Introduction
A importância crescente das imagens de ressonância magnética (MRI) em diagnóstico clínico, que é limitada pela sensibilidade inerente da técnica, resultou no rápido crescimento de investigação para o desenvolvimento de novos agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs 1). GBCAs são moléculas que são administrados para melhorar a qualidade da imagem, e eles tipicamente têm a estrutura química de um ião trivalente gadolínio (Gd 3+) coordenado a um ligando polidentado. Esta complexação é de importância crítica como D'us não quelatada 3+ é tóxico; tem sido implicado no desenvolvimento de fibrose sistémica nefrogénica, em alguns pacientes com doença renal ou falha 2. Consequentemente, a detecção do íon livre aquosa é fundamental para garantir a segurança dos GBCAs. A presença de não quelatada Gd3 + em soluções GBCA é muitas vezes o resultado de uma reacção incompleta entre o ligando e o ião, a dissociação do complexo, ou displacement por outros cátions metálicos biológicos 3.
Entre as várias técnicas usadas atualmente para determinar a presença de D'us 3+, aqueles que dependem de cromatografia e / ou classificação espectrometria mais alto em termos de versatilidade e aplicabilidade 4. Entre as suas vantagens são de alta sensibilidade e precisão, a capacidade de analisar diferentes matrizes de amostras de soro humano (incluindo 5, urina e cabelo 6, 7 de águas residuais, e formulações de agentes de contraste 8), e a quantificação simultânea de múltiplos complexos Gd 3+ (um perfil de estudos antes de 2013 é descrito em uma revisão abrangente por Telgmann et al.) 4. O único inconveniente é que vários destes métodos requerem instrumentação (tais como espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado) 4 que alguns laboratórios não podem ter acesso. Dentro do contexto da nova descoberta GBCA na investigação e níveis prova-de-conceito, ARmétodo baseado em espectroscopia elatively mais conveniente, rápido e de baixo custo (por exemplo, absorção de UV-Vis ou de fluorescência) pode servir como uma alternativa valiosa. Com esses aplicativos em mente, um sensor baseado em aptâmero fluorescente para aquosa Gd3 + foi desenvolvido 9.
O aptâmero (Gd-aptâmero) é uma molécula de ADN de 44 bases de comprimento de cadeia simples com uma sequência específica de bases que foi isolado por meio do processo de evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial (SELEX) 9. Para adaptar o aptâmero em um sensor fluorescente, um fluoróforo está ligado ao terminal 5 'da cadeia, que é então hibridado com uma cadeia de têmpera (QS), através de 13 bases complementares (Figura 1). O QS é marcado com uma molécula quencher escuro no terminal 3 '. Na ausência de Gd3 +, o sensor (Gd-sensor), composta de uma mistura 1: 2 proporção molar de Gd-aptâmero e QS respectivamente, terá de emissão de fluorescência mínima devido tO transferência de energia do fluoroforo para o inibidor. A adição de solução aquosa Gd3 + irá deslocar o QS do Gd-aptâmero, resultando num aumento da emissão de fluorescência.
Figura 1. O sensor (Gd-sensor) que consiste no longo aptâmero 44-base (Gd-aptâmero) marcados com fluoresceína (um fluoróforo) e a cadeia de 13 bases de comprimento têmpera (QS) etiquetada com DABCYL (um inibidor escuro) . Na ausência de não quelatada Gd3 +, a fluorescência do sensor é mínima. Com adição de Gd3 +, o deslocamento do QS ocorre e um aumento na emissão de fluorescência é observado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Não existe, actualmente, um método baseado em espectroscopia vulgarmente utilizado para detectaring aquosa 3+ D'us. Este ensaio utiliza o alaranjado de xilenol molécula, que sofre uma mudança no comprimento de onda máximo de absorção 433-573 nm após a quelação com o ião 10. A razão entre estes dois valores máximos de absorvância pode ser usado para quantificar a quantidade de não quelatada Gd3 +. O sensor de aptâmero é uma alternativa (também pode ser complementar) para o ensaio de laranja de xilenol, como os dois métodos têm diferentes condições de reacção (tais como o pH e a composição das soluções tampão utilizadas), selectividades alvo, gamas lineares de quantificação, e as modalidades de detecção 9.
