非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

Introduction

技術固有の感度によって制限され、臨床診断、磁気共鳴イメージング（MRI）の重要性の高まりは、新規ガドリニウムベースの造影剤^（GBCAs）1の開発の研究の急速な成長をもたらしました。 GBCAsは、画像品質を改善するために投与される分子であり、それらは、典型的には、多座配位子に配位価のガドリニウムイオン（Gdの^3+）の化学構造を有します。非キレートのGd ^3+は有毒であるように、この複合体形成は極めて重要です。それは、腎疾患または障害²と一部の患者における腎性全身性線維症の発症に関与しています。その結果、水性の遊離イオンを検出することがGBCAsの安全性を確保することに尽力しています。 GBCAソリューションの非キレート化のGd ³⁺の存在は、多くの場合、リガンドとイオン、複合体の解離、またはdisplacemen間の不完全な反応の結果であります他の生物学的金属カチオン³によってトン。

現在のGd ^3+、汎用性および適用⁴の観点で最も高いクロマトグラフィーおよび/または分析のランクに依存するそれらの存在を決定するために使用されるいくつかの技術のうち。それらの長所の中でも、高感度および精度、（リストを、複数のGd ³⁺複合体の同時定量（ヒト血清^5、尿及び毛髪^6、廃水^7、及び造影剤配合物^8を含む） ^は 、種々のサンプルマトリックスを分析する能力であります研究の2013年前にはTelgmann ら ^）4により包括的なレビューに記載されています。唯一の欠点は、これらの方法のいくつかは、いくつかの研究室がアクセス権を持っていないかもしれません（そのような誘導結合プラズマ質量分析など）計測器^4を必要とすることです。研究や概念実証レベルでの新たなGBCA発見の文脈の中で、ARelativelyより、便利で迅速、かつ費用対効果の高い分光ベースの方法は、（例えば、UV-可視吸収または蛍光のような）価値のある代替物として機能することができます。心の中でこれらのアプリケーションでは、水のGd ³⁺のための蛍光アプタマーベースのセンサは^9を開発しました。

アプタマー（GD-アプタマー）が指数関数的濃縮^（SELEX）9によるリガンドの系統的進化の過程を経て単離した塩基の特定の配列を有する44塩基長の一本鎖DNA分子です。蛍光センサーにアプタマーを適応させるために、フルオロフォアは、その後13相補的塩基（ 図1）を介して急冷ストランド（QS）とハイブリダイズされた鎖の5 '末端に結合しています。 QSは、3 '末端ダーククエンチャー分子でタグ付けされています。 Gd ³⁺の非存在下では、1からなるセンサ（GD-センサー）：それぞれのGd-アプタマーとQSの2モル比は、最小の蛍光発光によるTを有していますクエンチャーへのフルオロフォアからOエネルギー移動。水性のGd ³⁺を添加すると、蛍光発光の増加をもたらす、のGd-アプタマーからQSを置換します。

フルオレセイン（蛍光団）とダブシルでタグ付けされた13塩基長の消光ストランド（QS）でタグ付けされた44塩基長のアプタマー（GD-アプタマー）（ダーククエンチャー）で構成され 、図1 のセンサ（GD-センサー） 。非キレート化のGd ³⁺の非存在下では、センサの蛍光は最小です。 Gd ³⁺を添加し、QSの変位が発生し、蛍光発光の増加が観察されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

検出のための1つの一般的に使用される分光ベースの方法は、現在ではあり水性のGd ^3+をる。このアッセイは、イオン¹⁰にキレート化時に433から573 nmの最大吸収波長のシフトを起こす分子キシレノールオレンジを使用しています。これら二つの吸光度最大値の比率は、非キレート化のGd ³⁺の量を定量するために使用することができます。 2つの方法は、標的選択性、定量の線形範囲は、検出様式（例えば、pH及び使用する緩衝液の組成など）は、異なる反応条件を有するようにアプタマーセンサーは、キシレノールオレンジアッセイに代わるもの（これも相補的であってもよい）であります^9。

Protocol

注：分子生物学グレードの水は、すべての緩衝液および溶液製剤で使用されます。すべて使い捨てチューブ（微量とPCR）およびピペットチップはDNase-とRNaseフリーです。使用前に、すべての化学物質のための材料安全データシート（MSDS）を参照してください。適切な個人保護具（PPE）の使用を強くお勧めします。

