Summary
この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。
Abstract
合成生物学、タンパク質 - タンパク質複合体の研究、および生合成経路の特徴付けおよび利用には、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠である。この原稿では、誘導性T7RNAポリメラーゼの制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。ここでは、アンピシリンまたはカナマイシン耐性選択マーカー（AおよびK）のいずれかとN末端ヘキサヒスチジンを有するかまたは欠いている4つの関連ベクターpMGX-A、pMGX-hisA、pMGX-KおよびpMGX-hisKのセットタグ（his）が開示される。 5つの遺伝子を含むpMGXベースのシステムが容易に構築され、 大腸菌で 5つのコードされたタンパク質すべてを産生することができることを示す、このベクターシステムを用いた合成オペロンの構築のための詳細なプロトコールを対応するデータと共に提供する。このシステムemとプロトコルは、研究者が大腸菌で複雑な多成分モジュールと経路を日常的に発現することを可能にする。
Introduction
特に、複数の機能モジュールを発現させなければならない合成生物学アプリケーションでは、複数のタンパク質の共発現がますます必要不可欠となっている。発現および機能がしばしば共発現2,3を必要とするタンパク質 - タンパク質複合体の研究において ;経路中の各遺伝子が4,5,6,7,8で発現されなければならない生合成経路を特徴づけ、利用することにある。特に宿主生物であるエシェリヒア・コリ （ Escherichia coli）において、共発現のための多くの系が開発されている。例えば、異なる選択可能なマーカーを有する複数のプラスミドを使用して、豊富な異なるexプレスベクトル10,11 。複数のタンパク質発現のための単一プラスミド系は、各遺伝子の発現を制御するために複数のプロモーターのいずれかを使用している10,12 ;複数の遺伝子が単一の転写産物にコードされている合成オペロン2,13;場合によっては、最終的にタンパク質分解処理されたポリペプチドをコードする単一の遺伝子を含み、目的の所望のタンパク質14を生じる。
図1：ポリシストロニックベクターの構築を示すpMGXワークフロー。 pMGXシステムは、誘導性T7プロモーターの制御下で合成オペロンの構築のための柔軟で使い易い戦略を提供する。e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この原稿では、誘導性T7 RNAポリメラーゼ（ 図1 ）の制御下にある多重遺伝子合成オペロンの構築のための非常に有効なシステムの使用が記載されている。このシステムは、多くの遺伝子が1つのプラスミドから同時に発現されることを可能にする。これは元々pKH22と呼ばれていたプラスミドシステムに基づいており、これは数多くのさまざまなアプリケーションでよく使用されています6,7,8。ここでは、このプラスミドセットは、4つの関連ベクター：pMGX-A、C末端タグまたはN末端タグを欠く発現ベクターおよびアンピシリン耐性マーカーを含むように拡大される。 pMGX-hisA、N末端ヘキサヒスチジンタグおよびアンピシリン耐性マーカーをコードする発現ベクター; pMGX-K、発現ベクターl任意のC末端タグまたはN末端タグとカナマイシン耐性マーカーとを接触させる工程;およびN末端ヘキサヒスチジンタグおよびカナマイシン耐性マーカーをコードする発現ベクターであるpMGX-hisK。この研究では、pMGXシステム、特にpMGX-Aを使用して5つの遺伝子を含むポリシストロニックベクターを作製する方法が、 大腸菌における個々のタンパク質の成功した産生と共に実証される。
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Protocol
1.興味のある遺伝子を得る
- 合成遺伝子を設計する。
- 大腸菌発現のための遺伝子配列を最適化する。
- 配列（AvrII、NdeI、EcoRIおよびXbaI）から問題のある制限部位を除去する。
- クローニングのための制限部位を組み込む。 5'-NdeI部位および3'-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 'または3'エンコードタグを含めます。
