloproteinaser (MMP)-aktivitet ved en aktiverbar fluorescerende probe, via in vivo fluorescens optisk imaging (OI), i to forskjellige musemodeller for inflammasjon: en revmatoid artritt (RA) og et kontakt hypersensitivitetsreaksjon (CHR) modell. Lys med en bølgelengde i det nær-infrarøde (NIR) vindu (650-950 nm) tillater en dypere penetrering vev og minimale signalopptaket sammenlignet med bølgelengder under 650 nm. De største fordelene ved bruk av fluorescens OI er at det er billig, rask og enkel å implementere i ulike dyremodeller.
Aktiverbare fluorescerende prober er optisk stille i deres inaktiverte tilstander, men blir sterkt fluoriserende når den aktiveres av en protease. Aktiverte MMP'er føre til vevsdestruksjon og spiller en viktig rolle for sykdomsprogresjon i forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner (DTHRs) slik som RA og CHR. Videre MMP ernøkkel proteaser til brusk og ben nedbrytning og blir indusert av makrofager, fibroblaster og kondrocytter som respons på proinflammatoriske cytokiner. Her benyttes en sonde som er aktivert ved nøkkel MMPs som MMP-2, -3, -9 og -13 og beskrive en avbildningsprotokoll for nær infrarød fluorescens OI av MMP-aktivitet i RA og kontrollmusene 6 dager etter sykdomsinduksjon i tillegg som i mus med akutt (1x utfordring) og kronisk (5x utfordring) CHR til høyre øre sammenlignet med friske ører.
Introduction
Autoimmune sykdommer som reumatoid artritt (RA) eller psoriasis vulgaris er gradert som forsinket-type overfølsomhetsreaksjoner (DTHR). 1 RA er en vanlig autoimmun sykdom kjennetegnet ved erosiv synovitt og felles ødeleggelse. 2 Inflammerte leddforbindelser viser infiltrering og spredning av inflammatoriske celler, et økt uttrykk for proinflammatoriske celler som fører til dannelse av pannus, brusk og beinforstyrrelser. 3 , 4 Spaltningen av ekstracellulære matriksmolekyler, slik som kollagen ved matriksmetalloproteinaser (MMPs), er essensielt for vevsomdannelse og angiogenese og forårsaker vevsdeplosjoner. 5 , 6 Kontakt overfølsomhetsreaksjoner (CHR) er karakterisert ved aggregering av nøytrofiler som fører til en oksidativ utbrudd. 7 I likhet med RA er MMPs i CHR involvertVed ved vevskonvertering, celle-migrasjon og angiogenese for å etablere kronisk betennelse.
For å undersøke RA ble glukose-6-fosfat-isomerasen (GPI) -seruminjeksjonsmusemodellen brukt. 8 Serum fra transgene K / BxN-mus inneholdende antistoffer mot GPI ble injisert i naive BALB / c-mus, hvorpå revmatisk betennelse begynte å utvikle seg innen 24 timer med maksimal ankelutvikling på dag 6 etter GPI-seruminjeksjon (se 1.1). For å analysere kronisk CHR ble C57BL / 6-musene sensibilisert med trinitroklorbenzen (TNCB) på magen. Høyre øret ble utfordret opptil 5 ganger med 1 uke etter sensibilisering (se også 1.1 og 1.2).
Ikke-invasivt lite dyr OI er en teknikk basert på in vivo- undersøkelsen av fluorescerende, kjemiluminescerende og bioluminescerende signaler, som hovedsakelig brukes i preklinisk forskning. De tilegnede semikvantitative dataene gir innsikt i molekyletUlar mekanismer i organer og vev av friske og syke eksperimentelle dyremodeller, og muliggjør langsgående oppfølgingsmålinger (for eksempel å vurdere terapeutiske responsprofiler in vivo ). En stor fordel ved longitudinale studier er reduksjon av dyrenummer, da de samme dyrene kan måles i oppfølgingsstudier på flere tidspunkter i stedet for å bruke forskjellige mus per tidspunkt. Oppløsningen av OI tillater detaljert funksjonell avbildning av organer og enda mindre vevstrukturer i eksperimentelle dyr.
Bruken av spesifikke eksitasjons- og utslippsfiltre med et smalt transmisjonsspekter, beskyttelse mot spredt lys av en lettisolert "mørk boks" og et følsomt ladet koblet enhet (CCD) kamera som avkjøles i mange enheter ned til -70 ° C , Tillater svært spesifikke og følsomme målinger av fluorescenssignaler.
