Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55224
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 2,4, 1,2
1Department of Biological Sciences, Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology, St. John Provindence - Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery, Beaumont Health System

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتشريح الحبل البشري السري (UC) والجنين عينة المشيمة إلى الحبل التبطين (CL)، وهلام وارتون (WJ)، الحبل السري المشيمة تقاطع (CPJ)، والمشيمة الجنين (FP) لعزل وتوصيف الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) باستخدام تقنية ثقافة يزدرع.

Abstract

الحبل السري البشري (UC) والمشيمة هي مصادر غير الغازية، بدائية وفيرة من خلايا انسجة الوسيطة (اللجان الدائمة) التي اكتسبت اهتمام متزايد لأنهم لا يشكلون أية مخاوف أخلاقية أو معنوية. الأساليب الحالية لعزل اللجان الدائمة من جامعة كاليفورنيا تسفر عن كميات قليلة من الخلايا التي تحتوي على إمكانيات انتشار متغيرة. منذ UC ​​هو الجهاز تشريحيا المعقدة، قد يكون راجعا إلى الخلافات في المناطق التشريحية من عزلتهم الاختلافات في خصائص MSC. في هذه الدراسة، ونحن أول تشريح عينات الحبل / المشيمة إلى ثلاث مناطق منفصلة التشريحية: UC، الحبل السري المشيمة تقاطع (CPJ)، والمشيمة الجنين (FP). ثانيا، منطقتين متميزتين، بطانة الحبل (CL) وهلام وارتون (WJ)، تم فصل. ثم تم استخدام تقنية زراعة يزدرع لعزل الخلايا من المصادر الأربعة. الوقت اللازم للثقافة الأولية من الخلايا من لل explants تختلف تبعا لمصدر من الأنسجة. وقعت ثمرة من الخلايا داخل 3-4 دايس من لل explants لجنة حماية الصحفيين، في حين لوحظ نمو بعد 7 - 10 أيام و 11 - 14 يوم من CL / WJ وFP إإكسبلنتس، على التوالي. كانت خلايا معزولة ملتصقة إلى البلاستيك وعرضها fibroblastoid التشكل والسطح علامات، مثل CD29، CD44، CD73، CD90، و CD105، على غرار نخاع العظم (BM) اللجان الدائمة -derived. ومع ذلك، فإن الكفاءة تشكيل مستعمرة من الخلايا المتنوعة، مع لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة وWJ-اللجان الدائمة التي تظهر كفاءة أعلى من BM-اللجان الدائمة. ميز اللجان الدائمة من جميع المصادر الأربعة في مكون الشحم، مكون للغضروف، والأنساب المكونة للعظم، مشيرا إلى أنهم كانوا متعدد القدرات. لجنة حماية الصحفيين متباينة-اللجان الدائمة أكثر كفاءة بالمقارنة مع مصادر MSC أخرى. وتشير هذه النتائج إلى أن لجنة حماية الصحفيين هي المنطقة التشريحية أقوى وينتج عددا أكبر من الخلايا، مع زيادة قدرات الانتشار والتجديد الذاتي في المختبر. وفي الختام، أشار تحليل مقارن للاللجان الدائمة من المصادر الأربعة التي جنة حماية الصحفيين هي مصدر واعدة أكثر من اللجان الدائمة لعلاج الخلايا، regenerativالبريد الطب، وهندسة الأنسجة.