アプタマーストック溶液の調製

1. 商業的にポリデオキシヌクレオチドの2本鎖を購入します。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による精製との両方の鎖を注文します。
   ストランド1（GD-アプタマー）：
   5 ' - / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   ストランド2（QS）：
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Gd-アプタマーとQSの100μMの個々の原液を作るために水の中に各鎖を溶かします。
3. -20℃でこれらのソリューションを保管してください。ソリューションはこれまで、3年間安定です。
4. freezを最小限に抑えるために、電子融解サイクル、10μLのアリコートで原液を格納します。

2倍のGd-センサーソリューションの調製

1. アッセイ緩衝液を調製し（20mMのHEPES、2mMのMgCl ₂を、150mMのNaCl、5mMのKClを）。 NaOHおよびHClでpHに〜7.4に調整し、0.2μmのPES膜で滅菌使い捨てボトルトップフィルターでろ過します。滅菌瓶に保管してください。濾過し、（室温で）適切に保存されている場合、バッファはこれまで、2年間安定です。
2. （ステップ1.2から）のGd-アプタマー原液の1μLおよびアッセイ緩​​衝液497μL（ステップ1.2から）QS原液の2μLに希釈します。ボルテックスを用いてよく混ぜます。 2XのGdセンサ液中の濃度は、それぞれ、200 nmおよび400 nMです。
   注： -検量線造影剤溶液のためのGd ³⁺の7様々な濃度のこの工程で調製したGd 2×センサー溶液の体積は、6をテストするのに十分である500μL、あります（ステップ3）。各サンプルは、384ウェルプレートに二連のウェルを与えます。
   1. テストする必要のGd ³⁺ソリューションの数に応じて2倍のGd-センサーソリューションの音量を調整します。
3. 各チューブに50μLで、9 PCRチューブに2倍のGd-センサー・ソリューションを転送します。サーマルサイクラーにチューブを入れます。
4. 95°Cまでのチューブ内の溶液を加熱するサーマルサイクラーにプログラムを設定し、5分間保持し、その後、ゆっくりの速度で（15分〜かけて25℃にソリューションを冷却〜0.05から0.1℃/秒）。加熱と冷却のサイクルは、GdのアプタマーとQS間の最適なハイブリダイゼーションを確実にすることです。不完全焼入れとセンサーの高いバックグラウンド蛍光の部分的なハイブリダイゼーションの結果。サーマルサイクラーを使用できない場合は、代わりに、湯浴を用いてこの処理を行います。
5. 一度25℃に冷却し、直ちに解決策を使用するか、またはこと準備ができるまで（約2時間まで）サーマルサイクラーに保ちます中古。水浴を加熱するために使用される場合、水がゆっくりと室温まで冷却するように、浴中でチューブを残します。

3.蛍光検量線の構築及びGd造影剤の溶液に非キレート化のGd ³⁺の存在を検出します

1. アッセイ緩衝液中の固体のGdCl _3（ステップ2.1と同じバッファ）を溶解します。
2. 連続希釈によって、検量線（2回ソリューション）の最終的な所望の濃度の二重で100μLマイクロ遠心チューブ内の6異なるのGd ³⁺の溶液のそれぞれを準備します。
   1. たとえば、0の校正（NOのGdCl ₃と緩衝液のみ）、50、100、200、400、及びGd ³⁺の800 nMのを構築0、100、200、400、800を含有する溶液を調製し、1,600 nmのイオンの。常にネガティブコントロールとして0 nMでのGd ³⁺との「空白」を必ず含めてください。
3. 試験であることが造影剤を溶解アッセイ緩​​衝液中で編。連続希釈を介して造影剤溶液の2または3種の異なる濃度を準備します。
   注：造影剤溶液の3種の異なる濃度のテストをお勧めします。これは、これらの濃度は線形の範囲内にあることを保証することです。試験した試料は直線関係が表示されない場合は、使用する造影剤の濃度を低下させます。
4. サーマルサイクラーのうちステップ2.5から2倍のGd-センサー溶液を含むPCRチューブを取ります。
5. 2倍のGd-センサー・ソリューションを含む9 PCRチューブの6にステップ3.2からそれぞれのGd ³⁺溶液50μLを追加します。ピペッティングにより混和します。各PCRチューブは今のGd ³⁺テストされる、100 nMのGdの-アプタマー、および200 nMのQSの所望の濃度が含まれています。
6. 2倍のGd-センサー・ソリューションを含む残りのPCRチューブに、ステップ3.3からの造影剤溶液の50μLを追加します。ピペッティングにより、数回上下よく混ぜます。
7. 秒をインキュベート室温で約5分間のPCRチューブ内olutions。彼らは、最大30分間放置してもよいです。
8. 384ウェルプレートに各チューブの45μLを転送します。各PCRチューブは、二連のウェルが得られます。
9. プレートリーダーで各ウェルの蛍光を記録します。供給業者のウェブサイトに掲載されているとしてのGd-センサ設計で使用されるフルオロフォア（FAM）は、それぞれ495および520 nmでの励起および発光極大を有しています。プレートリーダーはmonochromator-またはフィルタベースであるかどうかに応じて、適切な励起波長および発光波長やフィルタを選択してください。
10. Gd ³⁺の濃度に対する任意の蛍光単位（AFU）における蛍光のグラフをプロットします。
11. Gd ³⁺の濃度に対する蛍光倍率変化としてグラフをプロットします。 （GD ³⁺の0 nMので）「ブランク」ソリューションのAFUにより各濃度のAFUを分割することにより、蛍光倍率変化を計算します。蛍光倍数変化は、nが可能になります結果のormalization、AFU表示いくつかの定期的な（異なる日、 等 ） が変動する必要があります。
12. 0 nMでのGdCl _3（緩衝液のみ）を含む溶液で造影剤を含む溶液と、「ブランク」の蛍光発光を比較します。
    注：GBCA溶液の高い蛍光は、造影剤の更なる精製を必要とすることができる非キレート化のGd ³⁺の存在を意味します。非キレート化のGd ³⁺の量は、工程3.10または3.11で作成した検量線を用いて推定することができます。

