Introduction
Die zunehmende Bedeutung der Kernspintomographie (MRI) in der klinischen Diagnose, die durch die inhärente Empfindlichkeit der Technik begrenzt ist, hat in dem schnellen Wachstum der Forschung in die Entwicklung von neuartigen Gadolinium-Kontrastmitteln (GBCAs) 1 geführt. GBCAs sind Moleküle , die verabreicht werden , um die Bildqualität zu verbessern, und sie haben typischerweise die chemische Struktur eines dreiwertigen Gadolinium - Ion (Gd 3+) zu einem mehrzähnigen Liganden koordiniert. Diese Komplexbildung ist von entscheidender Bedeutung , da unchelatisierten Gd 3+ ist giftig; es wurde bereits 2 in der Entwicklung von nephrogener systemische Fibrose bei einigen Patienten mit Nierenerkrankung oder Versagen gebracht. Folglich wird die wäßrige freie Ionen Erfassungs dazu bei, die Sicherheit der GBCAs gewährleisten. Die Anwesenheit von unchelatisierten Gd 3+ in GBCA Lösungen ist oft das Ergebnis einer unvollständigen Reaktion zwischen dem Liganden und dem Ion, Dissoziation des Komplexes oder displacement durch andere biologische Metallkationen 3.
Unter den verschiedenen Techniken , die derzeit zur Bestimmung der Anwesenheit von Gd 3+, diejenigen , die sich auf Chromatographie und / oder Spektrometrie Rang höchsten in Bezug auf Vielseitigkeit und Anwendbarkeit 4. Unter ihren Stärken sind eine hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, die Fähigkeit , verschiedene Matrices (einschließlich humanem Serum 5, Urin und Haar 6, Abwasser 7 und Kontrastmittelformulierungen 8) und die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Gd 3+ Komplexe (eine Auflistung zu analysieren vor dem Jahr 2013 von Studien in einer umfassenden Überprüfung von Telgmann et al.) 4. Der einzige Nachteil ist , dass mehrere dieser Verfahren erfordern Instrumentierungen (wie induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie) 4 , dass einige Laboratorien haben möglicherweise keinen Zugriff auf. Im Rahmen der neuen GBCA Entdeckung an der Forschung und Proof-of-Concept-Ebenen, arelatively bequemer, schneller und kostengünstiger spektroskopischen-basierte Verfahren (wie UV-Vis-Absorption oder Fluoreszenz) kann als eine wertvolle Alternative dienen. Mit diesen Anwendungen im Blick, ein fluoreszierendes Aptamer-basierten Sensor für wässrige Gd 3+ wurde 9 entwickelt.
Das Aptamer (Gd-Aptamer) ist ein 44-Basen langen einzelsträngigen DNA - Moleküls mit einer bestimmten Sequenz von Basen , die durch den Prozess der systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) 9 isoliert. Um das Aptamer in einen Fluoreszenzsensor anzupassen, ein Fluorophor an das 5' - Ende des Stranges befestigt sind , die dann mit einem Quenching Strang (QS) über 13 komplementären Basen (Abbildung 1) hybridisiert ist. Der QS ist mit einem dunklen Quencher-Molekül am 3'-Terminus markiert. In der Abwesenheit von Gd 3+, dem Sensor (Gd-Sensor), einer 1 umfasste: 2 - Molverhältnis von Gd-Aptamer und QS bzw. haben, minimale Fluoreszenzemission aufgrund to Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem Quencher. Die Zugabe von wässrigem Gd 3+ das QS vom Gd-Aptamer, was zu einem Anstieg in der Fluoreszenzemission verdrängen.
