Introduction
기술의 고유의 감도에 의해 제한된다 임상 진단에서 자기 공명 영상 (MRI)의 중요성이 증가는 신규 가돌리늄 계 조영제 (GBCAs 1)의 개발에 대한 연구의 빠른 성장을 가져왔다. GBCAs은 이미지 품질을 개선하기 위해 투여되는 분자이며, 그들은 일반적으로 여러 자리 리간드에 배위 3가 가돌리늄 이온 (하나님 3+)의 화학 구조를 갖는다. 이 복합체는 독성 3+ unchelated 하나님으로 매우 중요합니다; 이는 신장 질환 또는 장애이 일부 환자에서 신원 성 전신 섬유증의 발병과 연관되어있다. 따라서, 수성 자유 이온을 검출하는 GBCAs의 안전을 확보하는 수단이있다. GBCA 솔루션 unchelated 하나님 3+의 존재는 종종 리간드 및 이온 복합체의 해리 또는 displacemen 간의 불완전한 반응의 결과다른 생물학적 금속 양이온 (3)에 의한 t.
현재 하나님 3+, 융통성 및 적응성 (4)의 측면에서 크로마토 그래피 및 / 또는 분광 최고 순위를 의존들의 존재를 결정하기 위해 사용하는 여러 기술 중. 강점 중 높은 감도 및 정확도 (리스트를, 복수 하나님 3+ 복합체의 동시 정량 (인간 혈청 5 소변 헤어 6 폐수 7 및 조영제 제제 8 등) 다양한 시료 매트릭스를 분석하는 능력이다 연구의 2013 년 이전은 Telgmann 등.) (4)에 의해 종합적인 검토에 설명되어 있습니다. 유일한 단점은 이들 방법 중 몇몇은 몇몇 실험실에 액세스 할 수있다 (예 : 유도 결합 플라즈마 질량 분석)을 측정 장치 (4)를 필요로한다는 것이다. 연구 및 개념 증명 수준 AR에 참신한 GBCA 검색의 맥락elatively 더욱 편리하고 신속하고 비용 효율적인 분광 기반 방법 (예 : 비스 - UV 흡수 또는 형광 등) 유용한 대안이 될 수있다. 마음에 이러한 응용 프로그램으로, 수성 하나님 3+에 대한 형광 앱 타머 기반 센서 (9)을 개발 하였다.
앱 타머 (GD-앱 타머)는 지수 농축 (SELEX) (9)에 의한 리간드의 체계적인 진화의 과정을 통해 분리하여 염기의 특정 순서와 44 염기 길이의 단일 가닥 DNA 분자이다. 형광 센서에 앱 타머에 적응하기 위해, 형광 물질은 13 상보적인 염기 (도 1)를 통해 급냉 스트랜드 (QS)와 혼성화되는 가닥의 5 '말단에 부착된다. QS는 3 '말단에 어두운 소광 분자 태그입니다. 1 이루어지는 하나님 3+ 센서 (GD-센서)의 부재에있어서 : 각각 GD-앱 타머 및 QS 2 몰비 최소 형광 방출 인해 t있을 것이다소광에 형광에서 오 에너지 전달. 수성 하나님 3+의 첨가는 형광 방출 증가의 결과로, GD-앱 타머에서 QS를 대체 할 것이다.
형광 (형광)과 dabcyl 태그로 13베이스 긴 담금질 가닥 (QS) 태그로 44베이스 긴 앱 타머 (GD-앱 타머) (어두운 소광)로 구성되어 그림 1. 센서 (하나님 센서) . unchelated 하나님 3+의 부재에서, 센서의 형광이 최소이다. 하나님 3+의 첨가에 의해, QS의 변위가 발생하고, 형광 발광의 증가가 관찰된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
현재 존재 한 일반적으로 사용되는 광학적 기반 방법에 대한 검출수성 하나님의 3 이상을 보내고. 이 분석은 이온 10 킬에 따라 433 nm의 573에서 최대 흡수 파장의 변화를 겪는다 분자 크 실레 놀 오렌지를 사용합니다. 이들 두 흡수 최대 값의 비율은 unchelated 하나님 3+의 양을 정량화 할 수있다. 두 가지 방법은, 타겟 선택도, 정량 분석의 선형 범위 및 검출 양상 (예 : pH 및 사용되는 버퍼 용액의 조성과 같은) 상이한 반응 조건을 가지고, 상기 앱 타머 센서는 크 실레 놀 오렌지 분석에 대한 대안 (또는 보완 될 수있다)는 9.