Introduction

الخلايا الجذعية موجودة في مختلف أجهزة وأنسجة الجسم. أنها تمتلك إمكانات التجدد ولعب دورا رئيسيا في إصلاح الأنسجة التالفة في الجسم طوال فترة حياة الإنسان 1 و 2. وقد ولدت هذه قدرا كبيرا من الاهتمام في الخلايا الجذعية البالغة (مخولا لصيانة طائرات)، ولا سيما منذ ذلك الحين، على عكس الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، واستخدام مخولا لصيانة طائرات لا تشكل معضلات الأخلاقية والمعنوية. وأفادت العديد من الدراسات عزل مخولا لصيانة طائرات، مثل خلايا اللحمة المتوسطة اللحمية (اللجان الدائمة)؛ الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)؛ والأسلاف مختلفة، بما في ذلك مصادر الكبار مختلفة تتراوح من نخاع العظم (BM) إلى الأنسجة الدهنية (AT) ولب الأسنان 3 و 4 و 5. ومع ذلك، فإن عددا من مخولا لصيانة طائرات موجودة في معظم منافذ الكبار محدودة، وينطوي على عزلتهم عموما إجراء الغازية ومؤلمة مع الممكن المانحةالاعتلال الموقع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن عمر المانحة والإجهاد البيئي أيضا أن تلعب دورا هاما في تحديد نوعية والنشاط البيولوجي للخلايا معزولة 6 و 7 و 8. أيضا عرض مخولا لصيانة طائرات انتشار محدود وإمكانية التفريق خلال الثقافة في المختبر.

للتغلب على هذه العيوب من مخولا لصيانة طائرات الحالي، وقد جرت متابعة مصادر جديدة لعزل الخلايا الجذعية. وقد أدت هذه الجهود إلى عزل الخلايا الجذعية من مصادر فترة ما حول الولادة، بما في ذلك دم الحبل السري، نسيج الحبل، والمشيمة، والذي يحيط بالجنين السوائل 9. وقد اكتسبت هذه المصادر الانتباه بسبب سهلة وفيرة توافرها 10، 11، 12، 13. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على أنسجة ما حول الولادة غير جراحية، والخلايا الجذعية المستمدة من منهمأكثر بدائية من مخولا لصيانة طائرات معزولة عن مصادر الكبار 14 و 15. يتم عزل أنها من الأنسجة التي تم الحصول عليها عند الولادة، وتعتبر خضعت الحد الأدنى من التعديلات في الجينوم بسبب الشيخوخة والبيئية يؤكد 16.

ومع ذلك، فإن الخصائص ذكرت الخلايا الجذعية من مصادر فترة ما حول الولادة وقدرتها على تجديد الذات وكذلك التفريق تختلف على نطاق واسع 11 و 17. هذا يمكن أن يكون ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن الحبل السري البشري (UC) هو جهاز معقد. نحن نفترض أن مناطق منفصلة من النسيج ما حول الولادة خلق قطاعات محددة مسؤولة عن الاختلافات وطبيعة أكثر بدائية من هذه الخلايا الجذعية في مقارنة مخولا لصيانة طائرات المستمدة من مصادر غير ما حول الولادة. توضح هذه الدراسة تشريح عينات الحبل / المشيمة إلى ثلاث مناطق منفصلة التشريحية: UC، الحبل السري المشيمة تقاطع (CPJ)، وهود المشيمة الجنين (FP). تم تشريح UC الى مزيد من منطقتين: الحبل بطانة (CL) وجيلي وارتون (WJ). أظهر تحليل الخلايا المعزولة من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP أنهم جميعا عرضت التشكل fibroblastoid وأعرب عن علامات MSC، ولكنهم اختلفوا في من التجديد الذاتي وإمكانية التمايز. أظهرت الخلايا المشتقة لجنة حماية الصحفيين، ارتفاع معدل انتشار والتجديد الذاتي إمكانية مقارنة UC- والخلايا المشتقة FP، مما يجعلها مصدر واعد لعلاج الخلايا، والطب التجديدي، وهندسة الأنسجة.

Protocol

(ن = 3) تم الحصول على عينات من بالتراضي، والجهات المانحة الصحية من خلال مستشفى بومونت البنك الحيوي، رويال اوك، MI ومستشفى بروفيدانس، ساوثفيلد، MI تحت HIC- (الائتلاف # 2012-101) وIRB- (IRB # 820662- 3) على التوالي، وافق البروتوكولات ومعالجتها على النحو الذي أقره IBC (# 2858) من جامعة اوكلاند، روتشستر، MI.