Abbildung 1. Der Sensor (Gd-Sensor), der mit Fluorescein (ein Fluorophor) und dem langen Lösch Strang (QS) getaggt mit Dabcyl (ein dunkler Löscher) 13-Basis (Gd-Aptamer) markiert 44-base lange Aptamer besteht . In Abwesenheit von unchelatisierten Gd 3+, die Fluoreszenz des Sensors ist minimal. Mit Zugabe von Gd 3+, Verschiebung des QS auftritt und eine Erhöhung der Fluoreszenzemission beobachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Es ist derzeit, eine häufig verwendete spektroskopische basiertes Verfahren zur Erkennunging wässrigen Gd 3+. Dieser Assay verwendet das Molekül Xylenolorange, die 433 bis 573 nm auf Chelatisierung an die Ionen 10 eine Verschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge unterzogen wird . Das Verhältnis dieser zwei Absorptionsmaxima können verwendet werden , um die Menge des unchelatisierten Gd 3+ zu quantifizieren. Das Aptamer Sensor ist eine Alternative (kann auch komplementär sein) an den Xylenolorange-Test, als die beiden Verfahren unterschiedliche Reaktionsbedingungen (wie beispielsweise pH und der Zusammensetzung der Pufferlösungen verwendet wird) haben, Ziel Selektivitäten, linearen Bereichen der Quantifizierung und Erfassungsmodalitäten 9.
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Protocol
HINWEIS: die Molekularbiologie Wasser wird in allen Puffer und Lösungs-Präparate eingesetzt. Alle Einweg-Röhrchen (Mikro und PCR) und Pipettenspitzen sind DNase- und RNase-frei. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für alle Chemikalien vor der Verwendung. Einsatz einer persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wird dringend empfohlen.
1. Herstellung der Stammlösungen Aptamer
- kommerziell Kauf 2 Stränge von Polydesoxynukleotid-. Um beide Stränge mit Reinigung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
Strand 1 (Gd-Aptamer):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Strand 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Man löst jeder Strang in Wasser auf 100 & mgr; M einzelnen Stammlösungen des Gd-Aptamer und dem QS machen.
- Bewahren Sie diese Lösungen bei -20 ° C. Die Lösungen sind stabil bisher, für 3 Jahre.
- Zur Minimierung der freeze-Auftau-Zyklen, speichern Sie die Stammlösungen in 10 & mgr; l-Aliquots.
2. Herstellung des 2x Gd-Sensorlösung
- Vorbereitung der Testpuffer (20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Stellen Sie den pH-Wert auf ~ 7,4 mit NaOH und HCl, und filtriert durch sterile Einwegflasche Top-Filter mit 0,2 um PES-Membran. Lagern Sie in sterile Flaschen. Wenn filtriert und richtig gespeichert (bei Raumtemperatur), ist der Puffer bisher stabil, für 2 Jahre.
- Verdünnen Sie 1 ul des Gd-Aptamer-Stammlösung (aus Schritt 1.2) und 2 ul der QS-Stammlösung (aus Schritt 1.2) in 497 & mgr; l Testpuffer. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Ihre Konzentrationen in der 2x Gd-Sensorlösung werden 200 nM und 400 nM.
HINWEIS: Das Volumen des 2x Gd-Sensorlösung in diesem Schritt hergestellt wird , ist 500 & mgr; L, der 6 zu testen ausreicht - 7 verschiedene Konzentrationen von Gd 3+ für die Kalibrierungskurve und der Kontrastmittel - Lösungen(Schritt 3). Jede Probe geben Dublikatmulden in einer 384-Well-Platte.- Stellen Sie die Lautstärke des 2x Gd-Sensorlösung entsprechend der Anzahl von Gd 3+ Lösungen , die getestet werden muss.
- Übertragen Sie die 2x Gd-Sensorlösung in 9 PCR-Röhrchen, mit 50 & mgr; l in jedes Röhrchen. Die Röhrchen in einen Thermocycler.