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Protocol
참고 : 분자 생물학 수준의 물이 모든 버퍼 및 솔루션 준비에 사용됩니다. 모든 일회용 튜브 (마이크로 원심과 PCR) 및 피펫 팁 DNase-과의 RNase-무료입니다. 사용하기 전에 모든 화학 물질에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하는 것이 좋습니다.
앱타 머는 재고 솔루션 1. 준비
- 상업적으로 polydeoxynucleotide의 2 가닥을 구입합니다. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)로 정제와 두 가닥을 주문한다.
1 (GD-앱 타머를) 가닥 :
5 '- / 56 FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
스트랜드 2 (QS) :
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - 하나님 - 앱 타머 및 QS 100 μM 각각의 원액을 물에 각각의 가닥을 녹인다.
- -20 ° C에서 이러한 솔루션을 저장합니다. 솔루션은 지금까지 3 년 동안 안정하다.
- FREEZ을 최소화하기 위해전자 해동 사이클, 10 μL 씩의 주식 솔루션을 저장합니다.
2 배속 하나님 센서 솔루션의 2. 준비
- 상기 분석 버퍼를 준비한다 (20 mM의 HEPES, 2 밀리미터의 MgCl 2, 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을). 수산화 나트륨과 염산으로 pH를에 ~ 7.4를 조정하고 0.2 μm의 PES 막으로 멸균 일회용 병 톱 필터를 통해 필터링합니다. 멸균 병에 보관합니다. 여과하고 (실온에서) 제대로 저장하는 경우, 버퍼는 지금까지 2 년 동안 안정하다.
- 분석 버퍼 497 μL와 (단계 1.2)에 QS 원액의 2 μL (단계 1.2)에 하나님 - 앱 타머 주식 솔루션의 1 μL를 희석. 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 배속 GD-센서 용액에서의 농도는 각각 200, 400㎚이다.
주 - 검량선 및 조영제 솔루션 3+ 하나님 7이 다양한 농도에서 제조 한 배 GD-센서 용액의 부피는 6을 테스트하기에 충분한 500 μL 인(단계 3). 각 샘플은 384 웰 플레이트에 중복 우물을 줄 것이다.- 시험해야 하나님 3+ 솔루션의 수에 따라 2 배 GD-센서 용액의 양을 조정한다.
- 각 튜브에 50 μL로, 9 PCR 튜브에 2 배 하나님 센서 솔루션을 전송합니다. 열 자전거 타는 사람에 튜브를 놓습니다.
- 95 ° C로 튜브 용액을 가열하는 열 자전거 타는 사람에 프로그램을 설정, 5 분 동안 유지 한 후 천천히의 속도로 (15 분 ~ 동안 25 ° C에 솔루션을 냉각 ~ 0.05-0.1 ° C / 에스). 가열 및 냉각 사이클은 하나님-앱 타머와 QS 사이의 최적의 하이브리드을 보장하는 것입니다. 불완전 담금질하고 센서의 높은 배경 형광 부분 혼성화 결과. 열 사이 클러를 사용할 수없는 경우, 대신에 뜨거운 물이 욕을 사용하여이 과정을 수행한다.
- 일단 25 ℃까지 냉각하고, 즉시 용액을 사용하거나 할 준비가 될 때까지 (약 2 시간까지) 열 사이 클러에 보관익숙한. 수욕은 가열에 사용하는 경우에는 물을 서서히 실온으로 냉각대로 용기에 튜브를 떠난다.
3. 형광 교정 곡선을 구축하고 하나님 대비 에이전트의 솔루션에 3+ Unchelated 하나님의 존재를 감지
- 상기 분석 버퍼 고체 GdCl 3 (단계 2.1에서와 같은 버퍼)에 녹인다.