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Protocol
NOTA: água de qualidade para biologia molecular é utilizado em todas as preparações de amortecimento e de solução. Todos os tubos descartáveis (microcentrífuga e PCR) e pontas de pipeta são DNase e RNase. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) para todos os produtos químicos antes da utilização. Uso de equipamento de proteção individual (EPI) é fortemente recomendado.
1. Preparação de Soluções de Stock aptâmero
- Comprar 2 fios de polidesoxinucleótido comercialmente. Ordenar ambas as cadeias com purificação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
Vertente 1 (Gd-aptâmero):
5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
Strand 2 (QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 ' - Dissolver cada vertente na água para fazer 100 mm soluções stock individuais do Gd-aptâmero e o QS.
- Armazenar as soluções à temperatura de -20 ° C. As soluções são estáveis até agora, durante 3 anos.
- Para minimizar Freezciclos e-descongelamento, armazenar as soluções de estoque em 10 mL alíquotas.
2. Preparação da Solução 2x Gd-Sensor
- Prepara-se o tampão de ensaio (HEPES 20 mM, MgCl 2 2 mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajustar o pH para ~ 7,4 com NaOH e HCl, e filtrar através de filtros para frascos estéreis descartáveis com 0,2 m de membrana PES. Armazenar em garrafas estéreis. Se filtrada e armazenada correctamente (à temperatura ambiente), o tampão é estável até agora, durante 2 anos.
- Dilui-se 1 mL da solução de estoque de Gd-aptâmero (a partir do passo 1.2) e 2 uL da solução de estoque QS (a partir do passo 1.2) em 497 uL de tampão de ensaio. Misturar bem utilizando um vortex. Suas concentrações na solução de Gd-sensor de 2x são 200 nm e 400 nm, respectivamente.
NOTA: O volume da solução de Gd-sensor de 2x preparado neste passo é de 500 mL, o que é suficiente para testar 6 - 7 concentrações variáveis de Gd3 + para a curva de calibração e as soluções de agente de contraste(passo 3). Cada amostra irá dar poços duplicados de uma placa de 384 poços.- Ajustar o volume da solução de Gd-sensor de 2x de acordo com o número de soluções Gd 3+, que necessita de ser testado.
- Transferir a solução de Gd-sensor de 2x em 9 tubos de PCR, com 50 uL a cada tubo. Colocar os tubos num ciclizador térmico.
- Definir o programa no termociclador para aquecer a solução nos tubos a 95 ° C, mantida durante 5 min, e em seguida arrefecer lentamente a solução até 25 ° C ao longo de ~ 15 min (a uma taxa de ~ 0,05-0,1 ° C / s). O ciclo de aquecimento e arrefecimento é assegurar a hibridação óptima entre o Gd-aptâmero e QS. resultados parciais de hibridação em têmpera incompleta e um fundo mais elevado de fluorescência do sensor. Se um termociclador não está disponível, realizar este processo utilizando um banho de água quente em vez disso.
- Uma vez arrefecida a 25 ° C, utilizar imediatamente a solução, ou manter-se no termociclador (até cerca de 2 h) até que esteja pronto para serusava. Quando um banho de água é utilizado para o aquecimento, deixam os tubos no banho como a água arrefece-se lentamente até à temperatura ambiente.
3. a obtenção da curva de calibração de fluorescência e detectar a presença de não quelatada Gd3 + em solução de Gd agente de contraste
- Dissolve-se 3 GdCl sólido no tampão de ensaio (o mesmo tampão como no passo 2.1).
- Através da diluição em série, preparar 100 mL cada um de 6 soluções de Gd 3+ diferentes em tubos de microcentrífuga com o dobro das concentrações finais desejadas para a curva de calibração (2x soluções).