Ved å bruke fluorescerende midler med eksitasjon ogemisjons-spektra i det nær-infrarøde fluorescens vindu (650-950 nm), kan signal-til-støyforholdene forbedres betraktelig. Den nær-infrarøde fluorescens vindu kjennetegnes ved en forholdsvis lav absorpsjon av signalet ved hemoglobin og vann, samt en lav bakgrunn auto-fluorescens. 9. Dette gir en inntrengningsdybde på inntil 2 cm i vevet av små dyr. Oi-prober kan adressere et mål direkte (for eksempel ved en fluorescens-merket antistoff) eller kan aktiveres i målvevet (for eksempel ved proteaser). Aktiverbare OI prober er optisk stille i deres inaktiverte skjema på grunn av den Förster resonans energioverføring (FRET) til en bråkjøling del, som overfører eksitasjonsenergi i molekylet til et annet domene. Dersom fargestoffet er spaltet (ved hjelp av en protease for eksempel) blir energien ikke lenger overføres i molekylet og et fluorescerende signal som kan påvises ved OI. Dette tillater konstruksjon av OI prober med høy specificity for forskjellige biologiske prosesser og gode signal-til-støy-forhold.
Følgende protokoll beskriver i detalj fremstillingen av dyrene, OI målingene med et Activatable OI sonde til bilde MMP-2, -3, -9 og -13 aktivitet in vivo og to forsøksmodeller for inflammasjon (RA, CHR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet i denne artikkelen, fulgt retningslinjene og internasjonale standarder for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av den lokale Animal Welfare og etikkutvalg av landet kommisjonen Tübingen, Tyskland. 8 - 12 uker gamle BALB / c-mus og C57BL / 6 mus ble holdt på en 12 h: 12 timers lys: mørke syklus og ble plassert i IVCs og standardiserte miljøforholdene ved 22 ± 1 ° C i grupper på 2 - 5 med vann og mat tilgang ad libitum.
1. Materiale fremstillings
- Fortynn OI fargestoff for nær infrarød fluorescens avbildning i henhold til den respektive dataarket umiddelbart før injeksjon. Den aktiverbare OI fargestoff (kommersielt sonde med en eksitasjon ved 680 nm) for å måle in vivo MMP er klar til bruk ved en konsentrasjon på 20 nmol i 1,5 ml 1 x PBS. Rist eller vortex løsningen før bruk. OI fargestoff kan lagres ved 2 - 8 ° C i opptil 6 måneder når beskyttet mot lys. For intravenøse ( iv ) injeksjoner, utarbeide et venøst kateter. Bruk en 20 U (0,5 ml) insulin sprøyte fylt med 0,9% saltoppløsning (inneholdende 10 injeksjonsenheter av heparin i 50 ml) og en 30-gauge nål festet til et polyetylenkateter. Injiser anbefalt dose på 2 nmol per mus av OI-fargestoffet.
2. Induksjon av reumatoid artritt og kronisk kontakt overfølsomhetsreaksjon
- Leddgikt:
- Fortynn 100 μl serum (oppnådd fra K / BxN-mus 10 ) som inneholder antistoffer (AB) mot glukose-6-fosfatisomerase (GPI) 1: 1 med 1 x PBS (200 μl) for å indusere RA. Oppbevar fortynnet serum ved -80 ° C. Detaljert fremgangsmåte for induksjon av RA er beskrevet av Monach et al. 8 .
- For å indusere RA, løft hver mus forsiktig ved halen og injiser 200 μL av det fortynnede serum intraperitoneale ( ip ) på dag 0 av than eksperimentere. Etter injeksjonen plassere musen direkte tilbake i buret.
- Eventuelt kan måle ankel diameteren av hver ankel, før AB injeksjoner og definere en "artrittisk scoring" (figur 1A). Fortsett måling av ankelen hevelse daglig inntil dag 6 etter GPI-serum ved hjelp av en mekanisk måleinnretning (mikrometer).
- Injiser aktiverbare OI fargestoff (trinn 1.1 til 1.2), for å måle in vivo MMP-aktivitet iv inn i halevenen på mus RA på dag 5 etter GPI-serum injeksjon og inn i halevenen til kontrollmusene. Utføre optisk imaging eksperimenter 24 timer etter injeksjon i halevenen.