- 시리얼 희석 통해 검량선 (2 × 용액)에 대해 원하는 최종 농도의 100 배에 μL 마이크로 원심 튜브 6 다른 하나님 3+ 용액을 각각 준비한다.
- 예를 들어, 0에 대한 보정을 구성, 50, 100, 200, 400 (NO GdCl 3 만 버퍼링)하고 하나님 3+ 800 nM의 0, 100, 200, 400, 800 및 1600 nM의 함유 용액을 제조 이온의. 확인은 음성 대조군 0 nM의 하나님 3+와 '빈'을 항상 포함 할 수 있습니다.
- 시험 될 조영제 녹이고분석 버퍼에 에드. 일련의 희석을 통해 조영제 용액의 2 또는 3 개의 농도를 준비한다.
참고 : 조영제 솔루션의 3 가지 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 이것은 이러한 농도는 선형 범위 내에 있도록한다. 선형 관계를 표시하지 않은 시험 샘플은, 조영제의 농도를 감소하는 경우 사용된다. - 열 자전거 타는 사람 중 단계 2.5에서 2 배 하나님 센서 솔루션을 포함하는 PCR 튜브를 타고.
- 2 배속 하나님 센서 솔루션을 포함하는 9 PCR 튜브 (6)에 단계 3.2에서 각각 하나님 3+ 용액 50 μL를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. 각 PCR 튜브는 이제 원하는 하나님 3+의 농도를 테스트 할, 100 nm의 하나님 - 앱 타머, 200 nm의 QS가 포함되어 있습니다.
- 배속 GD-센서 함유 용액 나머지 PCR 튜브에 단계 3.3에서 조영제 용액 50 μL를 추가한다. 최대 피펫 팅에 의해 몇 번 아래로 잘 섞는다.
- 의 S를 품어실온에서 약 5 분 동안 PCR 튜브에 olutions. 그들은 최대 30 분 동안 방치 될 수있다.
- 384 웰 플레이트에 각 튜브의 45 μL를 전송합니다. 각 PCR 튜브 중복 우물을 줄 것이다.
- 접시 리더에 각 웰의 형광을 기록합니다. 공급 업체의 웹 사이트에 나와있는대로 하나님 센서 설계에 사용되는 형광 물질 (FAM)는 각각 495과 520 나노 미터의 여기 및 방출 최대 값을 갖는다. 판 독자가 monochromator- 또는 필터 기반인지에 따라 적합한 여기 및 방출 파장 또는 필터를 선택합니다.
- 하나님 3+의 농도에 대한 임의의 형광 단위 (AFU)에서 형광의 그래프를 플롯.
- 하나님 3+의 농도에 대한 형광 배 변화와 그래프를 플롯. (하나님의 영 nM의 3 이상 포함) '빈'솔루션의 AFU 각 농도의 AFU을 나누어 형광 배의 변화를 계산한다. 형광 배의 변화는 N을 허용합니다결과 ormalization의 AFU 표시 일부주기 (다른 일 등)가 유사해야한다.
- 이 0 ㎚ GdCl 3 (단 버퍼)를 함유하는 용액 인 조영제를 함유하는 용액과 "빈"의 형광 방출을 비교한다.
주 : GBCA 용액 높은 형광 조영제의 추가의 정제를 필요로 할 수있다 unchelated 하나님 3+의 존재를 의미한다. unchelated 하나님 3+의 양은 단계 3.10 3.11 구성된 검량선을 이용하여 추정 될 수있다.
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Representative Results
unchelated 하나님 3+의 존재 GD-센서 용액의 전형적인 형광 변화는도 2에 도시되어있다. 방출은 형광 배 변화 (그림 2A) 또는 임의의 단위로 읽기 원시 형광 (그림 2B)로 나타내 어질 수 (AFU). 두 플롯> 3 μM에서 신호의 1 μM 및 채도 아래 하나님의 농도에 대한 선형 범위 3+와 매우 유사 교정 곡선을 얻었다. 검출 한계는 3 신호대 잡음비와 ~ 100 ㎚이다.