1. معالجة السري الإنسان الحبل، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين والخلايا عزل

  1. جو معقم و مطهر جمع عينات من جامعة كاليفورنيا في حوالي 10 سم في الطول، بما في ذلك 5-6 سم متصلة جنة حماية الصحفيين و3-4 سم من FP. على الفور وضع كل عينة في وسط كوب جمع تحتوي على (DMEM مع 4500 ملغ / مل الجلوكوز وحل للمضادات الحيوية (0.1٪ جنتاميسين، 0.2٪ الستربتومايسين، و 0.12٪ البنسلين)) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى يتم نقلها إلى المختبر من قبل وضعه على الجليد في مربع الستايروفوم. معالجة العينة عند 4 درجات مئوية خلال 2-4 ساعة من جمعها.
  2. وضع العينة في 150 ملم طبق بيتري أبقى علىالجليد في خزانة السلامة البيولوجية. استخدام الإبر والمحاقن، وشطف عدة مرات مع الثلج الباردة PBS لإزالة جلطات الدم. تأكد من الاحتفاظ العينة الرطب مع PBS خلال تجهيز ولا اتركها لتجف. للحفاظ على العقم، والتعامل مع جو معقم و مطهر العينة باستخدام تعقيمها PBS والجراحية الأدوات في جميع أنحاء تجهيز العينات.
  3. تدرس بعناية عينة لتحديد مناطق تشريحية مختلفة: UC، لجنة حماية الصحفيين، وFP. أولا تشريح UC. عقد نهاية الجنين من جامعة كاليفورنيا مع ملقط وجعل بعناية أول خطوة من نوعها فقط في الجزء العلوي من لجنة حماية الصحفيين باستخدام زوج من مقص. جعل خفض الثاني أدناه لجنة حماية الصحفيين للفصل بين لجنة حماية الصحفيين (1،5-2،0 سم) من FP. ضع UC فصل، لجنة حماية الصحفيين، وFP في أطباق بتري منفصلة لمزيد من المعالجة.
  4. قطع UC طوليا مع مساعدة من مقص وملقط، وفضح تماما الأوعية الدموية والمحيطة WJ دون إزعاج ظهارة.
  5. تتخلص من WJ بعيدا عن الأوعية الدموية وظهارة الداخلية للsubamnionباستخدام مشرط، ومن ثم إزالة الأوعية الدموية. تأكد من جمع أي WJ حول الأوعية المتبقية تحت وحول الأوعية الدموية، ووضع WJ التي تم جمعها في طبق بيتري منفصل.
  6. جمع الأنسجة المتبقية، بطانة الحبل (CL)، في طبق بيتري منفصل.
  7. بعد فصل الأنسجة تمثل CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP، استبدال برنامج تلفزيوني مع 3-5 مل من محلول التربسين التجاري وخفض حدة كل من الأنسجة إلى 1- لقطع 2 ملم باستخدام المقص.
  8. احتضان قطعة نسيج في حل التربسين التجاري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 5٪ CO 2 حاضنة لعملية الهضم الجزئي للعينات. مراقبة الهضم الجزئي من خلال وضع تصور الافراج عن الخلايا باستخدام المجهر مرحلة التباين.
  9. للعينات هضمها جزئيا، إضافة حجم مساو من مستنبت (CM، DMEM مع 4500 ملغ / مل الجلوكوز و2 مم L-الجلوتامين، على أن تستكمل مع 10٪ مصل البشرية / FBS وحل للمضادات الحيوية (0.1٪ جنتاميسين، 0.2٪ الستربتومايسين ، و 0.12٪ عenicillin)) لتحييد الحل التربسين التجاري. نقل المحتوى إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي والسماح للقطعة نسيج هضمها جزئيا تستقر لمدة 3 دقائق.
  10. نضح بعناية طاف، بما في ذلك الخلايا واحدة (لا تعظيم كفاءة)، ولوحة 15-20 قطعة نسيج هضمها جزئيا على 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة وإضافة 9 مل من CM. احتضان عند 37 درجة مئوية، وعدم الإزعاج قوارير الثقافة ل2-3 أيام للسماح لتمسك قطعة نسيج.
    ملاحظة: الجزء المتبقي من عينات الأنسجة هضمها جزئيا يمكن أن يكون cryopreserved لعزل المستقبلية للخلايا.
  11. بعد 3 أيام من الحضانة، وتغيير CM والبحث في ظهور ثمرة من الخلايا من يزدرع على أساس يومي. وينبغي أن يكون نمو الخلايا واضح من إإكسبلنتس ملتصقة بعد 3-4 أيام، 7-10 أيام، و11-14 يوما من الحضانة لجنة حماية الصحفيين، CL / WJ، وFP، على التوالي. من هذه النقطة فصاعدا، تغيير CM بعد كل 3 أيام أوبحاجة.
    ملاحظة: نمو الخلية يصل 70٪ التقاء 7 - 10 يوما بعد نمو الخلايا الأولية من يزدرع. لاحظ أن قطعة نسيج غير ملتصقة لن تؤدي إلى أي ثمرة خلية حتى تلتزم البلاستيك. يجب توخي الحذر حتى لا تشعر بالانزعاج قارورة من أجل تجنب مفرزة من قطعة نسيج ملتصقة. إذا كان هناك أي قطعة عائمة بعد 3 أيام الأولى من زراعة، يمكن انقاذهم من قبل نقلهم إلى قارورة جديدة لمرفق.
    ملاحظة: عندما يصل نمو الخلايا من الأنسجة لل explants 70٪ التقاء، ينبغي subcultured. كما ذكر أعلاه، اللجان الدائمة من CL / WJ، FP، لجنة حماية الصحفيين وسيصل إلى نقطة التقاء في 10-14 أيام، 14-20 يوما، و17-24 يوما على التوالي.
  12. إلى ثقافة فرعية الخلايا تجاوزت من لل explants، فصل الخلايا باستخدام 1-2 مل من محلول التربسين التجاري / 75 سم 2 الثقافة قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تحييد مع 1-2 مل من CM وأجهزة الطرد المركزي 1500 x ج لمدة 3 دقائق. يصنعتأكد من تدوير القارورة مع إضافة التربسين حتى لتنتشر في جميع أنحاء.
  13. ملاحظة: تعتبر الخلايا مكعبات مرور 0 (P0)، وسيتم تعليق في CM، عدها، وsubcultured في مناطق ذات كثافة البذر من 1 × 10 4 / سم 2 لتضخيم، وتوصيف، والحفظ بالتبريد. الخلايا الزائدة يمكن cryopreserved في P0.