Representative Results

非キレート化のGd ³⁺の存在下でのGdセンサ液の典型的な蛍光変化を、 図2に示されています。発光は、任意の単位（AFU）における蛍光倍数変化（ 図2A）又は読み出しの生の蛍光（ 図2B）としてプロットすることができます。両方のプロットは、1μMおよび> 3μMでの信号の飽和以下のGd ³⁺の濃度について線形範囲で非常に類似した検量線が得られます。検出限界は、3つの信号対雑音比を有する〜100nmです。

関心のGBCAを含有する溶液において、非キレート化のGd ³⁺の存在は、「ブランク」溶液と比較して、センサの蛍光増加に変換されます。 Gd-DOTA複合体の2つの異なるバッチ、他よりも高い純度の1の溶液中の蛍光変化は、ショーです代表的な結果（ 図3）の例としては、N。 GD-DOTA（ガドテル酸）のGdガドリニウム錯体³⁺商業造影剤に見られる有機リガンドDOTAで囲まれています。より高純度のバッチのGd-DOTAの20 mmの放出までの有意な増加を表示しません。非キレート化のGd ^3+が存在する場合、さらには5 mMの以下のGd-DOTA濃度で顕著に変化が観察されます。データ点は、センサの蛍光の倍率変化としてプロットされているこの例では、非キレート化のGd ³⁺の量の定量化は、 図2Aの較正曲線を用いて推定することができます。

図2 の代表のGdセンサ蛍光較正曲線プロット。すべてのデータポイントは重複し、少なくとも行い、平均値をプロット値エラーバーとして標準偏差テッド。 （A）校正曲線は100nmでのGd-アプタマー200 nMのQSを用いて得られました。グラフはy軸として蛍光倍数変化でプロットされています。 （B）y軸として任意の単位（AFU）で生の蛍光を有する（A）と同一の検量線。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3. 代表のGd-センサーの蛍光変化 のGd-DOTA分子のサンプル中の 非キレート化のGd ³⁺ の存在をテストします 。 Gd-DOTA複雑なソリューションの二つの異なるバッチがこのプロットに示されているが、より高純度（円マーカー）およびその他を含む非キレート化のGd ³⁺の1（青trianglEマーカー）。各データ点は、エラーバーとしての標準偏差を有する2つの測定値の平均です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

アプタマーベースのGd-センサを用いて、非キレート化のGd ³⁺の濃度に比例する蛍光発光の増加が観察されます。使用されるサンプルの量を最小にするために、アッセイは、ウェル当たり45μLの全試料体積で384ウェルマイクロプレートで実行されてもよいです。この設計では、フルオレセイン（FAM）およびダブシル（DAB）の選択は、主に、試薬のコストに基づいていました。発光波長、蛍光体の異なるペアを変更すると消光剤^11を使用することができます。