관심 GBCA를 함유하는 용액에서 unchelated 하나님 3+의 존재는 "빈"솔루션에 비해 센서의 형광의 증가로 변환된다. 하나님-DOTA 단지, 다른 것보다 더 높은 순도의 하나의 2 개의 다른 배치의 솔루션 형광 변화는 쇼입니다n 개의 대표적인 결과의 예로서 (그림 3). GD-DOTA (gadoteric 산) 상용 조영제에서 발견되는 유기 리간드에 의해 둘러싸여 DOTA GD의 가돌리늄 착물 3+이다. 높은 순도의 배치는 하나님-DOTA의 20 mM의 배출까지의 상당한 증가를 표시하지 않습니다. unchelated 하나님 3+가 존재하는 경우에도 5 밀리미터 이하 GD-DOTA 농도에서 눈에 띄는 변화가 관찰된다. 데이터 포인트는 센서의 형광 배 변화로서 플롯이 예에서는 unchelated 하나님 3+의 양의 정량화는도 2a의 검량선을 이용하여 추정 될 수있다.
도 2 주제 GD-센서 형광 검량선 플롯. 모든 데이터 포인트를 두번 이상 수행하고, 평균 값을 플롯오차 막대와 같은 표준 편차 테드. (A) 검량선 100 nM의 GD-앱 타머 내지 200nm QS를 사용하여 획득. 그래프는 Y 축으로 형광 배 변화 플롯. (B), Y 축과 같은 임의 단위 (AFU) 원시 형광성 (A)과 동일한 검량선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 주제 GD-센서 형광 변화 GD-DOTA 분자 샘플 unchelated 하나님 3+의 존재를 테스트. 하나님-DOTA 복잡한 솔루션의 두 개의 서로 다른 배치가이 음모에 표시됩니다, 높은 순도 (원 마커) 및 다른 포함 unchelated 하나님 3+ 중 하나 (파란색 triangl전자 마커). 각 데이터 포인트는 오차 막대와 같은 표준 편차를 두 측정의 평균이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
앱타 머는 기반 GD-센서 관측 unchelated 하나님 3+의 농도에 비례하는 형광 방출의 증가 사용. 사용한 시료의 양을 최소화하기 위해, 분석은 웰 당 45 μL의 총 샘플 부피의 384 웰 마이크로 플레이트에서 실행될 수있다. 이 설계에서, 플루오 레세 인 (FAM) 및 dabcyl DAB ()의 선택은 주로 시약의 비용에 기초 하였다 발광 파장, 형광의 다른 쌍을 수정 및 소광 제 (11)를 사용할 수있다.
이것은 센서 최상의 결과를 얻을 것을 주목하는 것이 중요하다 중요한 단계 중 하나는 GD-앱 타머 및 QS 사이의 최적의 하이브리드 화를 달성하는 분석 완충액에서 95 ° C 및 서냉 (단계 2.4)에 대한 가열은 가닥. 이전의 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 열 순환기를 사용할 수없는 경우, 95 ℃에서 항온 수조에서 수행 될 수있다. 제어하는 또 다른 주요 매개 변수는 t입니다그 버퍼 용액의 조성; 조영제를 용해 단계 2.1에 기재된 분석 완충액의 사용은 권장 또는 탈 이온수를 사용할 수도있다. 그러나, 잠재적 인 간섭 물질을 포함하는 솔루션은 피해야한다. 그러한 버퍼의 예 3+ unchelated와 Gd 조정할 수 불용성 가돌리늄 포스페이트 (12)을 형성하는 인산 음이온을 포함 하나. 침전물 위음성 결과 센서와 반응하지 않을 것이다.