- Kontakt overfølsomhetsreaksjon:
- For sensibilisering av C57BL / 6-mus, fremstille en 5% løsning TNCB oppløst i en 4: 1 blanding av aceton / olje.
- Bedøving C57BL / 6 mus ved anvendelse av 1,5% isofluran fordampes i 100% oksygen (1,5 l / min). Når musene er bedøvet, legg den i en selv gal E nese kjegle (en kutt 5 ml polyetylen sprøyte, koblet til 1,5 vol% isofluran tube) og opprettholde anestesi. Påfør anergetiserte dyr for å forhindre tørrhet av øynene mens de bedøves.
- Barber magen forsiktig (2 x 2 cm) ved hjelp av en liten dyrehår trimmer. Unngå å skade huden, da dette kan føre til uspesifiserte fluorescerende signaler i dyret og kan påvirke resultatene av studien.
- Påfør 80 μL av 5% TNCB-løsningen sakte på barbert underlivsområdet med en 100 μL pipette for å føle dyret. Plasser musen forsiktig tilbake i buret og pass på at musens øyne ikke kommer i kontakt med sengetøyet for å unngå hornhindeskader og unngå lave kroppstemperaturer under gjenopprettingsfasen.
- Seks dager etter sensibilisering, lag en 1% TNCB-løsning (oppløst i en 9: 1 blanding av aceton / olje) og påfør 20 μL ved høyre øre ved hjelp av en pipette for å fremkalle akutt og kronisk CHSR."> 1
- Start med en st utfordring på begge sider av høyre øre med 20 pl 1% TNCB løsning ved hjelp av en 100 mL pipette og gjenta utfordring hver andre dag opp til fem ganger (dag 15 etter sensibilisering) å lokke fram CHR (figur 1B) . Mål øret tykkelse daglig, ved hjelp av en mikrometer måleenhet.
- Injiser aktiverbare OI fargestoff (et kommersielt sonde med eksitasjon ved 680 nm) (trinn 1.1 til 1.2) for å måle MMP-aktivitet in vivo i mus CHR 12 timer etter utfordringen. Utføre optisk bildebehandling eksperimenter 24 timer etter injeksjon i halevenen (iv).
3. Klargjøring av dyr for optisk avbildning
- Switch musefor (minst 3 dager før avbildning) til lav eller ikke-fluorescens chow (for eksempel, mangan fritt) for å unngå forstyrrelser av auto-fluorescens (ca. 700 nm) med fluorescenssignalet av de benyttede OI midler.
- Plasser dyret itil en anestesi-boksen og bedøve anvendelse av 1,5 vol% isofluran fordampet med oksygen (1,5 l / min) (oksygen kan erstattes av luft, men må være standardisert innenfor ett eksperiment).
- Når musen er synlig bedøvet, plassere den i et selvlaget nesekonus (bygget av et kutt 5 ml polyetylen sprøyte, knyttet til 1,5 vol% isofluran rør) og opprettholde anestesi.
- Barbere dyret forsiktig på målet (2 cm x 2 cm) med en liten dyrehår trimmer. Unngå å skade huden, da dette kan føre til uspesifikke fluorescerende signaler i dyr og kan påvirke resultatet av undersøkelsen.
MERK: Hårene kan absorbere fluorescenssignalet under OI (avhengig av musestammen, mer eller mindre absorpsjon observeres) avhengig av regionen av interesse (ROI). - For intravenøs injeksjon plasseres halen av musen i oppvarmet vann, for å fremkalle vasodilatasjon, forsiktig rense huden på injeksjonsstedet med alkohol, og starter ved å plassere kateteret påDen distale siden av halen. Plasser nålens "kutt" kant i en vinkel på 20 ° i halevenen og test riktig plassering av kateteret ved å suspendere sprøyten igjen.
- Hvis kateteret er plassert riktig, skift sprøyten og injiser OI-sonden (2 nmol). Etter injeksjon skal du erstatte sprøyten og injisere 25 μL 0,9% saltoppløsning for å fullstendig fjerne det døde volumet av polyetylenrøret.
MERK: Vevhelveringstiden for det brukte OI-fargestoffet (en kommersiell probe med eksitasjon ved 680 nm) for måling av MMP-aktivitet in vivo er 72 timer. For å sikre fullstendig klarering anbefales det ikke å injisere fargestoffet tidligere enn 7 dager etter en tidligere injeksjon.