- 設計された遺伝子を商業的に注文する。
- 製造者の指示に従って、平滑化クローニングキットを用いて平滑化ベクターに遺伝子を平滑化する;遺伝子を増幅するためのプライマーを設計する（ステップ1.2.2に進む）。またはさらに5 'および3'末端を加えてpMGXプラスミドに直接クローニングし、ステップ2に進む。ここで、th代表的な結果は、関心のある遺伝子を無作為にクローニングすることによる。
- 所望の遺伝子を増幅する（設計および最適化された合成遺伝子または所望の遺伝子を含む鋳型DNAから） 15 。
- クローニングのための制限部位を有するプライマーを設計する; 5'-NdeI部位および3'-EcoRI部位が推奨される。必要に応じて、他のサイトも使用できます。選択したプラスミドのマルチクローニング領域を参照してください（ 図S1〜S4 ）。必要に応じて、ウェスタンブロット検出用の5 'または3'エンコードタグを含める。
- 所望の遺伝子をPCR増幅する15 。
- アガロースゲル電気泳動によるPCRの解析16 。
- 非特異的な増幅がある場合、ゲル抽出によって増幅された遺伝子を浄化する。そうでない場合は、酵素クリーンアップキットを使用してください。
- 分光光度計を使用してDNAを定量する。260nmにおけるe。溶出緩衝液を含むブランク17 。
2.マルチ遺伝子発現系ベクターpMGX 18への関心対象遺伝子のクローニング
- 制限は、得られた目的の遺伝子および所望のベクターpMGXをNdeIおよびEcoRIで消化する。
注：大量の再環状化プラスミドが得られた場合、EcoRIを添加する前にNdeI反応を1時間進行させます。- 0.5-1.5μgのDNAと1μLの各酵素と4μLの適切な10倍緩衝液を含む40μLの消化反応物を使用する。
- NdeIおよびEcoRI消化物については、EcoRI緩衝液を使用し、最初にNdeIエンドヌクレアーゼを添加する。 37℃で1時間消化する。次に、EcoRIエンドヌクレアーゼを添加し、ダイジェストをさらに1時間進行させる。 NdeIはDNAの末端近くの切断に敏感であるため、EcoRIによる初期消化はNdeIによる効果的な消化を妨げる可能性があります。
- 電気アガロースゲル上で制限消化物を発色させる（1kb遺伝子については、110Vで0.7％アガロースゲルを55分間使用する;異なる遺伝子サイズに対するアガロースゲルのパーセントを選択するには、参考文献16を参照のこと）。
- きれいなメスまたはカミソリの刃を使用して挿入バンドとベクターバンドを切り出し、切除したゲルセグメントを1.5mLチューブに入れる。
- ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを製造元のプロトコールに従って抽出する。
- 3：1インサート - ベクター比を用いて目的の遺伝子をpMGXベクターにライゲートする。インサートなしで消化したpMGXのネガティブライゲーションを設定する。
- T4 DNAリガーゼ1μL、ベクターDNA（〜5μL）0.15〜0.5μg、および3：1インサート対ベクター比に基づいて適切な量のインサートを含む20μL連結反応をセットアップし、挿入されている遺伝子; pMGXバックボーンは、5,312〜5,504bpのサイズである。すべてのbuを含むネガティブコントロール反応を含める挿入されている遺伝子。ベクターDNAの量が、陰性対照ライゲーションおよびベクタープラス挿入ライゲーション反応において同等であることを確認する。
- 連結反応をXL1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞に連結し、連結したプラスミドpMGX- yfg1 （目的遺伝子1を含む）、pMGX -yfg2 （目的遺伝子2を含む）、pMGX -yfgn （目的遺伝子nを含む）。無菌技術を使用する（バイオセーフティキャビネット内または炎の下）。
- 化学的にコンピテントなXL1-Blue E. coliの 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、ライゲーション反応液 5μLを加えます。氷上で30分間インキュベートする。
- 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。
