Summary
Este documento explica a aplicação de imagem fluorescente usando uma sonda de imagiologia óptica activável para visualizar a actividade in vivo de metaloproteinases de matriz chave em dois modelos experimentais diferentes de inflamação.
Abstract
Este trabalho descreve um método não invasivo para a formação de imagens de metaloproteinases de matriz (MMP) por meio de uma sonda fluorescente ativável, através de imagens ópticas de fluorescência in vivo (OI), em dois modelos diferentes de inflamação: uma artrite reumatóide (RA) e um contato Reacção de hipersensibilidade (CHR). A luz com um comprimento de onda na janela do infravermelho próximo (NIR) (650 - 950 nm) permite uma penetração mais profunda do tecido e uma absorção de sinal mínima em comparação com comprimentos de onda inferiores a 650 nm. As principais vantagens da utilização de fluorescência OI é que é barato, rápido e fácil de implementar em diferentes modelos animais.
As sondas fluorescentes activáveis são opticamente silenciosas nos seus estados inactivados, mas tornam-se altamente fluorescentes quando activadas por uma protease. As MMPs activadas conduzem à destruição dos tecidos e desempenham um papel importante na progressão da doença em reacções de hipersensibilidade de tipo retardado (DTHRs) tais como RA e CHR. Além disso, as MMPs sãoas proteases essenciais para a cartilagem e osso e são degradação induzida por macrófagos, fibroblastos e condrócitos em resposta a citoquinas pró-inflamatórias. Aqui nós usar uma sonda que é activada pelas MMPs chave como a MMP-2, -3, -9 e -13 e descrever um protocolo de imagiologia para perto OI fluorescência no infravermelho de actividade de MMP na AR e ratinhos de controlo 6 dias após a indução da doença bem como em ratos com aguda (1x desafio) e crônica (5x desafio) CHR na orelha direita em comparação com os ouvidos saudáveis.
Introduction
doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide (AR) ou psoríase vulgar são classificadas como reacções de hipersensibilidade do tipo retardado (DTHRs). 1 AR é uma doença auto-imune comum caracterizada por sinovite erosiva e destruição da articulação. 2 articulações artríticas inflamadas demonstrar a infiltração e a proliferação de células inflamatórias, um aumento da expressão de células pró-inflamatórias que conduzem à formação de pannus, cartilagem e osso destruições. 3, 4 A clivagem de moléculas da matriz extracelular, tal como colagio por metaloproteinases de matriz (MMPs), é essencial para a conversão de tecido e a angiogénese e provoca destruição de tecidos. 5, 6 de contato reacções de hipersensibilidade (CHR) são caracterizadas pela agregação de neutrófilos que conduzem a uma explosão oxidativa. 7 Semelhante ao RA, MMPs em CHR são involved na conversão de tecido, a migração celular e a angiogénese, a fim de estabelecer a inflamação crónica.
Para investigar a AR, foi usada a isomerase de glucose-6-fosfato (GPI) modelo de ratinho injecção -serum. 8 O soro de ratinhos K / BXN transgénicas contendo anticorpos contra a GPI, foi injectada em ratinhos Balb / c, após o que a inflamação reumática começaram a desenvolver dentro de 24 h com um máximo de tornozelo inchaço no dia 6 após a injecção GPI-soro (ver 1.1). Para analisar CHR crónica, ratinhos C57BL / 6 foram sensibilizados com trinitroclorobenzeno (TNCB) no abdómen. A orelha direita foi desafiada até 5 vezes a partir de 1 semana após a sensibilização (ver também 1,1 e 1,2).
Não invasiva pequena OI animal é uma técnica baseada na investigação in vivo de Fluorescente, chemiluminescent- e bioluminescentes-sinais, que são usados principalmente em estudos pré-clínicos. Os dados semi-quantitativa adquiriu dá insights sobre o MolecMecanismos moleculares nos órgãos e tecidos de modelos animais saudáveis e doentes, e permite medições de seguimento longitudinal ( por exemplo, para avaliar os perfis de resposta terapêutica in vivo ). Uma grande vantagem dos estudos longitudinais é a redução do número de animais, uma vez que os mesmos animais podem ser medidos em estudos de acompanhamento em vários pontos de tempo, em vez de usar ratos diferentes por ponto de tempo. A resolução de OI permite imagens funcionais detalhadas de órgãos e estruturas de tecido ainda menores em animais experimentais.