2. تميز خلايا معزولة

  1. تشكيل مستعمرة الكفاءة (CFE) فحص
    1. معطف الأطباق 100 ملم بيتري (مساحة 60 سم 2) مع الجيلاتين 0.1٪ لمدة 30 دقيقة ووضعها في الحاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: على الرغم من أن ليس من الضروري، الجيلاتين طلاء يحسن الالتزام الخلية.
    2. إزالة الجيلاتين الزائدة والبذور لوحة المغلفة مع الخلايا P0 بتركيز 1.63 خلية / سم 2. إضافة 3 مل من CM واحتضان في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية.
    3. رصد لوحات المصنفة للنمو نسيليبواسطة المجهر الضوئي (LM) وتغيير المتوسط ​​كل 3 أيام.
    4. بعد 10-14 يوما من نمو الخلايا، وغسل أطباق بتري مرتين مع برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة. يرجى ممارسة الحذر من خلال ارتداء القفازات والنظارات أثناء الاستخدام.
    5. وصمة عار على الخلايا الثابتة بنسبة 0.1٪ البنفسجي وضوح الشمس لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وشطف لوحة مع ماء الصنبور حتى ذهب وصمة عار الزرقاء غير منضم.
    6. حساب عدد المستعمرات التي تتألف من 50 على الأقل الخلايا باستخدام LM.
  2. التعبير عن علامات سطح الخلية
    1. ثقافة الخلايا المعزولة إلى 70٪ التقاء، تنأى مع الحل التربسين التجارية، وغسل وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 3 دقائق. تعليق الخلايا في المخزن FACS (1X PBS مع 2٪ FBS و 0.1٪ أزيد الصوديوم).
      ملاحظة: أزيد الصوديوم السامة. يرجى ممارسة الحذر من خلال ارتداء القفازات والنظارات أثناء الاستخدام.
      2. 6) مع FITC- أو المسمى APC-MSC-محددة الأجسام المضادة (الأجسام المضادة FITC مترافق ضد: CD44 CD90 وأو الأجسام المضادة APC مترافق ضد: CD29، CD73، و CD105) في المخزن FACS لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
    2. الطرد المركزي الخلايا الملون في 670 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف، و resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة FACS.
    3. تحليل الخلايا ملطخة الأجسام المضادة باستخدام FACS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