- Por exemplo, para construir uma calibração para 0 (apenas tampão sem GdCl 3), 50, 100, 200, 400, e 800 nM de Gd3 +, preparar soluções contendo 0, 100, 200, 400, 800 e 1600 nM do ião. Certifique-se sempre incluir o "vazio" com 0 nM Gd 3+ como controle negativo.
- Dissolve-se o agente de contraste a ser testeed no tampão de ensaio. Preparar 2 ou 3 diferentes concentrações das soluções de agente de contraste, por diluição em série.
Nota: Os testes 3 diferentes concentrações da solução de agente de contraste é recomendado. Isto é para assegurar que estas concentrações estão dentro do intervalo linear. Se as amostras testadas não exibem uma relação linear, reduzir as concentrações do agente de contraste utilizado. - Tome os tubos de PCR contendo a solução 2x Gd-Sensor do passo 2.5 do termociclador.
- Adicionar 50 mL de cada solução Gd 3 + a partir do passo 3.2 em 6 dos tubos de PCR 9 contendo a solução 2x Gd-sensor. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Cada tubo de PCR agora contém a concentração desejada de Gd3 + a ser testado, com 100 nM de Gd-aptâmero e QS 200 nm.
- Para os restantes tubos de PCR contendo a solução de Gd-sensor de 2x, adicionar 50 uL das soluções de agente de contraste a partir do passo 3.3. Misture bem, pipetando para cima e para baixo algumas vezes.
- Incubar as solutions nos tubos de PCR de cerca de 5 min a temperatura ambiente. Eles podem ser deixados em repouso durante até 30 min.
- Transferir 45 uL de cada tubo numa placa de 384 poços. Cada tubo de PCR dará poços duplicados.
- Gravar a fluorescência de cada poço num leitor de placas. O fluoróforo (FAM) usada no projeto Gd-sensor tem excitação e emissão máximos de 495 e 520 nm, respectivamente, conforme listado no site do fornecedor. Escolha comprimentos de onda ou filtros de excitação e emissão adequados, dependendo se o leitor de placas é monochromator- ou baseado em filtro.
- Traçar o gráfico da fluorescência em unidades de fluorescência arbitrárias (AFU) contra concentração de Gd 3 +.
- Traçar o gráfico como a mudança de fluorescência vezes contra a concentração de Gd 3 +. Calcule a variação de fluorescência vezes dividindo o AFU de cada concentração pela AFU da solução "vazio" (com 0 nM de D'us 3+). A alteração de fluorescência de dobragem vai permitir a Normalization dos resultados, caso a exibição AFU alguns periódica (dias diferentes, etc.) variações.
- Comparar a emissão de fluorescência da solução que contém o agente de contraste e o "branco", que é a solução contendo 0 nM GdCl 3 (tampão apenas).
NOTA: A maior fluorescência da solução GBCA implica a presença de não quelatada Gd3 +, o que pode necessitar de purificação adicional do agente de contraste. A quantidade de não quelatada Gd 3+ presente pode ser estimada utilizando a curva de calibração construída na etapa 3.10 ou 3.11.
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Representative Results
Uma mudança de fluorescência típica da solução de Gd-sensor na presença de não quelatada Gd3 + é mostrada na Figura 2. A emissão pode ser representada graficamente como a mudança de fluorescência vezes (Figura 2A) ou a fluorescência em bruto leitura (Figura 2B) em unidades arbitrárias (AFU). Ambos os lotes se obter curvas de calibração muito semelhantes, com um intervalo linear de concentrações de Gd 3+ abaixo de 1 uM e de saturação do sinal de> 3? M. O limite de detecção é de aproximadamente 100 nm, com uma relação sinal-ruído de 3.