O uso de filtros específicos de excitação e emissão com um espectro de transmissão estreito, uma proteção contra a luz dispersa por uma "caixa escura" à prova de luz e uma câmera sensível de acoplamento de carga (CCD), que é resfriada em muitos dispositivos até -70 ° C , Permite medidas altamente específicas e sensíveis de sinais de fluorescência.
Utilizando agentes fluorescentes comEspectro de emissão na janela de fluorescência do infravermelho próximo (650 - 950 nm), as relações sinal / ruído podem ser melhoradas significativamente. A janela de fluorescência no infravermelho próximo é caracterizada por uma absorção relativamente baixa do sinal por hemoglobina e água, bem como uma auto-fluorescência de baixo fundo. 9 Isso permite uma profundidade de penetração de até 2 cm no tecido de pequenos animais. As sondas OI podem dirigir-se directamente a um alvo ( por exemplo, por um anticorpo marcado com fluoresc�cia) ou podem ser activadas no tecido alvo ( por exemplo, por proteases). As sondas OI activáveis são opticamente silenciosas na sua forma inactivada devido à transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) para uma porção de extinção, que transfere a energia de excitação dentro da molécula para outro domínio. Se o corante é clivado (por uma protease, por exemplo) a energia não é mais transferida dentro da molécula e um sinal fluorescente pode ser detectado por OI. Isto permite a concepção de sondas OI com alta especificidadey para os processos biológicos distintos e excelentes Noise-relações sinal-para-.
O protocolo que se segue explica em pormenor a preparação dos animais, as medições OI OI utilizando uma sonda Activatable a imagem de MMP-2, -3, -9 e -13 actividade in vivo e dois modelos experimentais de inflamação (RA, CHR).
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Protocol
Todos os procedimentos descritos neste documento, seguiu as diretrizes e normas internacionais do cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Bem-Estar Animal e Comitê de Ética local do país Comissão Tuebingen, Alemanha. 8 - 12 semanas de idade BALB / c e C57BL / 6 murganhos foram mantidos num ciclo de 12 h: 12 h luz: ciclo escuro e foram alojados em IVCS e condições ambientais padronizadas a 22 ± 1 ° C em grupos de 2-5 com água e alimentos ad libitum acesso.
1. Preparação de Material
- Dilui-se o corante OI para imagiologia de fluorescência no infravermelho próximo de acordo com a respectiva folha de dados directamente antes da injecção. O corante OI activável (sonda comercial com uma excitação a 680 nm) para medir as MMPs in vivo, está pronto para usar, a uma concentração de 20 nmol em 1,5 mL de 1x PBS. Agitar suavemente a solução ou vortex antes da utilizao. OI corante pode ser armazenado a 2 - 8 ° C durante até 6 meses quando protegida da luz. Para injecções intravenosas ( iv ) preparar um cateter venoso. Use uma seringa de insulina de 20 U (0,5 mL) cheia com solução salina a 0,9% (contendo 10 unidades de injeção de heparina em 50 mL) e uma agulha de calibre 30 conectada a um cateter de polietileno. Injectar a dose recomendada de 2 nmol por rato do corante OI.
2. Indução da Artrite Reumatóide e da Reação de Hipersensibilidade de Contato Crônico
- Artrite reumatóide:
- Diluir 100 μL de soro (obtido de ratinhos K / BxN 10 ) contendo anticorpos (AB) contra glucose-6-fosfato isomerase (GPI) 1: 1 com 1x PBS (200 μL) para induzir RA. Armazenar o soro diluído a -80 ° C. Os procedimentos detalhados para a indução da AR são descritos por Monach et al. 8 .
- Para induzir RA, levantar cada rato suavemente pela sua cauda e injectar 200 μL do soro diluído intraperitoneal ( ip ) no dia 0 de tEle experimenta. Após a injeção, coloque o mouse diretamente em sua gaiola.
- Opcionalmente, medir os diâmetros do tornozelo de cada tornozelo, antes de injeções de AB e definir uma "pontuação artrítica" ( Figura 1A ). Continuar a medição do inchaço do tornozelo diariamente até ao dia 6 após GPI-soro utilizando um dispositivo mecânico de medição (micrómetro).