3. التمايز المحتملة

  1. التمايز مكون الشحم
    1. ثقافة الخلايا المعزولة إلى 70٪ التقاء، تنأى مع الحل التربسين التجارية، وغسل وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 3 دقائق.
    2. في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية، والثقافة الخلايا بتركيز 100،000 الخلايا بشكل جيد / لوحة 6 جيدا تحتوي على 2 مل من CM.
    3. بعد 24 ساعة، واستبدال CM مع adipogشبكة naric المتوسطة التمايز (0.5 ميكرومتر إيسوبوتيل-الميثيل، 1 ميكرومتر ديكساميثازون، 10 ميكرومتر الأنسولين، و 200 ميكرومتر إندوميثاسين)، واحتضان. تغيير متوسطة التمايز كل 3 أيام أو في كثير من الأحيان حسب الحاجة.
    4. بعد 3 أسابيع من الحضانة، وإصلاح الخلايا مع 2 مل من 4٪ امتصاص العرق لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وصمة عار مع النفط الأحمر O للكشف عن إنتاج قطرات الدهون من أجل تحليل للتمايز مكون الشحم.
      ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة. يرجى ممارسة الحذر من خلال ارتداء القفازات والنظارات أثناء الاستخدام.
    5. علاج الخلايا الثابتة مع 60٪ الأيزوبروبانول (2 مل / بئر لوحة 6 جيدا) لمدة 5 دقائق.
    6. استبدال الأيزوبروبانول مع 2 مل من زيت الأحمر O وصمة عار (فلتر 3 أجزاء النفط الأحمر O وصمة عار و 2 أجزاء من الماء المقطر)، واحتضان ل15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل 3-4 مرات مع ماء الصنبور لإزالة أي بقع غير منضم .
    7. تصور قطرات الدهون الملطخة الأحمر، مما يدل على النسب خلية مكون الشحم، شالغناء LM.
  2. التمايز مكون للغضروف
    1. ثقافة عزل الخلايا إلى 70٪ التقاء، تنأى مع الحل التربسين التجاري، ويغسل مع برنامج تلفزيوني.
    2. لتكوير خلايا لتحريض مكون للغضروف، الطرد المركزي 250،000 خلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل مع 2 مل من CM في 11000 x ج لمدة 8 دقائق. احتضان الكريات بين عشية وضحاها في 37 ° C.
    3. بعد 24 ساعة، استبدال بلطف CM مع المتوسطة المولدة للغضروف التمايز (20 نانوغرام TGFβ1، 10 نانوغرام الأنسولين، و 100 نانومتر ديكساميثازون، و 100 ميكرومتر حمض الاسكوربيك) من دون إزعاج بيليه والاستمرار في الحضانة. تغيير متوسطة التمايز كل 3 أيام أو في كثير من الأحيان حسب الحاجة.
    4. بعد 3 أسابيع من الحضانة، وإصلاح الخلايا مع 2 مل من 4٪ امتصاص العرق لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Cryosection وصمة عار مع 1٪ طولويدين الأزرق لفحص وجود أو إنتاج المصفوفة خارج الخلية من أجل تحديد التمايز مكون للغضروف.
      ملاحظة: السلطة الفلسطينيةraformaldehyde غير سامة. يرجى ممارسة الحذر من خلال ارتداء القفازات والنظارات أثناء الاستخدام.
    5. لcryosectioning، وغسل بلطف الكريات الخلايا تحصد مرتين مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 1 مل من 4٪ امتصاص العرق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة. يرجى ممارسة الحذر من خلال ارتداء القفازات وملابس العين أثناء الاستخدام.