Em soluções que contêm o GBCA de interesse, a presença de não quelatada Gd3 + irá ser traduzido num aumento da fluorescência do sensor, quando em comparação com a solução 'em branco'. As alterações de fluorescência em solução de 2 lotes diferentes de complexo Gd-DOTA, um de pureza mais elevado do que o outro, são mostradosn como exemplos representativos dos resultados (Figura 3). Gd-DOTA (ácido gadotérico) é um complexo de gadolínio de Gd3 + rodeado por um DOTA ligando orgânico, que é encontrado em um agente de contraste comercial. O lote de pureza mais elevada não apresenta um aumento significativo na emissão de até 20 mM de Gd-DOTA. Quando não quelatada Gd3 + está presente, uma mudança que é perceptível mesmo em concentrações Gd-DOTA abaixo de 5 mM é observado. Neste exemplo, onde os pontos de dados estão representados como a mudança de fluorescência de dobragem do sensor, a quantificação da quantidade de não quelatada Gd3 + podem ser estimados utilizando a curva de calibração na figura 2A.
Figura 2. O representante Gd-sensor de fluorescência curva de calibração parcelas. Todos os pontos de dados foram realizadas pelo menos em duplicado e os valores médios de tramaTed com desvio padrão como as barras de erro. (A) Uma curva de calibração obtida utilizando-se 100 nM de aptâmero e o Gd-200 nm QS. O gráfico é traçado com a mudança de fluorescência vezes como o eixo y. (B) A mesma curva de calibração tal como em (A) com fluorescência em bruto em unidades arbitrárias (AFU) como o eixo dos y. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Representante mudança Gd-sensor de fluorescência ao testar a presença de não quelatada Gd3 + em amostras de molécula de Gd-DOTA. Dois lotes diferentes de soluções complexas Gd-DOTA são mostrados neste enredo, um dos mais elevada pureza (círculo marcador) eo outro contendo não quelatada Gd 3+ (triangl azule marcador). Cada ponto de dados é uma média de duas leituras com desvio padrão como as barras de erro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando o Gd-sensor baseado em aptâmero, um aumento na emissão de fluorescência que é proporcional à concentração de não quelatada Gd3 + é observada. Para minimizar a quantidade de amostra utilizada, o ensaio pode ser executado numa microplaca de 384 cavidades com um volume total de amostra de 45 uL por poço. Neste design, a escolha de fluoresceína (FAM) e dabcil (DAB) baseou-se principalmente sobre o custo dos reagentes; para modificar o comprimento de onda de emissão, um emparelhamento diferente de fluoróforo e o extintor podem ser utilizados 11.
É importante notar que para se obter o melhor resultado com o sensor, uma das fases críticas é a de aquecimento a 95 ° C e arrefecimento lento (passo 2.4) em tampão de ensaio para conseguir a hibridação óptima entre o Gd-aptâmero e o QS cadeias. Como mencionado anteriormente no protocolo, se um ciclizador térmico não está disponível, a incubação a 95 ° C pode ser realizada num banho de água. Outro parâmetro chave para controlar é tele composições das soluções tampão; o uso do tampão de ensaio listados no passo 2.1 para dissolver o agente de contraste é recomendado, ou pode também ser usada água desionizada. No entanto, as soluções que contêm potenciais interferentes devem ser evitados. Um exemplo de um tal tampão é uma que contém aniões de fosfato, o qual pode coordenar a não quelatada Gd 3+ para formar fosfato de gadolínio 12 insolúvel. O precipitado não vai reagir com o sensor, o que resulta em um resultado falso negativo.