- Stellen Sie das Programm in den Thermocycler die Lösung in den Rohren bis 95 ° C zu erhitzen, Halten für 5 min und dann langsam abkühlen, die Lösungen auf 25 ° C über ca. 15 min (mit einer Rate von ~ 0,05-0,1 ° C / s). Die Heiz- und Kühlkreislauf ist eine optimale Hybridisierung zwischen dem Gd-Aptamer und dem QS zu gewährleisten. Teilhybridisierungsergebnisse in unvollständigem Abschrecken und eine höhere Hintergrundfluoreszenz des Sensors. Wenn ein Thermocycler nicht verfügbar ist, führen Sie diesen Prozess stattdessen ein heißes Wasserbad.
- Nach dem Abkühlen auf 25 ° C, verwenden Sie sofort die Lösung, oder halten Sie in den Thermocycler (bis ca. 2 h), bis sie bereit zu seinbenutzt. Wenn ein Wasserbad für die Heizung verwendet wird, lassen Sie die Rohre im Bad, da das Wasser kühlt langsam auf Raumtemperatur.
3. Konstruieren der Fluoreszenz - Kalibrierungskurve und Nachweis der Anwesenheit von unchelatisierte Gd 3+ in einer Lösung von Gd Kontrastmittel
- Man löst GdCl 3 Feststoff in dem Testpuffer (den gleichen Puffer , wie in Schritt 2.1).
- Durch Reihenverdünnung, Herstellung von 100 & mgr; l von jeweils 6 verschiedenen Gd 3+ Lösungen in Mikrozentrifugenröhrchen bei Doppel der endgültigen gewünschten Konzentrationen für die Eichkurve (2x Lösungen).
- Um zum Beispiel eine Kalibrierung für 0 (nur Puffer ohne GdCl 3) zu konstruieren, 50, 100, 200, 400 und 800 nM von Gd 3+, werden die Lösungen , die 0, 100, 200, 400, 800 und 1600 nM des Ions. Achten Sie darauf, immer auch die 'blank' mit 0 nM Gd 3+ als negative Kontrolle.
- Man löst das Kontrastmittel-Test zu seinin dem Assaypuffer ed. Bereiten 2 oder 3 verschiedenen Konzentrationen der Kontrastmittel-Lösungen über serielle Verdünnung.
HINWEIS: Test 3 verschiedenen Konzentrationen des Kontrastmittellösung empfohlen. Damit soll sichergestellt werden, dass diese Konzentrationen im linearen Bereich liegen. Wenn die getesteten Proben keine lineare Beziehung anzuzeigen, verwendet, um die Konzentrationen des Kontrastmittels verringern. - Nehmen Sie die PCR-Röhrchen, die 2x Gd-Sensor-Lösung aus Schritt 2.5 aus dem Thermocycler enthält.
- In 50 ul jeder Gd 3+ Lösung aus Schritt 3.2 in 6 der 9 PCR - Röhrchen , die 2x Gd-Sensorlösung enthält. Mischen durch Pipettieren von oben und unten. Jedes PCR - Röhrchen enthält nun die gewünschte Konzentration von Gd 3+ getestet werden, 100 nM Gd-Aptamer und 200 nM QS.
- Zu der verbleibenden PCR-Röhrchen die 2x Gd-Sensorlösung enthält, werden 50 ul der Kontrastmittel-Lösungen aus Schritt 3.3. Gut mischen durch Pipettieren nach oben und unten ein paar Mal.
- Inkubieren Sie die solutions in den PCR-Röhrchen ca. 5 min bei Raumtemperatur. Sie können bis zu 30 Minuten stehen gelassen werden.
- Übertragen Sie 45 ul jeder Röhre in eine 384-Well-Platte. Jedes PCR-Röhrchen geben Dublikatmulden.
- Notieren Sie sich die Fluoreszenz von jeder Vertiefung auf einem Plattenleser. Das Fluorophor (FAM), die in dem Gd-Sensor-Design hat Anregungs- und Emissionsmaxima von 495 und 520 nm sind, wie auf der Website des Herstellers aufgeführt. Wählen geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen oder Filter abhängig davon, ob der Plattenleser ist monochromator- oder Filterbasis.