    6. غسل الكريات مرتين مع PBS لإزالة امتصاص العرق ونقل الى حل السكروز / أكتوبر (1: 2، 20٪ السكروز: أكتوبر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة للسماح الحل لتتسرب تماما في الكريات الخلية؛ وهذا سوف يسمح باجتزاء على نحو سلس.
    7. نقل الكريات في قوالب أكتوبر تجميد القوالب في -20 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة وcryosection حول 10-12 أقسام ميكرون سميكة من الكريات الخلايا باستخدام ناظم البرد لطولويدين تلطيخ الأزرق.
    8. غسل cryosections بلطف مع PBS. إضافة بضع قطرات من 1٪ طولويدين وصمة عار الزرقاء، التي تغطي الأجزاء بيليه على الشريحة تماما. والمؤتمر الوطني العراقيأوباتي لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    9. تغسل الشرائح مع PBS عدة مرات ليزيل اللون. إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق غمس الشريحة في حل الكحول على أساس حمض الهيدروكلوريك (95٪ كحول + 0.5 مل من حمض الهيدروكلوريك) عدة مرات حتى يزول اللون الأزرق غير منضم. جبل أقسام الملون باستخدام 100 ميكرولتر من تصاعد حل للحفاظ على المدى الطويل من الشرائح.
      ملاحظة: وتلطيخ الأزرق الأقسام يدل على وجود الجليكوسامينوجليكان وبروتينات سكرية وسيكون ملاحظتها باستخدام LM.
  3. التمايز عظمي المنشأ
    1. مرة أخرى، ثقافة الخلايا المعزولة إلى 70٪ التقاء، تنأى مع الحل التربسين التجارية، وغسل وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 3 دقائق.
    2. ثقافة فرعية الخلايا بتركيز 100،000 خلايا جيدا / من 6 لوحات جيدا تحتوي على 2 مل من CM في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد 24 ساعة، واستبدال CM مع متوسط ​​التمايز عظمي المنشأ (0.1 μ؛ M ديكساميثازون، 10 ميكرومتر β-سكرولي، و 50 ميكرومتر أسكوربات الفوسفات) والاستمرار في الحضانة. تغيير متوسطة التمايز كل 3 أيام أو في كثير من الأحيان حسب الحاجة.
    4. بعد 3 أسابيع من الحضانة، وإصلاح الخلايا مع 2 مل من 4٪ امتصاص العرق لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وصمة عار مع الآليزارين الحمراء للكشف عن وجود ترسب الكالسيوم من أجل تحديد التمايز عظمي المنشأ.
      ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة. يرجى ممارسة الحذر من خلال ارتداء القفازات والنظارات أثناء الاستخدام.
    5. يغسل بلطف الخلايا الثابتة مرتين مع الماء المقطر وعلاج مع 2٪ بقعة حمراء الصبغ الأحمر (2 مل / بئر في لوحة 6 جيدا) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    6. إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق غسل بلطف بماء الصنبور بحيث دائع الكالسيوم لا طرد.
    7. تصور ودائع الكالسيوم الحمراء الملطخة باستخدام LM.