4. Optisk bildebehandling
- Plasser et svart plast- eller papirark i den svarte boksen til OI-skanneren midt i synsfeltet (FOV).
- Sett opp en måleprotokoll og velg riktig bølgelengde (eksitasjon: 680 ± 10 nm og eOppdrag: 700 ± 10 nm) og bildeparametere.
MERK: I enkelte OI-systemer er oppsettet for flere bildefargebilder forhåndsdefinert. - For å velge riktig protokoll for fluorescensbilder, åpne bildesoftware (levert av produsenten) og initialiser systemet. De fleste CCD kameraer må kjøle seg ned til arbeidstemperaturen, og dette kan ta 10 minutter. For pålitelige resultater, vent til systemet er klart.
- Vær oppmerksom på at innhentingskontrollpanelet in vivo imaging system kommer opp, og hvert valgt filterpar representerer ett bilde i sekvensen. I dette tilfellet oppkjøp ett bilde med filterparene for det kommersielle fargestoffet med og en eksitasjons- og utslippsbølgelengde på henholdsvis 680 ± 10 nm og 700 ± 10 nm, og start målingen (Trykk på "Acquire sequence"). For detaljerte instruksjoner, se produsentens bruksanvisning.
- Merk bildene riktig og lagre informasjonen i "Rediger bildeEtiketter "-vinduet, som vil dukke opp etter" Oppkjøpsrekkefølge ".
- Ta en baseline skanning av hvert dyr før injeksjon av OI-fargestoffet, eller bruk naive kontrolldyr for å skille mellom bakgrunnssignalet.
- H etter haleinnsprøytningen av OI-fargestoffet, plasser dyrene i midten av FOV, i en posisjon for å måle det høyeste signalet i OI-systemet, og start målingene.
MERK: Viktig: Hypotermi kan betydelig påvirke fordelingen av bildemidlene. Sørg for at scenen er oppvarmet til 37 ° C for å unngå hypotermi hos dyret. Imaging kan utføres samtidig med dyr i grupper på 1 til 5 mus. Velg størrelsen på FOV, avhengig av antall dyr som måles samtidig. Du kan ta et lyst feltbilde for å sjekke om hver mus er synlig.
5. Dataanalyse
MERK: Utfør dataanalyse ved å bruke bildeprogramvaren som følgerProdusentens protokoll.
- For målinger av RA, bruk den kalibrerte enheten til fotonemisjonen som vist i figur 2 , mens kronisk CHSR er avbildet som signalintensitet i prosent (effektivitet).
- For å tegne avkastningene manuelt, bruk verktøylinjen. For analysen av RA-bildene, bruk en standardisert sirkel, plassert rundt det høyeste signalet i alle ankler og poter av hvert dyr. For å analysere CHSR, plasser avkastningen rundt hele høyre og venstre øre i henhold til det lyse feltbildet.
- For å måle fotonemisjon eller signalintensitetsverdier i den spesifikke avkastningen, trykk på "måle". Systemet vil gi verdier i tegnet ROI for beskrivende statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å indusere reumatoid artritt (RA) hos naive BALB / c-mus, ble dyr injisert ip med autoantistoffer (1: 1 fortynning med 1x PBS) mot GPI på dag 0. Den maksimale betennelsen (ankelhevelse) i dette GPI-serum indusert RA-modellen er på dag 6 etter injeksjon 11 . Derfor ble 2 nmol av det aktiverbare OI-fargestoffet preparert og injisert iv i halevenen av arthritiske mus og friske kontrolldyr på dag 5. 24 timer etter injeksjon (dag 6) ble musene bedøvet og avbildet som beskrevet i avsnitt 3 ( Figur 1A ).
For å indusere CHR ble C57BL / 6-musene sensibilisert med 5% TNCB på dag 0 i barbert underliv. På dag 7 post sensibilisering startet den første utfordringen på høyre øre med 1% TNCB. Opp til fem utfordringer (dag 15) ble utført for å indusere kronisk betennelse. 7 12 timer etter te siste utfordring, 20 nmol av den OI fargestoff ble injisert iv. På dag 15, 24 timer etter injeksjon, ble OI utført som beskrevet ovenfor (figur 1B).