- Zeichnen Sie die graphische Darstellung der Fluoreszenz in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) gegen die Konzentration von Gd 3+.
- Zeichnen Sie die Grafik als Fluoreszenz - fache Veränderung gegen die Konzentration von Gd 3+. Berechnen Sie die Fluoreszenz - fache Veränderung durch das AFU jeder Konzentration durch das AFU des 'leeren' Lösung Teilen (mit 0 nM von Gd 3+). Die Fluoreszenz-fache Änderung wird für die n erlaubenormalization der Ergebnisse sollte die AFU Display einige periodische (verschiedene Tage, etc.) Variationen.
- Vergleichen der Fluoreszenzemission der Lösung des Kontrastmittels und die "leere" enthalten, die die Lösung ist , die 0 nM GdCl 3 (nur Puffer).
HINWEIS: Eine höhere Fluoreszenz der GBCA Lösung impliziert die Anwesenheit von unchelatisierten Gd 3+, die weitere Reinigung des Kontrastmittels erforderlich machen kann. Die Menge an unchelatisierte Gd 3+ vorhanden kann in Schritt 3.10 oder 3.11 konstruiert unter Verwendung der Eichkurve abgeschätzt werden.
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Representative Results
Eine typische Fluoreszenzänderung des Gd-Sensorlösung in Gegenwart von unchelatisierten Gd 3+ ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Emission kann als die Fluoreszenz - fache Veränderung (2A) oder die rohe Fluoreszenzablesen (2B) in willkürlichen Einheiten aufgetragen werden (AFU). Beide Diagramme ergeben sehr ähnliche Eichkurven mit einem linearen Bereich für die Konzentration von Gd 3+ unter 1 & mgr; M und der Sättigung des Signals bei> 3 uM. Die Nachweisgrenze liegt bei ~ 100 nM mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 3.
In Lösungen , die GBCA von Interesse, das Vorliegen von unchelatisierten Gd 3+ enthält, in einen Fluoreszenzanstieg des Sensors verglichen werden übersetzt in die "leere" Lösung. Die Fluoreszenzänderungen in Lösungen von 2 verschiedenen Chargen von Gd-DOTA-Komplex, ein höherer Reinheit als das andere, sind Shown als Beispiele für repräsentative Ergebnisse (Figur 3). Gd-DOTA (Gadotersäure) ist ein Gadolinium - Komplex von Gd 3+ von einem organischen Liganden DOTA umgeben , die in einem kommerziellen Kontrastmittel gefunden wird. Die Charge von höherer Reinheit nicht einen signifikanten Anstieg der Emission von bis zu 20 mM Gd-DOTA anzuzeigen. Wenn unchelatisierte Gd 3+ vorhanden ist, dass eine Änderung auch bei Gd-DOTA - Konzentrationen unter 5 mM bemerkbar beobachtet. In diesem Beispiel , wo die Datenpunkte sind als Fluoreszenz fache Änderung des Sensors, Quantifizierung der Menge des unchelatisierten Gd 3+ aufgetragen unter Verwendung der Kalibrierungskurve in 2A werden geschätzt.