4. الكمية الناسخ العكسي البلمرة تشافي رد الفعل (QRT-PCR) تحليل

  1. ثقافة الخلايا المعزولة إلى 70٪ التقاء، تنأى مع الحل التربسين التجارية، وغسل، وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 3 دقائق لعزل الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية.
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار FBS، ثم انتقل إلى عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم تنقية RNA التجارية، في أعقاب تعليمات الشركة الصانعة.
  3. تنقية الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن طريق التعامل مع الدناز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام thermocycler. توليف [كدنا باستخدام عدة التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  4. إعداد ثلاث نسخ ردود فعل 10 ميكرولتر PCR في لوحة 96-جيدا، مع كل رد فعل تحتوي على 5 ميكرولتر من-SYBR الأخضر PCR SUPERMIX. 3 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. 0.5 ميكرولتر من كل التمهيدي، إلى الأمام وعكس. و1 ميكرولتر من (01:10) [كدنا المخفف.
  5. أداء PCR تحت المعلمات التالية: 10 دقيقة في 98 ° C، تليها 44 دورات من 30 ثانية كل في 98 و# 176؛ C، 20 ثانية عند 60 ° C، و30 ثانية في 72 ° C.
  6. تطبيع التضخيم من الجينات المستهدفة لجينات مرجعية، GAPDH وβ-الأكتين. يتم سرد تسلسل التمهيدي في الجدول 1.

5. التحليل الإحصائي

  1. تنفيذ كافة التحليلات باستخدام البرامج الإحصائية. تقديم البيانات كمتوسط ​​± SEM. (** ص ≤ 0.01 و * ص ≤ 0.05) اعتبرت النتائج مع القيمة ص دالة إحصائيا.

Representative Results

تشريح وعزل الخلايا من الحبل السري البشري، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين

تتكون أنسجة ما حول الولادة من ثلاث مناطق تشريحية منفصلة. الأول هو UC، تحتوي على اثنين من الشرايين والأوردة واحد، فضلا عن منطقتين متميزتين: CL (بطانة الخارجي من الحبل) وWJ (مادة تشبه الهلام المحيطة الأوعية الدموية داخل الحبل). والثاني هو لجنة حماية الصحفيين (العلاقة بين الحبل السري والمشيمة)، والثالث هو FP، وهو مباشرة بعد لجنة حماية الصحفيين (الحبل يدخل في المشيمة، والتي تعلق على جدار الرحم للأم). ويصور التخطيطي للبروتوكول عزل الخلايا من أنسجة ما حول الولادة في الشكل 1. أربعة مصادر CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP-التعرف بشكل واضح وتم فصل لعزل الخلايا من لل explants، كما هو مبين في الشكل 2. تيتم رصد انه مظهر ثمرة خلية من ثقافات يزدرع بشكل روتيني وتسجيلها بواسطة LM. وقد لوحظت خلايا fibroblastoid ملتصقة بعد 3-4 أيام من زرع لل explants لجنة حماية الصحفيين. الخلايا مع التشكل مماثلة ظهرت 7-8، 9-10، و11-14 يوما بعد زراعة لل explants WJ، CL، وFP، على التوالي. وصفت ثمرة من الخلايا من لل explants التي تمثل مصادر مختلفة (CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP) في الشكل 3A. واعتبرت هذه الخلايا كما P0. عندما subcultured الخلايا P0، يبدو أنها تنمو متطابق بسلالة، وعرض التشكل fibroblastoid مماثلة لتلك التي من BM-اللجان الدائمة. ومع ذلك، فإنها أظهرت التباين في الوقت السكان مضاعفة، تتراوح بين 32 ساعة إلى 94 ساعة للخلايا من لجنة حماية الصحفيين وFP، كما هو مبين في الشكل 3B و C. لديها خلايا من WJ وCL مرات مضاعفة مماثلة وسطي لجنة حماية الصحفيين وFP. أشارت تحليلات أخرى من الخلايا P0 أنها تختلف أيضا في القوات التقليدية في أوروبا، والتي تتراوح 16-92 المستعمرات.لديها خلايا من لجنة حماية الصحفيين أعلى (92)، في حين أن خلايا FP أدنى (16) CFE. لديها خلايا من CL وWJ القيم القوات التقليدية في أوروبا من 59 و 80 مستعمرة، على التوالي (الشكل 4A-C). وكانت الخلايا من CL القيم القوات التقليدية في أوروبا على غرار BM-اللجان الدائمة. وتشير هذه النتائج إلى أن الخلايا المشتقة من لجنة حماية الصحفيين لديهم أعلى التكاثري والتجديد الذاتي القدرات.