- 細胞を37℃、220rpmで1時間振盪し、次いでプレートを100μLをLBを含有する寒天プレート上に広げる。（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含む。
- 陽性形質転換体のクローンをスクリーニングする。
- ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。 1：2より大きいコロニーカウント比が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ2.1に戻り、メモを確認します。
- スクリーニング（1 n）のために挿入された異なる遺伝子の各ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に依存する）を選択し、4 mLのLBおよび適切な抗生物質一晩培養/個々のコロニーに接種する。 37℃および220 rpmで振とうしながら一晩培養します。
- 製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。
- 150〜500ngのDNAと1μLの各酵素を含む20μLのNdeI + EcoRI消化反応を2μLの適切な10×緩衝液で設定する。第一に関心のある遺伝子が制限部位の間にあるのと同時にNdeIおよびEcoRIを添加する。空のpMGXベクターによる陰性対照が推奨される。水浴中で37℃で2時間消化する。
3.遺伝子1、pMGX -yfg1を含むpMGXベクターへの遺伝子2の挿入
- 制限は、AvrIIでpMGX- yfg1を消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（CIP）で治療する。
- 0.5-1.5μgのベクターDNA（約5-10μLの単離されたDNA）および1μLのAvrIIを含む40μLの消化反応物を、適切な10×緩衝液4μLとともに使用する。 37℃で1.5時間消化し、次いで1.5μLのCIPを添加する。 37℃でさらに30分間放置する。
- 制限酵素消化物pMGX- yfg2をAvrIIおよびXbaIで消化して目的の遺伝子を遊離させる。
- 0.5〜1.5μgのDNAと1μMのDNAを含む40μLの消化反応;各酵素のLを4μLの適切な10×緩衝液で希釈する。 37℃で2時間消化する。
- 電気泳動制限は、適切なパーセント（0.7％）のアガロースゲルで消化し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する（ステップ2.2〜2.3参照）。
- ゲル抽出キットを使用してDNAを抽出し、DNA 17を定量する。
- 3：1インサート - ベクター比を用いて、L遺伝子2をpMGX- yfg1に挿入する。追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1のネガティブライゲーションを設定する。上記の手順2.5で設定します。
- ステップ2.6で見られるように、ライゲーション反応物5μLをXL1-Blue化学的コンピテント大腸菌細胞に連結し、プラスミドpMGX -yfg1,2 （目的遺伝子1および2を含む）および陰性pMGX -yfg1コントロールに連結する。
- ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。コロニー数の比g1：2以上が望ましい。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ3.1に戻り、CIP処理を確認します。
- ライゲーション反応から4-8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種し、37℃および220 rpmで一晩増殖させます。
- 製造業者のプロトコールに従ってプラスミドDNA単離キットを用いてプラスミドDNAを単離し、DNA17を定量する。
- EcoRIでpMGX -yfg1,2の制限消化を行うことにより、第2の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。
- 150-500 ngのDNAと1μLのEcoRI酵素と2μLのEcoRI 10xバッファーを含む20μLの消化反応を使用します。 37℃で2時間消化する。