Abbildung 2. Repräsentative Gd-Sensor Fluoreszenzeichkurve Plots. Alle Datenpunkte wurden zumindest in Duplikaten durchgeführt und die Mittelwerte Grundstückted mit Standardabweichung als die Fehlerbalken. (A) Eine Kalibrierungskurve , erhalten unter Verwendung von 100 nM Gd-Aptamer und 200 nM QS. Der Graph ist mit Fluoreszenz fold change als y-Achse aufgetragen. (B) Das gleiche Kalibrierungskurve , wie in (A) mit rohen Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten (AFU) als die y - Achse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Gd-Sensor Fluoreszenzänderung , wenn in Proben von Gd-DOTA - Molekül , das Vorhandensein von unchelatisierte Gd 3+ zu testen. Zwei verschiedene Chargen von Gd-DOTA komplexe Lösungen sind in diesem Diagramm gezeigt, ein höherer Reinheit (Kreis Marker) und die andere enthält unchelatisierte Gd 3+ (blau Triangle-Marker). Jeder Datenpunkt ist ein Durchschnitt von zwei Messungen mit einer Standardabweichung als die Fehlerbalken. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Verwendung der Aptamer-basierten Gd-Sensor, ein Anstieg in der Fluoreszenzemission , die auf die Konzentration des unchelatisierten Gd 3+ proportional ist beobachtet wird . Um die Menge der Probe zu minimieren verwendet wird, kann der Test in einem 384-Well-Mikroplatten mit einer Gesamtprobenvolumen von 45 & mgr; l pro Vertiefung ausgeführt werden. In dieser Konstruktion ist die Wahl von Fluorescein (FAM) und DABCYL (Dab) wurde auf die Kosten der Reagenzien basieren in erster Linie; die Emissionswellenlänge, eine andere Paarung von Fluorophor zu modifizieren und Quencher 11 kann verwendet werden.
Es ist wichtig zu beachten, dass das beste Ergebnis mit dem Sensor zu erhalten, einer der kritischen Schritte das Erhitzen auf 95 ° C und langsames Abkühlen (Schritt 2.4) in Testpuffer optimale Hybridisierung zwischen der Gd-Aptamer und dem QS zu erreichen Stränge. Wie zuvor in dem Protokoll erwähnt, wenn ein Thermocycler nicht verfügbar ist, kann die Inkubation bei 95 ° C in einem Wasserbad durchgeführt. Ein weiterer wichtiger Parameter zur Steuerung ist ter Zusammensetzungen der Pufferlösungen; die Verwendung des Assay-Puffer in Schritt 2.1 aufgeführten das Kontrastmittel zu lösen wird empfohlen, oder entionisierten Wasser können ebenfalls verwendet werden. Jedoch Lösungen, die potentielle Störsubstanzen enthalten, sollten vermieden werden. Ein Beispiel eines solchen Puffers ist eine , die Phosphat - Anionen enthält, die unchelatisierten Gd 3+ koordinieren kann unlösliches Gadoliniumphosphatprodukts 12 zu bilden. Der Niederschlag wird nicht mit dem Sensor reagieren, was zu einem falschen negativen Ergebnis.
Einige Schritte in den Versuchen kann ohne Beeinträchtigung der Ergebnisse geändert werden. Zunächst wird der Test und die Berechnung zu vereinfachen, bereiten sowohl die Gd-Sensorlösung und die wässrige GdCl 3 für die Eichkurve bei 2x Konzentrationen. Falls gewünscht, können auch andere Verdünnungsfaktoren (zB 10x Lösungen) verwendet werden, vorausgesetzt, daß die endgültigen Testkonzentrationen des Gd-Aptamer und QS werden bei 100 nM und 200 nM gehalten, respectively. Zweitens d AssaypufferOES müssen nicht genau pH 7,4 sein. Jeder Wert zwischen 7-7,4 die gewünschte Fluoreszenzanstieg erzeugen, solange der gleiche Puffer während des gesamten Versuchs verwendet wird. Drittens, sobald die Fluoreszenzemissionslese erhalten wird, können die Datenpunkte aufgetragen werden, entweder als rohe Fluoreszenz in willkürlichen Einheit (AFU) oder als Fluoreszenz-fold change. Zur Berechnung der Fluoreszenz - fache Veränderung, die rohe Fluoreszenzmesswert jeder Konzentration normalisiert (geteilt durch) das Lesen der negativen Kontrolle (0 nM Gd 3+). Wie in den 2A und B gezeigt, sind die Fluoreszenzemission Trends in beiden Plots fast identisch. Die Falte Änderung kann ein bequemer Weg, um die Daten zu analysieren, wenn die Plattenleser einige Variationen in den rohen Messwerte zeigt zu verschiedenen Zeiten aufgezeichnet. Schließlich, wenn das Labor mit einem Fluorometer ausgestattet ist, aber nicht einem Plattenlesegerät kann jeder Datenpunkt gemessen werden, um eine Küvette, wobei anstelle einer Mikroplatte. Je nach Größe of den verfügbaren Küvetten müssen die Volumina der Lösungen in den Assay hergestellt wird, kann eingestellt werden.