Alguns passos nas experiências pode ser modificado sem afectar o resultado. Em primeiro lugar, para simplificar o ensaio e o cálculo, se preparar tanto a solução de Gd-sensor e o GdCl 3 aquoso para a curva de calibração com concentrações 2x. Se desejado, outros factores de diluição podem ser utilizados (por exemplo, soluções 10x), desde que as concentrações de ensaio finais do Gd-aptâmero e QS são mantidos a 100 nM e 200 nM, respectivamente. Em segundo lugar, o tampão de ensaio does não tem que ser exatamente pH 7,4. Qualquer valor entre 7-7,4 irá produzir o desejado aumento de fluorescência, enquanto o mesmo tampão é utilizado ao longo da experiência. Em terceiro lugar, uma vez que a leitura de emissão de fluorescência é obtido, os pontos de dados podem ser representados graficamente como a fluorescência, quer em bruto, em unidade arbitrária (AFU) ou como uma alteração de fluorescência dobra. Para calcular a variação da fluorescência de dobragem, a leitura da fluorescência em bruto de cada concentração é normalizado para (dividido por) a leitura do controlo negativo (0 nM Gd3 +). Como mostrado nas Figuras 2A e B, as tendências de emissão de fluorescência em ambos os lotes são quase idênticas. A mudança de dobragem pode ser uma forma mais conveniente para analisar os dados, se o leitor de placas mostra algumas variações nas leituras em bruto gravados em diferentes momentos. Finalmente, se o laboratório está equipado com um fluorómetro, mas não um leitor de placas, cada ponto de dados pode ser medido utilizando uma cuvete, em vez de uma microplaca. Dependendo do tamanho O.f os tinas disponíveis, os volumes das soluções preparadas no ensaio podem ter de ser ajustada.
O método aqui relatada proporciona uma alternativa para chromatographic- e / ou técnicas de espectrometria de detecção com base aquosa Gd3 +. Em comparação com esta última, o ensaio de Gd-sensor está mais limitada em termos de sensibilidade, precisão, e a capacidade para a detecção simultânea de múltiplas espécies. Por outro lado, o sensor baseado em espectroscopia requer uma instrumentação que pode, eventualmente, ser mais prontamente disponível, pode ser realizada dentro de um período de tempo mais curto, e a preparação da amostra é mínima. O agente de contraste pode ser simplesmente dissolvido em solução tampão, misturou-se com a solução de Gd-sensor, e a emissão de fluorescência medido directamente. Além disso, o sensor é capaz de detectar uma concentração muito menor de Gd 3+ não quelatada do que o indicador alaranjado de xilenol (cerca de 2 ordens de grandeza diferença entre os dois métodos) e tem ummaior seletividade para Gd 3+ ao longo de vários outros íons metálicos biologicamente importantes e de transição 9.
Existem dois inconvenientes deste ensaio que podem limitar a sua utilização sob algumas condições experimentais. Uma limitação é que o sensor não é específico para o Gd3 +; ele exibe uma resposta a outros iões lantanídeos (como Eu 3+ e Tb 3+) 9. No entanto, estes não são comumente encontrados iões em agentes de contraste ou os sistemas biológicos e, por conseguinte, a sua interferência são mínimas. O segundo ponto a salientar é que em concentrações mais elevadas (acima de ~ 10 M) de Gd 3 +, uma diminuição gradual da emissão de fluorescência Gd-sensor é observado. O efeito de têmpera por meio de iões lantanídeos é um fenómeno bem documentado 13 que também tem sido usada como uma técnica para a detecção e quantificação los 14. Enquanto isto limita a utilidade do sensor para a medição de altas concentrações de Gd 3+
Neste trabalho, foi descrita a utilização de uma técnica baseada em fluorescência para a detecção conveniente tóxico não quelatada Gd3 + em solução aquosa. Este ensaio destina-se a avaliação na fase inicial das à base de gadolínio pureza agente de contraste, especificamente durante a síntese e formulação de experiências in vitro. Com o atual crescimento da ressonância magnética no diagnóstico, um número crescente de agentes de contraste novos estão sendo continuamente desenvolvido e testado. O Gd-sensor baseado em aptâmero irá facilitar esse desenvolvimento, fornecendo um meio para detectar rapidamente a presença de concentrações sub-micromolares de que não reagiu ou Gd3 + dissociado em solução aquosa a pH ambiente. Além disso, uma vez que o sensor exibe uma reactividade cruzada com outros iões lantanídeos trivalente, a sua aplicação pode seralargado a estas áreas de pesquisa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
| Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
| Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
| 384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
| Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
| Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| 0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Micropipets | No specific manufacturer | ||
| Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
| Equipment | |||
| Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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