Figur 2 viser en tydelig forbedret fluorescenssignal i bakpotene, ankler og forlabbene av RA-mus på dag 6 etter sykdomsinduksjon, sammenlignet med kontroll ankler (figur 2A). Biofordeling analyse av MMP-aktivitet i organer hos mus RA og friske mus oppviste et sterkt forbedret signal i bakpotene, ankler og forlabbene utelukkende i leddene i RA-mus. Interessant nok har vi fastslått en forbedret MMP signal i begge nyrer av alle målte RA-mus, sammenlignet med nyrene fra friske kontrollmus (Figur 2A, høyre). Dessuten målte vi en forbedret MMP signal i leveren og tarmen uten hensyn til hvorvidt mus lider av RA. Ingen forskjeller mellom RA og friske mus ble funnet i tHan bukspyttkjertel, lunge, milt og hjerte.
Under kronisk CHR (fem TNCB utfordringer på høyre øre), målt vi høyt økt MMP aktivitet på høyre inflammet øre sammenlignet med det sunne venstre kontrolløret ( figur 2B ).
Dermed viser våre data en viktig rolle for MMP-aktivitet under sykdomsprogresjon i begge betennelsessykdomsmodeller.
Verktøy for bioluminescens og fluorescens tillater kvantifisering av for eksempel pmol av fluorokrom eller antall celler som uttrykker fluorescens. Data kan vises i 1. Teller: Viser en ukalibrert måling av fotonhendelsen på kameraet. 2. Radiance (fotoner): Indikerer en kalibrert måling av fotonemisjonen i "fotoner / sekund / cm2 / steradian", som er Anbefalt for luminescensavbildning eller 3. RStråle Effektivitet (fluorescens): viser fluorescensemisjonen utstråling pr hendelse magnetiseringseffekt, anbefales for fluorescensmålinger.
En stor fordel av å arbeide med utstråling enheter, mens analyse OI-bilder er, at kamerainnstillinger kan endres i løpet av et eksperiment, og denne har ingen innvirkning på bildene i seg selv eller de målte data ROI, noe som ytterligere gjør det mulig å sammenligne bilder fra forskjellige Ivis systemer.
Den region av interesse (ROI) indikerer det spesifikke område av interesse fra brukeren i et optisk bilde. Den verktøy gjør det mulig å trekke 3 forskjellige ROIs: måling (et mål på signalintensiteten i ROI av bildet), gjennomsnittlig bakgrunn (måler den gjennomsnittlige signalintensitet i den brukerdefinerte området for bakgrunnen), eller gjenstand ROI (identifiserer et emne dyr i et bilde).
Hvis motivet disspiller en høy uspesifikk bakgrunnssignal i seg selv, får en bakgrunnskorrigert ROI måling ved å subtrahere bakgrunnssignalet (ROI) fra den målavkastningen. Still inn bilde minimum nær null å bestemme auto fluorescens eller naturlig forekommende bakgrunns luminescens i bildet. Linke bildet til et egendefinert (brukerspesifikk) bakgrunnsbilde (ROI) som ble målt først og fremst til den målte bestemt bilde.
Semi-kvantitative analyser av bildene ble utført ved å trekke standardiserte regioner av interesse (ROIs) i både artritiske og styrer ankler, samt i betente og friske ører ved hjelp av levende bilde programvare. Bare deskriptive statistiske analyser ble utført på in vivo-data i dette manuskriptet, på grunn av utilstrekkelig antall dyr. Analyse av signalintensiteten av leddgikt og sunne ankler eller labber viste et 7-gangers forbedret MMP signalintensitet i leddgikt, sammenlignet med kontroll anklene. En 3 ganger høyere MMP signalintensitet ble påvist i forlabbene av artrittiske mus sammenlignet med den til de friske dyr (figur 3A).
Analyse av ører med akutt og kronisk CHR i forhold til den venstre ubestridt kontroll øre viste en signifikant økning i MMP signal selv etter at en st utfordring, noe som ytterligere øker etter det 3. og holdt seg på det samme nivå inntil den 5. utfordring (figur 3B) . Som en følge av forurensning med kontaktgenet på det venstre øret på grunn av skraping av musene, bestemmes vi en svakt øket MMP signal i det venstre (ikke TNCB utfordret) kontroll øre. Resultatene indikerer en viktig rolle for MMPs, ble påvist ved en sterkt øket fluorescens-signal i løpet av GPI-artritt og kronisk inflammasjon, som målt ved OI.