重要なステップの一つは、GdのアプタマーとQS間の最適なハイブリダイゼーションを達成するために、アッセイ緩​​衝液中で95℃、徐冷（ステップ2.4）に加熱され、センサーで最良の結果を得るために、それを注意することが重要ですストランド。以前のプロトコルで述べたようにサーマルサイクラーを使用できない場合は、95℃でのインキュベーションは、水浴中で行ってもよいです。制御するためのもう一つの重要なパラメータはtです彼は、緩衝液の組成物。造影剤を溶解するために、ステップ2.1に記載されているアッセイ緩​​衝液の使用が推奨され、または脱イオン水を使用してもよいです。しかし、潜在的な干渉を含む溶液は避けるべきです。そのような緩衝剤の例としては、不溶性リン酸ガドリニウム^12を形成するために非キレート化のGd ³⁺に配位することができ、リン酸アニオンを、含有するものです。沈殿物は、偽陰性の結果が得られ、センサーに反応しません。

実験のいくつかのステップは、結果に影響を与えずに修正することができます。まず、分析及び計算を単純化するために、2倍の濃度の検量線用のGdセンサ水溶液とのGdCl ₃の両方を準備します。所望であれば、他の希釈係数は、Gdを、アプタマーの最終アッセイ濃度とQSは、それぞれ、100 nmおよび200 nmで維持されていれば、（例えば、10倍溶液）を使用してもよいです。第二に、アッセイバッファーDOES正確にpHが7.4である必要はありません。 7の間の任意の値 - 7.4であれば同一の緩衝液を、実験の全体にわたって使用されるように、所望の蛍光増加を生じます。蛍光発光の読み取りが得られると第三に、データ点は、任意の単位での生の蛍光（AFU）として、または蛍光倍数変化のいずれかをプロットすることができます。蛍光の倍率変化を計算するために、各濃度の未加工の蛍光読み取りは、陰性対照（0 nMでのGd ^3+）の読み取り（分周）に正規化されます。 図2AおよびBに示すように、両方のグラフにおいて蛍光発光の傾向はほぼ同じです。倍数変化を、プレートリーダーは、異なる時間に記録された生の読みでいくつかのバリエーションが表示されている場合、データを分析するためのより便利な方法であり得ます。実験室は蛍光ではなく、プレートリーダーが装備されている場合、最終的に、各データポイントではなく、マイクロプレート、キュベットを用いて測定することができます。サイズOに応じて、利用可能なキュベットfは、アッセイで調製した溶液のボリュームを調整する必要があります。

本明細書で報告された方法は、chromatographic-する代替手段を提供し、および/または水性のGd ^3+を検出^するため^の分析に基づく技術。後者に比べて、Gdのセンサーアッセイは、複数種の同時検出のための感度、精度、および能力の点で、より制限されています。一方、分光ベースのセンサは、おそらくより容易に入手できる、より短い時間内に行ってもよいとすることができる機器を必要とし、試料調製は最小です。造影剤は、単にのGdセンサー溶液と混合し、緩衝液に溶解してもよいし、蛍光発光を直接測定します。さらに、センサは、キシレノールオレンジ指示薬（2つの方法の間の大きさの差の約2オーダー）より非キレート化のGd ³⁺の非常に低い濃度を検出することができるとありいくつかの他の生物学的に重要と遷移金属イオン⁹オーバーのGd ³⁺のためのより高い選択。

いくつかの実験条件の下でその使用が制限される可能性があり、このアッセイの2つの欠点があります。 1つの制限は、センサーが³⁺のGdに特異的ではないということです。それは^、9（などのEu ³⁺とTbの³⁺など^の ）他のランタニドイオンに対する応答が表示されます。しかし、これらは、一般に造影剤または生物学的システムに見出されるイオンはなく、従って、それらの干渉は最小です。注意すべき第二の点はのGd ^3+、Gdのセンサー蛍光発光の漸減の（〜10μM以上の）高濃度で観察されることです。ランタニドイオンによる消光の効果も検出し、それらに^14を定量化するための技術として使用されてきた十分に立証された現象で¹³です。これは、Gdの高濃度を測定するためのセンサの有用性を制限しながら^、3+

この研究では、水溶液中で毒性非キレート化のGd ^3+を検出^するため^の便利な蛍光ベースの技術の使用が記載されています。このアッセイは、特にin vitro実験のための合成および製剤中に、ガドリニウムベースの造影剤純度の初期段階の評価のために意図されています。診断、磁気共鳴イメージングの現在の成長と、新規の造影剤の増加は、継続的に設計され、試験されています。アプタマーベースのGdセンサは、急速に、未反応のまたは周囲のpHの水溶液中でのGd ^3+を解離のサブマイクロモル濃度の存在を検出するための手段を提供することによって、この開発を促進します。センサーは、他の三価のランタニドイオンとの交差反応性を表示するため、また、そのアプリケーションであってもよいです研究のこれらの領域に拡張。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well