- Injectar o corante OI activável (passo 1.1 - 1.2), para medir a actividade de MMP in vivo iv na veia da cauda de ratinhos RA No dia 5 após injecção de GPI-soro e na veia da cauda de ratinhos de controlo. Realizar experiências de imagem óptica 24 h após a injeção da veia da cauda.
- Reacção de hipersensibilidade de contacto:
- Para a sensibilização de ratinhos C57BL / 6, preparar uma solução de TNCB a 5% dissolvida numa mistura 4: 1 de acetona / óleo.
- Anestesiar ratos C57BL / 6 utilizando isoflurano a 1,5% vaporizado em oxigénio a 100% (1,5 L / min). Uma vez que os ratos são anestesiados, colocá-lo em um auto-louco E um cone de nariz (uma seringa de polietileno cortada de 5 mL, ligada ao tubo de isoflurano a 1,5% em volume) e manter a anestesia. Aplique pomada oftálmica veterinária em animais anestesiados para evitar a secura dos olhos durante a anestesia.
- Raspar o abdômen cuidadosamente (2 x 2 cm) usando um pequeno aparador de pêlos de animais. Evite ferir a pele, pois isso pode levar a sinais fluorescentes inespecíficos dentro do animal e pode influenciar os resultados do estudo.
- Aplique 80 μL da solução de TNCB a 5% lentamente na área do abdome raspado, utilizando uma pipeta de 100 μL para sensibilizar o animal. Coloque o mouse suavemente de volta em sua gaiola tendo o cuidado de garantir que os olhos do mouse não entrar em contato com a cama para evitar lesões da córnea e evitar baixas temperaturas corporais durante a fase de recuperação.
- Seis dias após a sensibilização, preparar uma solução de TNCB a 1% (dissolvida numa mistura 9: 1 de acetona / óleo) e aplicar 20 μL na orelha direita utilizando uma pipeta para provocar CHSR aguda e crónica."> 1
- Comece com o primeiro desafio em ambos os lados da orelha direita com 20 μL de solução de TNCB a 1%, utilizando uma pipeta de 100 μL e repita o desafio a cada dois dias até cinco vezes (dia 15 após a sensibilização) para obter CHR ( Figura 1B ) . Medir a espessura da orelha diariamente, usando um dispositivo de medição micrômetro.
- Injectar o corante OI activável (uma sonda comercial com excitação a 680 nm) (passo 1.1-1.2) para medir a actividade de MMP in vivo em ratinhos CHR 12 h após a provocação. Realizar experimentos de imagem óptica 24 h após a injeção da veia da cauda ( iv ).
3. Preparação de animais para imagens ópticas
- Mudar o chow do rato (pelo menos 3 dias antes da imagem) para comida baixa ou não fluorescente ( por exemplo , livre de manganês) para evitar a interferência da auto-fluorescência (cerca de 700 nm) com o sinal de fluorescência dos agentes OI utilizados.
- Coloque o animal empara uma caixa de anestesia e anestesiar utilizando 1,5 vol% de isoflurano vaporizado com oxigénio (1,5 L / min) (de oxigénio pode ser substituído por ar, mas deve ser normalizados para cada um experimento).
- Quando o rato é visivelmente anestesiados, colocá-lo em um cone de nariz de auto-fabricados (por construir um corte de 5 mL de uma seringa de polietileno, ligado ao tubo de isoflurano 1,5% vol) e manter a anestesia.
- Raspar o animal cuidadosamente no local alvo (2 cm por 2 cm), utilizando um pequeno aparador de pêlos. Evitar ferir a pele, pois isso pode levar a sinais fluorescentes inespecíficos dentro do animal e pode influenciar os resultados do estudo.
NOTA: Os cabelos podem absorver o sinal de fluorescência durante OI (dependente da estirpe de ratinho, mais ou menos absorção é observado), dependendo da região de interesse (ROI). - Para injecção iv, colocar a cauda do rato em água aquecida, para induzir a vasodilatação, limpar suavemente a pele no local da injecção com álcool, e começar por colocar o cateter emo local distal da cauda. Coloque a "cortar" aresta da agulha em, a um ângulo de 20 ° na veia da cauda e testar a colocação correcta do cateter por re-suspensão da seringa.
- Se o cateter está colocado correctamente, substituir a seringa e injectar a sonda OI (2 nmol). Após a injecção, substituir a seringa e injectar 25 mL de solução salina a 0,9% para totalmente claro o volume morto do tubo de polietileno.