Das Verfahren berichtet bietet hier eine Alternative zu chromatographic- und / oder spektrometrischen-basierte Techniken für wässrige Gd 3+ zu erkennen. Im Vergleich zu der letzteren ist der Gd-Sensor Assay begrenzteren hinsichtlich der Empfindlichkeit, Genauigkeit und die Fähigkeit zur gleichzeitigen Detektion von mehreren Arten. Auf der anderen Seite, die spektroskopische basierten Sensor erfordert eine Instrumentierung, die möglicherweise leicht verfügbar sein kann, kann innerhalb einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden, und die Probenvorbereitung ist minimal. Das Kontrastmittel kann einfach in der Pufferlösung gelöst werden, mit der Lösung Gd-Sensor gemischt und die Fluoreszenzemission direkt gemessen. Darüber hinaus ist der Sensor in der Lage eine viel geringere Konzentration von unchelatisierten Gd 3+ zu erfassen als die Xylenolorange Indikator (etwa 2 Grßenordnungen Unterschied zwischen den beiden Verfahren) und hat einehöhere Selektivität für Gd 3+ über 9 verschiedene andere biologisch wichtige und Übergangsmetallionen.
Es gibt zwei Nachteile dieses Assays, die seine Verwendung unter bestimmten Versuchsbedingungen beschränken. Eine Einschränkung ist , dass der Sensor nicht spezifisch für Gd 3+ ist; es wird eine Reaktion auf andere Lanthanid - Ionen (wie Eu 3+ und Tb 3+) 9. Diese sind jedoch nicht Ionen üblicherweise in Kontrastmittel bzw. die biologischen Systemen zu finden und daher ihre Interferenz sind minimal. Der zweite Punkt ist zu beachten , dass bei höheren Konzentrationen (über ~ 10 & mgr; M) von Gd 3+, eine graduelle Abnahme der Fluoreszenzemission Gd-Sensor beobachtet wird. Die Wirkung des Abschreckens von Lanthanid - Ionen ist ein gut dokumentiertes Phänomen 13 , die als eine Technik , die verwendet wurde zum Nachweis und zur Quantifizierung von ihnen 14 ebenfalls worden. Während dies begrenzt den Nutzen des Sensors für hohe Konzentrationen von Gd 3+ Mess
In dieser Arbeit wurde die Verwendung einer geeigneten Fluoreszenz-basierte Technik zur Detektion toxischer unchelatisierten Gd 3+ in wässriger Lösung beschrieben. Dieser Test ist für die Frühphasen - Auswertung von Gadolinium-Kontrastmittels Reinheit gemeint, speziell während der Synthese und Formulierung für die in - vitro - Experimenten. Mit dem aktuellen Zuwachs von Magnetresonanztomographie in der Diagnostik, werden immer mehr neuen Kontrastmittel kontinuierlich entwickelt und getestet. Das Aptamer-basierten Gd-Sensor wird diese Entwicklung zu erleichtern , indem ein Mittel zur schnellen Bereitstellung der Gegenwart von sub-mikromolaren Konzentrationen an nicht umgesetzten oder dissoziiert Gd 3+ in wässriger Lösung bei Umgebungs pH detektieren. Da ferner der Sensor Kreuzreaktivität mit anderen dreiwertigen Lanthaniden-Ionen zeigt, kann seine Anwendung seinauf diese Bereiche der Forschung erweitert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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