- 適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;対応するバンドを探すsを遺伝子2のサイズに合わせる（ステップ2.2参照）。遺伝子は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができる。
第1および第2遺伝子pMGX-yfg1,2を含むpMGXベクターへの第3遺伝子の付加
- 制限はAvrIIでpMGX- yfg1,2を消化し、ステップ3.1に示すようにCIPで治療する。
- ステップ3.2に見られるように、制限消化物pMGX- yfg3をAvrIIおよびXbaIで消化する。
- 適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動し、きれいなメス/カミソリの刃を用いてインサートおよびベクターバンドを切除する;手順2.2-2.3を参照してください。
- ゲル抽出キットを使用してアガロースゲルからDNAを抽出し、DNA 17を定量する。
- 3：1インサート対ベクター比を用いてL遺伝子3をpMGX- yfg1,2に挿入し、ステップ3.5に示すように、追加の挿入物なしで消化したpMGX -yfg1,2のネガティブライゲーションを設定した。
- 5μLの連結反応をXLに変換する1-Blue化学的にコンピテントな大腸菌細胞、ライゲートしたプラスミドpMGX- yfg1,2,3 （目的の遺伝子1,2および3を含む）、および陰性pMGX -yfg1,2対照（ステップ2.6参照）。
- ネガティブコントロールおよびライゲーションプレート上のコロニー数を比較する。ネガティブコントロールプレート上に多数のコロニーがある場合は、ステップ4.1に戻り、CIP処理を確認します。
- ライゲーション反応から4〜8個のコロニー（ネガティブコントロール：ライゲーション比に応じて）を選択し、個々のコロニーあたり4 mLのLBと適切な抗生物質を接種する。 37℃および220rpmで一晩増殖させる。
- プラスミドDNA単離キットを製造元のプロトコールに従って用いてプラスミドDNAを単離する。
- ステップ3.10に示すように、EcoRIでpMGX -yfg1,2,3の制限消化を行うことにより、第3の遺伝子の有効な挿入をスクリーニングする。
- 適切な％アガロースゲル上で制限消化物を電気泳動する;見える遺伝子2および遺伝子3のサイズに対応するバンドについては（ステップ2.2参照）。注：遺伝子3は、望ましくない逆向きのベクターに挿入することができます。遺伝子2および3が同じサイズである場合、スクリーニングのために別の適切な制限消化部位を選択しなければならない。
注：新しい遺伝子ごとに必要に応じて繰り返します。
5.マルチ遺伝子発現系を用いた目的タンパク質の産生およびウエスタンブロッティングによる産生の評価
- 関心のある全ての遺伝子を含む陽性クローンを、BL21-（λDE3）のような化学的コンピテントなタンパク質生産大腸菌に形質転換する。
- 化学的にコンピテントなBL21-（λDE3） 大腸菌の 100μLアリコートを氷上で5分間解凍し、次いで陽性クローン化プラスミドDNA1μLを加える;氷上で30分間インキュベートする。
- 42℃に保たれた水浴中で細胞を45秒間熱ショックし、次いで200μLの冷LBを加える。氷上で2分間インキュベートする。
- 細胞を37°Cおよび220 rpmで1時間振とうし、プレート100μLを適切な選択マーカー（アンピシリンまたはカナマイシンのいずれか）を含むLB-寒天プレートに塗布する。
- イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）誘導によりタンパク質を発現させる。
- B21-（λDE3）形質転換プレートから単離されたコロニーを選択し、適切な抗生物質を加えた4mLのLBに接種する。一晩増殖し、37℃および220rpmで振とうする。
- 1mLの一晩培養液を使用して、100mLのLBに適切な抗生物質培養物を加えて接種する。
- OD 600が0.6になるまで220 rpmで振盪しながら37℃で増殖させる。
- 100μMIPTGで培養物を誘導し、25℃および220rpmで15時間増殖させる。
- 1 mLの培養液を取り除き、13,000 xgで1分間遠心してください。上清を捨てる。
- 製造元の指示に従って溶解液を用いて細胞を溶解する可溶性細胞ライセートのウエスタンブロットを行い、すべてのタンパク質がうまく産生されたかどうかを調べる19 。
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Representative Results