NOTA: O tecido tempo de meia-vida do corante usado OI (uma sonda comercial com excitação a 680 nm) para medir a actividade de MMP in vivo é de 72 h. Para garantir uma eliminação completa, a re-injeção do corante não é recomendado mais cedo do que 7 dias após a injecção antes.
4. Imagem Óptico
- Coloque um plástico preto ou folha de papel na caixa preta do OI-scanner no centro do campo de visão (FOV).
- Defina-se um protocolo de medição e escolher o comprimento de onda direita (excitação: 680 ± 10 nm e eMissão: 700 ± 10 nm) e parâmetros de imagem.
NOTA: Em alguns sistemas OI, a configuração para vários corantes de imagem está pré-definida. - Para escolher o protocolo correto para a imagem de fluorescência, abra o software de criação de imagens (fornecido pelo fabricante) e inicialize o sistema. A maioria das câmeras CCD precisa esfriar a sua temperatura de trabalho, e isso pode levar 10 minutos. Para resultados confiáveis, aguarde até que o sistema esteja pronto.
- Observe o painel de controle de aquisição do sistema de imagem in vivo pop up e cada par de filtros selecionado irá representar uma imagem na seqüência. Neste caso, adquira uma imagem com os pares de filtros para o corante comercial com um comprimento de onda de excitação e emissão de 680 ± 10 nm e 700 ± 10 nm, respectivamente, e inicie a medição (Pressione "Acquire sequence"). Para obter instruções mais detalhadas, consulte o manual do fabricante.
- Rotule adequadamente as imagens e salve as informações na seção "Editar imagemLabels "janela, que irá aparecer após a" seqüência de aquisição ".
- Tome uma varredura basal de cada animal antes da injeção do corante OI, ou use animais de controle ingênuos para diferenciar o sinal de fundo.
- H após a injeção da veia da cauda do corante OI, colocar os animais no centro do FOV, em uma posição para medir o sinal mais alto no sistema OI, e iniciar as medições.
NOTA: Importante: A hipotermia pode influenciar significativamente a distribuição de agentes de imagem. Certifique-se que o estágio é aquecido até 37 ° C para evitar a hipotermia do animal. A imagiologia pode ser realizada simultaneamente com animais em grupos de 1 a 5 ratinhos. Escolha o tamanho do FOV dependendo do número de animais a medir ao mesmo tempo. Você pode tirar uma imagem de campo brilhante para verificar se cada mouse está visível.
5. Análise de Dados
NOTA: Execute a análise de dados usando o software de imagemProtocolo do fabricante.
- Para medições de RA, use a unidade calibrada da emissão de fótons como mostrado na Figura 2 , enquanto que a CHSR crônica é representada como a intensidade do sinal em porcentagem (eficiência).
- Para desenhar ROI manualmente, use a placa de ferramentas. Para a análise das imagens RA usar um círculo padronizado, colocado em torno do sinal mais alto em todos os tornozelos e patas de cada animal. Para analisar o CHSR, coloque o ROIs em torno de toda a orelha direita e esquerda de acordo com a imagem do campo brilhante.
- Para medir a emissão de fótons ou os valores de intensidade do sinal no ROI específico, pressione "measure". O sistema fornecerá valores no ROI desenhado para análise estatística descritiva.
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Representative Results
Para induzir a artrite reumatóide (RA) em ratinhos BALB / c nativos, os animais foram injectados ip com auto-anticorpos (diluição 1: 1 com 1x PBS) contra GPI no dia 0. A inflamação máxima (inchamento do tornozelo) induzida neste soro GPI O modelo RA está no dia 6 pós-injeção 11 . Por conseguinte, preparou-se 2 nmol do corante OI activável e injectou-se iv na veia da cauda de murganhos artríticos e animais de controlo saudáveis no dia 5. 24 h após a injecção (dia 6), os ratinhos foram anestesiados e fotografados como descrito na secção 3 Figura 1A ).
Para induzir CHR, os ratinhos C57BL / 6 foram sensibilizados com TNCB a 5% no dia 0 no abdómen raspado. No dia 7 pós sensibilização iniciou-se o primeiro desafio no ouvido direito com 1% de TNCB. Foram realizados até cinco desafios (dia 15) para induzir inflamação crónica. 7 12 h após the último desafio, 20 nmol do corante OI foi injetada iv. No dia 15, 24 h após a injecção, OI foi realizada como descrito acima (Figura 1B).