Last / 55180 / 55180fig1.jpg "/>
Figur 1: RA og CHR modell, tidskurs for sykdomsinduksjon og tidspunkter for OI. (A) Tidskurs for RA-induksjon i BALB / c-mus (B) og kronisk CHR-induksjon i C57BL / 6-mus. Oversikt over respektive in vivo- bildepunktspunkt og tilhørende injeksjonstidpunkter i OI-fargestoffet for måling av MMP-aktivitet i begge modellene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MMP OI i RA, CHR og Control Animals. (A) Representative resultater av den målte MMP-aktiviteten i en artrittmus 6 dager etter GPI-artrittinduksjon og en sunn kontrollmus (venstre side). Signifikant høyere signal (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) intEnsitet ble observert i leddgikt sammenlignet med den sunne musen. Bildet til høyre viser MMP-aktiviteten i bakpoten og inkluderer ankler, forpoter, bukspyttkjertel, lunger, milt, hjerte, nyrer, lever og tarme av en ofret GPI-artrittmus etter OI-fargestoffinjeksjon. OI avdekket et høyt signal i forpoter, ankler og bakpoter av RA-mus og lever og tarm, uavhengig av om musene ble injisert med GPI-serum (RA-mus) eller kontrollserum (friske kontrollmus). (B) MMP fluorescenssignal i ører med kronisk CHR (venstre) og kontrolldyr (høyre). Det inflammerte høyre øre (utfordret 5 ganger) viser et sterkt forbedret signal sammenlignet med kontrollører. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
<Figur 3: Halvkvantitativ analyse av inflammet og sunn ankler og ørevæv ved bruk av OI. (A) Halvkvantitativ analyse av fluorescenssignalet i RA og friske dyr i frontpoten og ankelleddene. Artritiske frontpoter og ankelforbindelser viser et signifikant (** p <0,05) (n = 3) høyere MMP-signal i forhold til friske ankelled og frontpoter. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SD. (B) Semikvantitativ analyse av venstre og høyre (utfordret) ører etter 1. , 3. og 5. utfordring. MMP-signalet økes vesentlig fra den første til den femte utfordringen og viste allerede en maksimal signalintensitet i det høyre utfordret øre etter 3. utfordring (** p <0,05) (n = 3) (Kontrollører er delvis forurenset med TNCB På grunn av musens riper. Dette ga et forbedret signal som ikke var signifikant). Dataene presenteres som gjennomsnittet± SEM. De to-halet t-test ble anvendt for å analysere forskjeller mellom betennelse (GPI-artritiske anklene, høyre behandlede ører) og kontroll (kontroll ankler, venstre ubehandlede ører) for begge modeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI er en meget nyttig, rask og billig verktøy for ikke-inntrengende in vivo molekylær avbildning i prekliniske undersøkelser. En særlig styrke OI er evnen til å overvåke sterkt dynamiske prosesser som inflammatoriske responser. Videre tillater OI man for å følge forløpet av en sykdom i en lengre periode, som strekker seg fra dager til uker.
OI har flere fordeler fremfor andre in vivo avbildningsmetoder, slik som positron-emisjonstomografi (PET) eller magnetisk resonans imaging (MRI), som det er meget tids- og kostnadseffektive. High-throughput-analyse med opptil fem dyr pr anskaffelse er mulig. Videre er et stort antall sonder, rettet mot mange forskjellige biologiske prosesser, er tilgjengelige. 12 For å gi ytterligere anatomisk informasjon, kan OI kombineres med andre imaging-teknikker slik som MRI eller røntgen. En annen begrensning er den lave vev inntrengningsdybde i forhold til for eksempel fUnksjonell PET-bildebehandling. Videre er en stor mengde prober rettet mot mange forskjellige biologiske mål tilgjengelig. 12
Effekter av anestesi bør ikke undervurderes i in vivo bildebehandling. Selv om spesifikke effekter av anestesi på OI-resultatene ikke er godt karakterisert, har vår gruppe vist i flere studier effekten av anestesi på PET-bildebehandling. 13 , 14 , 15 Fuchs et al. Analyserte blodparametere, slik som pCO2, pH og laktat før og etter PET-skanning ved hjelp av forskjellige puste- og anestesiprotokoller. Det ble vist at signifikante endringer i pCO2- og laktatnivåer i bedøvelse sammenlignet med bevisst oksygen- eller luftpustemus, førte til signifikante endringer i PET-resultater. 14 De konkluderer med at denne effekten hovedsakelig skyldes oksygenpust og senereT til respiratorisk acidose hos dyr, noe som fører til de forskjellige resultatene i PET-avbildningen.