この研究では、目的は単一のプラスミドから5つのタンパク質を同時発現させることであった。 N-またはC-末端ヘキサヒスチジンタグのいずれかをコードする5コドン最適化合成遺伝子断片を商業的に購入した。合成遺伝子をPCRによって増幅し、個々にPCR-平滑ベクターにクローニングし、配列決定した。ポリシストロニックプラスミドを作製するために、目的の5つの遺伝子を最初に適当なpMGXプラスミドpMGX-Aにクローニングした。 図2は、NdeI + EcoRIで消化したpMGX-Aに加えてPCRBlunt- yfg1およびPCRBlunt- yfg2を示す（ステップ2参照）。最初の2つの遺伝子をpMGX-Aにクローニングするために、プラスミドをNdeI + EcoRIで消化した（ 図2 ）。目的の遺伝子をpMGX-Aにクローニングすると、pMGX- yfg1およびpMGX - yfg2と命名された新しく構築されたプラスミドをAvrII + XbaIで消化し、成功したクローンが得られたことを確認した。図3で得られた1.1kbおよび1.3kbのバンドに示されている。
図2：pMGXプラスミドのクローニング。 NdeI + EcoRIで消化した後のyfg1およびyfg2を含むPCR-ブラントプラスミドの期待される結果は、0.7％アガロースゲル（110V、55分）上に示される。レーン1,1kb DNAラダー;レーン2、PCRBlunt- yfg1 ;レーン3、PCRBlunt- yfg2 ;レーン4、pMGX-A対照。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：pMGX -yfg1およびpMGX - yfg2のスクリーニング。 0.7％アガロースゲル（110V、55分）は、 AvrII + XbaIで消化した後のpMGX -yfg1およびpMGX -yfg2の両方によって生成される2つのバンド。レーン1、1kbのDNAラダー;レーン2、pMGX- yfg1 ;レーン3、pMGX- yfg2 ;レーン4、pMGX-A対照。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
適切なpMGXベクター中の両方の遺伝子を用いて、ポリシストロニックプラスミドを構築した。プラスミドpMGX- yfg1,2を生成するために、 図4に示すように、pMGX- yfg1をAvrIIで消化した。 pMGX- yfg2をAvrII + XbaIで消化し、その断片を含む1.3kbの遺伝子を線状化pMGX -yfg1の AvrII部位に連結し、pMGX -yfg1,2を生成した。 EcoRIによるpMGX - yfg1,2の消化により、所望のプラスミドのクローニングが成功したことが確認され、>図5。
図4：バイシストロン性プラスミドpMGX - yfg1,2の生成。 AvrIIで消化したpMGX -yfg1およびAvrII + XbaIで消化したpMGX -yfg2の0.7％アガロースゲル電気泳動結果（110V、55分）。レーン1、1kbのDNAラダー;レーン2、AvrIIで消化したpMGX- yfg1 ;レーン3、AvrII + XbaIで消化したpMGX- yfg2 ;レーン4、pMGX-A対照。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5：pMGX -yfg1,2クローンのスクリーニング。得られた0.7％アガロースゲル（110V、55分）のpMGX-yfEcoRIで消化したg1,2クローンを示す。成功したクローンは、挿入された遺伝子yfg2およびバックボーン+ yfg1 （ pMGX-yfg1 ）に対応する他方の2つのバンドを生成する。レーン1,1kb DNAラダー;レーン2、EcoRIで消化したpMGX- yfg1,2 、クローン1;レーン3、EcoRIで消化したpMGX- yfg1,2 、クローン2;レーン4、pMGX-A対照。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