A Figura 2 mostra claramente um sinal de fluorescência melhorada nas patas traseiras, tornozelos e as patas dianteiras do rato RA no dia 6 após a indução da doença, em comparação com o controle tornozelos (Figura 2A). análise Biodistribuição da actividade de MMP, em órgãos de ratos e ratinhos saudáveis RA exibiram um sinal fortemente reforçada nas patas traseiras, tornozelos e as patas dianteiras exclusivamente nas articulações dos ratinhos de AR. Curiosamente, determinou-se um sinal de MMP melhorada em ambos os rins de todos os ratos RA medidos, quando em comparação com os rins de ratos saudáveis de controlo (Figura 2A; direita). Além disso, foram medidos um sinal de MMP melhorada no fígado e no intestino independentemente do facto dos ratos sofrem de RA. Não houve diferenças entre RA e ratos saudáveis foram encontrados em tele pâncreas, pulmão, baço e coração.
Durante CHR crónica (cinco desafios TNCB na orelha direita), medimos altamente aumento da actividade de MMP no ouvido inflamado direito em relação ao ouvido esquerdo de controlo saudável (Figura 2B).
Assim, os nossos dados estão indicando um papel importante da actividade de MMP durante a progressão da doença em ambos os modelos de doenças inflamatórias.
Conjuntos de ferramentas para a bioluminescência e a fluorescência permitir a quantificação de, por exemplo, pmol de fluorocromo ou o número de células que expressam de fluorescência. Os dados podem ser exibidos em 1. Contagens: mostra uma medida não calibrada do fotão incidente na câmara, 2. Radiance (fotões): indica uma medição calibrada da emissão de fotões em "fotões / segundo / cm2 / esferorradiano", que é recomendada para imagens de luminescência ou 3. RAdiant Efficiency (fluorescence): mostra radiação de emissão de fluorescência por potência de excitação incidente, recomendada para medições de fluorescência.
Uma grande vantagem de trabalhar com unidades de radiance ao analisar imagens OI é que as configurações da câmera podem ser alteradas durante uma experiência e isso não tem impacto nas próprias imagens ou nos dados de ROI medidos, o que permite comparar imagens de diferentes sistemas IVIS.
A região de interesse (ROI) indica a área específica de interesse do utilizador numa imagem óptica. A barra de ferramentas permite desenhar 3 ROIs diferentes: medição (mede a intensidade do sinal no ROI da imagem), fundo médio (mede a intensidade média do sinal na área definida pelo usuário para o fundo) ou ROI do objeto (identifica um animal sujeito em uma imagem).
Se o assuntoDesempenha um sinal de fundo altamente inespecífico em si, obter uma medida de ROI corrigida em segundo plano subtraindo o sinal de fundo (ROI) do ROI de destino. Defina a imagem mínima perto de zero para determinar a fluorescência automática ou luminescência de fundo que ocorre naturalmente em sua imagem. Vincular a imagem a uma imagem de plano de fundo autodefinida (específica para o usuário) que foi medida principalmente para a imagem específica medida.
As análises semi-quantitativas das imagens foram realizadas desenhando regiões padronizadas de interesse (ROIs) nos tornozelos artríticos e de controle, bem como em orelhas inflamadas e saudáveis usando o software Living Image. Somente análises estatísticas descritivas foram realizadas em dados in vivo neste manuscrito, devido ao número insuficiente de animais. A análise da intensidade do sinal de tornozelos ou patas artríticos e saudáveis mostrou uma intensidade de sinal MMP aumentada 7 vezes em artrítico, em comparação com os tornozelos de controlo. Um três vezes mais elevada intensidade de sinal de MMP foi detectada nas patas dianteiras de murganhos artríticos em comparação com a dos animais saudáveis (Figura 3A).
Análise de orelhas com CHR aguda e crónica em comparação com a orelha de controlo incontestada esquerda mostrou um aumento significativo do sinal de MMP, mesmo depois de o r desafio 1, que ainda aumentada após o 3o e manteve-se ao mesmo nível até que o 5 th desafio (Figura 3B) . Como uma consequência da contaminação com o alérgeno de contacto sobre a orelha esquerda, devido ao risco dos ratinhos, determinou-se um ligeiro aumento do sinal de MMP no esquerdo (não desafiados TNCB) orelha controlo. Os resultados indicam um papel importante das MMPs, evidenciado por um sinal de fluorescência aumenta muito durante a GPI reumatóide e inflamação crónica, tal como medido por OI.