Standardisering av anestesiparametre, som O 2 -koncentrasjoner og doser av bedøvelsesmidler, samt forebygging av hypotermi, bidrar til å unngå systematiske feil. Selvfølgelig er OI begrenset av fysiske egenskaper, f.eks. Lysspredning, vevs-auto-fluorescens og lysdempning 9 . Flere grupper behandler disse problemene ved å kombinere de makroskopiske resultatene av OI med andre teknikker som fluorescensmikroskopi in vivo eller flowcytometri.
In vivo avbildning av MMP aktivitet ved MMP-spesifikke aktiverbare fluorescerende prober har blitt brukt i flere eksperimentelle modeller av betennelse som CHS, 7, men også i sykdommer som cerebral iskemi, 16 aorta aneurysmer, 17 myokardinfarkt 18Og aterosklerotiske plakk 19 samt forskjellige svulstmodeller. 20
For eksempel beskriver Cortez-Retamozo et al. Undersøkte in vivo- aktiviteten til MMP i en modell av allergisk luftveisinflammasjon ved å injisere en MMP-aktiverbar probe, 24 timer etter intranasal påføring av ovalbumin i tidligere sensibiliserte mus. 21 For å identifisere plasseringen av MMP-aktivitet, kombinerte denne gruppen kombinert tomografisk OI, NIR fiberoptisk bronkoskopi og intravital mikroskopi for å overvåke sykdomsforløpet og behandlingsresponsen i større detalj. 21
Andre tilnærminger til å måle in vivo MMP-aktivitet bruker for det meste hemmere av MMP som binder til det aktive stedet for MMPs. McIntyre et al. Beskrev en in vivo- tumorassosiert MMP-7-deteksjon ved bruk av et "polymerbasert fluorogent substrat", som virker som en "proteolytIc beacon "for MMPs i en mus xenograft modell. 22 De viser at aktiviteten til MMP-7 kunne detekteres selektivt ved optisk avbildning. 23 Videre undersøkte Olson et al. " Aktiverbare cellepenetrerende peptider "(ACPP) som er i stand til å Målrette mange xenograft svulstmodeller, men kan ikke adsorbere inn i cellen før linkeren er proteolysert. De undersøkte ACPP som er selektive for MMP-2 og MMP-9. 24 , 25
Merking av MMP-hemmere med radioaktive isotoper for single-photon emission computed tomography (SPECT) eller PET-bildebehandling ble brukt til å studere MMP-uttrykk i aterosklerose 26 og kreft 27 . I en nylig studie ble en fluorescens-merket MMP-inhibitor sammenlignet med en MMP-aktiverbar probe. 28 Den fluorescens-merkede MMP-inhibitoren viste et lavere signal til støyForhold sammenlignet med en aktiverbar probe, men krevde en kortere opptakstid.
Nye biomarkører for å vurdere viktige trekk ved patofysiologi kan utnyttes og valideres av OI. For eksempel er responsen på fareassosierte molekylære mønstre (DAMPs) en tidlig begivenhet under en inflammatorisk reaksjon. Vogl et al. Brukte et Cy5.5-merket antistoff mot alarmin S100A9 i modeller av akutt ørehuddermatitt, kollageninducert leddgikt og infeksjon med Leishmania major for å utvikle sensitiv biomarkør for tidlig tegn på betennelse. 29
Til slutt representerer OI en rask og effektiv metode for preklinisk forskning, som er i stand til å avdekke nye sykdomsmekanismer in vivo , karakteriserer nye molekylære mål, samt overvåking av terapeutiske effekter . Likevel kan en etterfølgende valideringsprosess med mer kvantitative teknikker som PET være nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Daniel Bukala, Natalie Altmeyer og Funda Cay for utmerket teknisk støtte. Vi takker Jonathan Cotton, Greg Bowden og Paul Soubiran for redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Werner Siemens-stiftelsen og Medisinsk fakultet for Eberhard Karls Universitet Tübingen ("Promotionskolleg") og av DFG gjennom CRC 156 (prosjekt C3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C.
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