2つ以上の遺伝子を含むポリシストロニックプラスミドを作製する場合、AvrII部位にクローニングされた遺伝子の望ましくない逆方向挿入に遭遇することがある。 図6は、逆向きに挿入された遺伝子とは対照的に、正しい向きで挿入された遺伝子を有する消化されたプラスミドの結果間の差を強調するゲルである。遺伝子が連結され、望ましくない向きでクローニングされた場合、遺伝子の末端のEcoRI部位は、前の遺伝子のEcoRI部位のすぐ隣に挿入される。これは、DNAゲル電気泳動（50bp未満）によって事実上検出されない断片サイズを生じるであろう。さらに、最後に挿入された遺伝子は、バックボーンに現れるであろう。これは、予想よりも大きなバックボーンサイズのために容易に同定される。期待されるサイズからの骨格のサイズの差は、最後に挿入された遺伝子のサイズを示す。
図6：pMGX -yfg1-5クローンのスクリーニング。 EcoRIで消化したpMGX -yfg1-5の結果を示す1.3％アガロースゲル（110V、65分）を示す。成功したクローン（レーン2）は、最後に挿入された遺伝子（この場合、 yfg5、1.1kb）に対応するバンドを生成する。 Lane 1,1Kb DNAラダー;レーン2、EcoRI で消化したpMGX -yfg1-5の陽性クローン;レーン3、EcoRI で消化したpMGX -yfg1-5のネガティブクローン;レーン4、pMGX- yfg1-4対照。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
5遺伝子のポリシストロニック発現ベクターを完成させるために、残りの3つの遺伝子をpMGX -yfg1,2に順次クローニングしてpMGX -yfg1-5を作製した（ステップ5参照）。次いで、このプラスミドをBL21-（λDE3）に形質転換し、タンパク質の発現をIPTGの添加により中間対数期培養において誘導した。 図7は、細胞溶解物のウエスタンブロットであり、単一のオペロンに複数の遺伝子を含む単一のプラスミド由来の5つのタンパク質すべてを発現させることができることを確認している。 pMGX- yfg1 （1遺伝子を含む）、2遺伝子を含むpMGX- yfg1,2 、および5遺伝子を含むpMGX -yfg1-5を示す。
図7：pMGX系を用いた多遺伝子発現のウエスタンブロット分析。 N末端またはC末端ヘキサヒスチジンタグのいずれかの取り込みは、タンパク質発現のウェスタンブロット検出を可能にした。試料を、プレキャスト4〜20％勾配無歪みアクリルアミドゲル（200V、35分、10cm×8.5cm）で分離し、次いでニトロセルロース膜（0.45μm、 10cm×7cm）を行った。二次抗体を必要としないHRP結合抗His-Hisモノクローナル抗体を用いた。ブロッキング、トランスファーおよび抗体希釈緩衝液は、抗体製造業者の推奨に従って調製した。検出は、製造者の指示に従ってWestern Chemiluminescent HRP基質を用いて行った戒厳令得られた膜を、フィルタなしのイメージャを用いて視覚化した。レーン1、膜上に転写された2色標準（化学発光ではない）。レーン2、His6pMGX- yfg1 ;レーン3、His6pMGX- yfg1,2 ;レーン4、His6pMGX- yfg1-5。注： yfg5によって産生されるタンパク質は、 yfg1によって産生されるタンパク質と同じサイズであり（両方とも36kDaである）、ゲル上で分離することはできない。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
特に複雑な多遺伝子代謝経路の特徴付けおよび再構築には、複数の遺伝子の同時発現がますます必要不可欠となっている3,4,5 。 pMGXシステムは、 大腸菌ルーチン6,7,8で多遺伝子同時発現を行い、多様な研究者にアクセス可能である。この研究では、目的の5つのタンパク質が、pMGX-Aを用いて単一のプラスミドシステムから同時に生成されることが示された。現在利用可能な多くの同時発現系は、pET Duetベクター12のようなバイシストロン性プラスミドを生成する2つの遺伝子の挿入のみを可能にする。より多くの遺伝子の添加を必要とする場合、異なる選択マーカーを有する複数のバイシストトロニックベクターが必要とされる。他のマルチ遺伝子発現系とは対照的に、pMGX系は容易なクローニングを可能にする異なるドナープラスミドを必要とせずに制限部位を再利用する能力を有するか、遺伝子から複数の制限酵素部位を除去する能力を有する13,14 。このプロトコールの重要なステップには、遺伝子設計、単離されたpMGXベクターのバックグラウンド再循環の防止、および挿入された遺伝子の正確な配向のためのポリシストロニックベクターのスクリーニングが含まれる。