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Figura 1: Modelo RA e CHR, Tempo de Indução de Doenças e Pontos de Tempo para OI. (A) Tempo de indução de AR em ratinhos BALB / c (B) e indução crónica de CHR em ratinhos C57BL / 6. Resumo do respectivo ponto de tempo de imagem in vivo e pontos de tempo de injecção associados do corante OI para medir a actividade de MMP em ambos os modelos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: MMP OI em AR, CHR e Animais de Controlo. (A) Resultados representativos da actividade de MMP medida num rato artrítico 6 dias após indução da artrite GPI e um rato de controlo saudável (lado esquerdo). Significativamente maior sinal (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) intensity foi observada no artrítica comparada com o rato saudável. A imagem da direita mostra a actividade de MMP nas patas traseiras e inclui o tornozelos, patas dianteiras, pâncreas, pulmão, baço, coração, rins, fígado e do intestino de um rato GPI artrite sacrificados após injecção OI corante. OI descoberto um sinal de alta nas patas dianteiras, tornozelos e as patas traseiras de ratos RA e no fígado e no intestino independentemente do facto dos ratos foram injectados com soro GPI (ratos RA) ou soro controlo (ratinhos de controlo saudáveis). Sinal de fluoresccia (B) MMP em orelhas com CHR crónica (esquerda) e animais de controlo (direita). A orelha direita inflamada (desafiou 5 vezes) exibe um sinal altamente melhorada em relação ao controle ouvidos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<br /> Figura 3: Semi Análise Quantitativa de inflamado e tornozelos saudáveis e tecido da orelha Usando OI. (A) análise semi-quantitativa do sinal de fluorescência em RA e animais saudáveis nas patas dianteiras e as articulações do tornozelo. patas dianteiras artríticas e articulações do tornozelo apresentar um aumento significante (** p <0,05) (n = 3) mais elevada do sinal de MMP em comparação com as articulações do tornozelo saudáveis e as patas dianteiras. Os dados são apresentados como a média ± DP. (B) análise semi-quantitativa do orelhas direitas (desafiadas) esquerda e depois a 1 o, 3 e 5 de desafio. Sinal de MMP é aumentada de forma significativa desde o primeiro para o 5 th desafio e já mostrou uma intensidade de sinal máxima na orelha direita desafiados após o desafio 3 rd (** p <0,05) (n = 3) (orelhas de controlo são parcialmente contaminado com TNCB devido aos ratinhos coçar. Isto produziu um sinal melhorada, o que não era significativo). Os dados são apresentados como a média± SEM. O teste t de Student de cauda 2 foi utilizado para analisar as diferenças entre inflamação (tornozelos GPI-artríticas, ouvidos direito tratados) e de controlo (controlo tornozelos, deixou orelhas não tratadas) para ambos os modelos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
OI é uma ferramenta muito útil, rápida e barata para imagens moleculares in vivo não invasivas em pesquisas pré-clínicas. Uma força particular de OI é a capacidade de monitorar processos altamente dinâmicos como respostas inflamatórias. Além disso, OI permite que se siga o curso de uma doença por um período de tempo prolongado, variando de dias a semanas.
OI tem várias vantagens em relação a outras modalidades de imagem in vivo , tais como a tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou a ressonância magnética (MRI), uma vez que é muito tempo e custo-eficiente. É possível uma análise de alto rendimento com até cinco animais por aquisição. Além disso, um grande número de sondas, visando muitos processos biológicos diferentes, estão disponíveis. 12 Para fornecer mais informações anatômicas, OI pode ser combinado com outras técnicas de imagem, como ressonância magnética ou raio-x. Outra limitação é a sua baixa profundidade de penetração no tecido, comparada por exemplo com fimagiologia PET unctional. Além disso, uma grande quantidade de sondas com o objetivo de muitos alvos biológicos diferentes estão disponíveis. 12
Efeitos de anestesia não deve ser subestimado em imagiologia in vivo. Embora os efeitos específicos da anestesia sobre resultados OI não estão bem caracterizadas, o nosso grupo tem demonstrado em vários estudos a influência de anestesia em resultados de imagem PET. 13, 14, 15 Por exemplo, Fuchs et al. parâmetros sanguíneos analisados, como pCO2, lactato e de pH antes e depois de PET, que utilizam diferentes protocolos de respiração e anestesia. Foi demonstrado que, alterações significativas em pCO 2 e os níveis de lactato em anestesiado em comparação com ratinhos de oxigénio ou de ar de respiração consciente conduziu a alterações significativas nos resultados de PET. 14 Eles concluem que este efeito é causado principalmente pela respiração de oxigénio e subsequenT à acidose respiratória em animais, levando a diferentes resultados na PET.