실험에서 몇 단계의 결과에 영향을주지 않고 변형 될 수있다. 먼저, 분석 및 계산을 단순화 GD-센서 용액 및 2 배의 농도로 검량선 용 수성 GdCl 셋 모두를 제조 하였다. 원하는 경우, 다른 희석 요인 GD-앱 타머의 최종 분석 농도 및 QS 각각 100 nM 내지 200 nm에서 유지되는 것을 제공 (예를 들어, 10 배의 용액)을 사용할 수있다. 둘째, 어 세이 버퍼 (D)히어로 정확히 pH가 7.4가 될 필요가 없습니다. 7 사이의 값 - 7.4만큼 동일한 완충액 실험에서 사용 된 바와 같이, 원하는 형광 증가를 생산할 것이다. 형광 발광 판독이 획득되면 셋째, 데이터 포인트가 임의의 단위 원 형광 (AFU) 또는 형광 배 변화로서 어느 플롯 될 수있다. 형광 배의 변화를 계산하려면 각 농도의 원시 형광 판독은 음성 대조군 (0 nm의 하나님 3+)의 (로 나눈 값) 독서에 정상화된다. 도 2A 및 B에 도시 된 바와 같이, 양 플롯에서의 형광 방출 경향은 거의 동일하다. 플레이트 판독기가 다른 시간에 기록 된 원시 수치의 일부 변형을 표시하면 배 변화 데이터를 분석하는 편리한 방식 일 수있다. 실험실은 형광 아니라 플레이트 판독기가 장착되어있는 경우 마지막으로, 각 데이터 포인트는 마이크로 대신에, 큐벳을 사용하여 측정 될 수있다. 크기에 따라 오가능한 큐벳 F를 분석에서 제조 한 용액의 양을 조정할 필요가있다.
본원에보고 된 방법은 chromatographic-의 대안을 제공 및 / 또는 수성 하나님 3+를 검출하기위한 분석법 기반 기술. 후자에 비해, GD-센서 분석은 여러 종의 동시 검출을위한 민감도, 정확도 및 기능면에서 더욱 제한된다. 한편, 분광 기반 센서는 아마도 더 쉽게 사용할 짧은 시간 내에 수행 될 수있을 수있는 수단을 필요로하고, 샘플 준비는 최소이다. 조영제는 단순히 GD-센서 용액과 혼합 완충액에 용해 될 수 있고, 형광 발광을 직접 측정했다. 또한, 센서는 크 실레 놀 오렌지 표시기 (두 방법 사이의 크기 차이는 약 2 오더)보다도 3+ unchelated 하나님의 훨씬 더 낮은 농도를 검출 할 수있다 및여러 가지 다른 생물학적으로 중요하고 전이 금속 이온 9 위에 하나님 3+에 대한 높은 선택성.
일부 실험 조건에서의 사용을 제한 할 수 있습니다이 분석의 두 가지 단점이 있습니다. 하나의 제한은 센서가 3+ 하나님 특정 없다는 것이다; 그것은 9 (예 : Eu2 +를하고 TB 3+ 등) 다른 란탄 족 이온에 대한 응답을 표시합니다. 그러나, 이들은 통상적으로 조영제 검색된 이온 또는 생물학적 시스템은 아니므로, 이들의 간섭을 최소화한다. 주목해야 할 두 번째 포인트는 하나님 3+의 하나님 센서 형광 방출의 점진적인 감소의 높은 농도 (10 ~ 위 μM)이 관찰된다는 점이다. 란탄 족 이온에 의해 급냉의 효과는 검출하고 (14)를 정량하기위한 기술로서 사용되어 온 잘 문서화 현상 (13)이다. 이것은 하나님의 높은 농도를 측정하는 센서의 효용을 제한하는 반면 3+
본 연구에서는 수용액 독성 unchelated 하나님 3+를 검출하기위한 편리한 형광 기반 기술의 사용을 설명하고있다. 이 분석은 특히 시험 관내 실험 합성 및 배합시, 가돌리늄 계 조영제 순도의 초기 단계 평가를 의미한다. 진단에서 자기 공명 영상의 현재 성장과 함께, 새로운 조영제의 증가는 지속적으로 설계 및 테스트되고있다. 앱타 머는 기반 GD-센서 빠르게 주위의 pH에서 수용액 또는 미 해리 하나님 3+ 서브 마이크로 몰 농도의 존재를 검출하는 수단을 제공함으로써 이러한 개발을 촉진 할 것이다. 센서가 다른 가의 란타나 이드 이온과 교차 반응을 표시하기 때문에, 그 응용이 될 수있다연구의 이러한 영역을 확장했다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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