ポリシストロニックシステムを構築するためのクローニング戦略を計画するには、目的の遺伝子が下流クローニングに必要な制限部位を含まないことを確実にすることが不可欠である。特に、これらは、第2のおよびその後の遺伝子の第1の目的遺伝子を含むpMGXベクターへの挿入に必要なXbaIおよびAvrIIを含む（工程3および4）。さらに、gの最初のクローニングに使用される制限部位を除去することが不可欠であるpMGXに関心のある遺伝子（ステップ2）。典型的には、遺伝子の5 '末端にNdeIまたはNheI、遺伝子の3'末端にBamHIまたはEcoRIが含まれるが、必要に応じてこのステップには他の制限部位を使用することもできる。余分な不要な制限部位の除去は、遺伝子合成段階で、または他の供給源からクローン化された遺伝子の場合、部位特異的突然変異誘発を介して同義のヌクレオチド置換によって容易に行うことができる20 。
関心対象の第1の遺伝子を含むpMGXへの関心のある後続の遺伝子の付加は、AvrIIでのpMGX -yfg1の線状化を必要とする（ステップ3.1; XbaIで線状化することもできる）。この直線化されたベクターは、目的の第2の遺伝子（ステップ3.5）の挿入中に迅速に再結合し、極めて多数のバックグラウンドクローンをもたらす。これを避けるためには、線状化したベクターをホスファターゼで処理して、リン酸化酵素を脱リン酸化することが不可欠である2;線形化されたベクトルの端。通常、CIPが使用されますが、他のものも利用可能です。フォスファターゼ単位およびインキュベーション時間の両方の最適化は、後続の関心対象の遺伝子の線状化ベクターへの連結を最適化するために必要であり得る。
最後に、ポリシストロニックシステムを作製する場合、目的の遺伝子をXbaIおよびAvrIIで消化し、遺伝子の5 'および3'末端に相補的な凝集末端を生成させることにより最初に切り出す（ステップ3.2および4.2）。このインサートは、順方向または逆方向の線形化ベクターに連結することができる。すべての粘着末端が同一であるため、粘着末端の相補的なアニーリングによって指向性が強制されない。したがって、関心のある遺伝子の正確な挿入方向について得られたクローンをスクリーニングすることが必要である。これは、目的の元の遺伝子をpMGXにクローン化するために使用した制限部位の1つを用いてクローンをスクリーニングすることによって容易に行うことができる（ステップ2）。典型的には、制限部位は遺伝子の3 '末端にあるので、EcoRIを使用するので、 図6に示すように方向性をスクリーニングすることが適切である。ほとんどの場合、目的の遺伝子を含むクローンの50％が正しい向きの遺伝子を有し、50％が反対の向きの遺伝子を有する。
まれに（ライゲーションの約10％）、特定のライゲーションに由来するすべてのクローンは、目的の遺伝子を一方向にのみ挿入することができる。この結果は、これらの特定の場合において再現性が高いので、配列依存性であると思われる。これが起こり、目的の遺伝子が逆方向に連続して挿入されている場合、通常、クローニングの方向を切り替えることによって所望のベクターにアクセスすることができる。例えば、 yfg2をpMGX -yfg1の AvrII部位にクローニングする代わりに、 yfg1をpMGX -yfg2のXbaI部位にクローニングすることができる。これは、同じ最終ベクトルを与えることに注意してくださいシステム。異なるクローニング戦略から同じシステムへのアクセスを可能にするこの柔軟性が非常に有利である。
この方法論の重要な限界は、ポリシストロニック転写産物の3 '末端にコードされるタンパク質が典型的に転写産物の5'末端にコードされるタンパク質よりも低いレベルで発現され、この効果は転写産物がより長いほど顕著であるということである。これは、合成オペロン中の目的の遺伝子の順序を変えることは、それらがコードするタンパク質の相対発現レベルに影響を与え、相対発現レベルを微調整するためのメカニズムを提供することを意味する。
まとめると、pMGXシステムは、 大腸菌内の単一プラスミドからの複数のタンパク質の同時発現のための信頼できる方法を提供し、これは様々な合成生物学的用途および生化学的経路特徴付けに使用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、カナダの自然科学および工学研究評議会によって支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