A padronização dos parâmetros anestésicos, como as concentrações de O 2 e as doses de anestésicos, bem como a prevenção da hipotermia, ajudam a evitar falhas sistemáticas. Evidentemente, a OI é limitada por propriedades físicas, por exemplo , dispersão da luz, auto-fluorescência do tecido e atenuação da luz 9 . Vários grupos estão endereçando estes problemas combinando os resultados macroscópicos de OI com outras técnicas como a microscopia de fluorescência in vivo ou citometria de fluxo.
A imagiologia in vivo da actividade de MMP por sondas fluorescentes activas específicas de MMP tem sido utilizada em vários modelos experimentais de inflamação como CHS 7 , mas também em doenças como isquemia cerebral, 16 aneurismas aórticos, 17 infarto do miocárdio 18E placas ateroscler�icas 19 bem como v�ios modelos de tumores. 20
Por exemplo, Cortez-Retamozo et ai. Investigaram a actividade in vivo de MMPs num modelo de inflamação alérgica das vias respiratórias por injecção de uma sonda activável por MMP, 24 h após aplicação intranasal de ovalbumina em ratinhos previamente sensibilizados. 21 Para identificar a localização da atividade de MMP, este grupo combinou a OI tomográfica, a broncoscopia de fibra óptica NIR e a microscopia intravital, a fim de monitorar o curso da doença e a resposta do tratamento em maior detalhe. 21
Outras abordagens para medir a actividade de MMP in vivo utilizam principalmente inibidores de MMP que se ligam ao local activo de MMPs. McIntyre et ai. Descreveram uma detecção de MMP-7 associada a tumor in vivo utilizando um "substrato fluorogénico baseado em polímero", que actua como um "proteolitoOs resultados mostraram que a atividade da MMP-7 pode ser detectada seletivamente por imagem óptica.23 Além disso, Olson et al., Investigaram "peptídeos penetrantes celulares ativáveis" (ACPPs) que são capazes de Alvo muitos modelos de tumor de xenoenxerto, mas não podem adsorver na célula até que o ligante seja proteolizado.Estudaram ACPPs que são selectivas para MMP-2 e MMP-9 24 , 25
A etiquetagem de inibidores de MMP com isótopos radioativos para tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) ou PET foi usada para estudar a expressão de MMP na aterosclerose 26 e câncer 27 . Num estudo recente, um inibidor de MMP marcado com fluorescência foi comparado com uma sonda activável por MMP. 28 O inibidor de MMP marcado com fluorescência mostrou um sinal de ruído menorComparada com uma sonda activável, mas requer um tempo de absorção mais curto.
Novos biomarcadores para avaliar as principais características da fisiopatologia podem ser utilizados e validados por OI. Por exemplo, a resposta a padrões moleculares associados a perigo (DAMPs) é um acontecimento precoce durante uma reacção inflamatória. Vogl et ai. Utilizaram um anticorpo marcado com Cy5.5 contra o alarmin S100A9 em modelos de dermatite aguda da pele do ouvido, artrite induzida por colagénio e infecção com Leishmania major para desenvolver um biomarcador sensível para sinais precoces de inflamação. 29
Em conclusão, OI representa um método rápido e eficiente para a pesquisa pré-clínica, que é capaz de descobrir novos mecanismos de doenças in vivo , caracterizando novos alvos moleculares, bem como o monitoramento de efeitos terapêuticos . No entanto, um processo de validação posterior com mais técnicas quantitativas como PET pode ser necessário.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay para excelente suporte técnico. Agradecemos Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran para a edição do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation e da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard Karls de Tübingen ( '' Promotionskolleg '') e pela DFG através da CRC 156 (C3 projeto).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
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