Immunoprofile من خلايا معزولة

وقد تم التحقيق خلايا معزولة عن CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP للتعبير عن علامات خلية محددة. عرض خلايا P3-5 التعبير الإيجابي عن اللجان الدائمة علامات مثل CD29، CD44، CD73، CD90، و CD105 (الشكل 5A وB). ومن المعروف أن هذه الخلايا أيضا للتعبير عن الطبقة التوافق النسيجي الرئيسية I علامة، HLA-ABC، ولا تعبر عن الدرجة الثانية علامة، HLA-DR 3. النسب المئوية للخلايا إيجابية لعشرجنوب شرقي كانت علامات مختارة من جميع المصادر الأربعة مماثلة لتلك التي عبر عنها القياسية BM-اللجان الدائمة. ومع ذلك، تشير النسب MFI أن WJ- والخلايا المشتقة لجنة حماية الصحفيين، تشبه تقريبا، بل وأصبحت أعلى من الكلورين والخلايا المشتقة FP (الشكل 5C). ومن المثير للاهتمام، على الرغم من اختلاف القيم القوات التقليدية في أوروبا، وأعرب عن الخلايا من مصادر مختلفة مستويات مماثلة من علامات MSC. واستنادا إلى نتائج علامات سطح الخلية، واعتبرت الخلايا المعزولة من جميع المصادر الأربعة اللجان الدائمة. كشف مزيد من التحليل لهذه الخلايا أنها أيضا تعبير عن الجينات تعدد القدرات، OCT4، NANOG، KLF4، وSOX2، كما هو مبين في الشكل 5D. وكان لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة أسمى تعبير عن علامات تعدد القدرات، تليها WJ-، الكلورين وFP-اللجان الدائمة.

إمكانية التفريق بين اللجان الدائمة المعزولة

المعيار الذهبي للتميز اللجان الدائمة هو قدرتها على زراعية مختلفةrentiate في الأنساب متعددة. وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها اللجان الدائمة معزولة من جميع المصادر ما حول الولادة التفريق بسهولة إلى أنواع الخلايا مكون الشحم، المولدة للغضروف، والمكونة للعظم. أنتجت المشتقات مكون الشحم قطرات الدهون التي كانت ملطخة بشكل إيجابي مع النفط الأحمر O، كما هو مبين في الشكل 6A. تظاهر طولويدين تلطيخ الأزرق للمشتقات المولدة للغضروف من اللجان الدائمة وجود البروتيوغليكان وبروتينات سكرية التي ساعدت في إنتاج المصفوفة خارج الخلية (الشكل 6B). المشتقات المكونة للعظم من اللجان الدائمة الملون بشكل إيجابي مع أحمر الصبغ الأحمر تشير إلى وجود ودائع الكالسيوم المشاركة في تمعدن العظام، كما هو مبين في الشكل 6C.

كما هو متوقع، أظهر تحليل النسخي من اللجان الدائمة معزولة من جميع المصادر التمايز trilineage (الشكل 6D -F). ومع ذلك، فإن وعاءential التمايز تختلف تبعا لمصدر من اللجان الدائمة. كان مشتقات مكون الشحم من WJ-اللجان الدائمة 2 أضعاف مستويات التعبير أكبر من الجينات مكون الشحم مختارة (CEBPβ، FABP4، وPPARγ) مقارنة مع لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة. كان الكلورين وFP-اللجان الدائمة أدنى التعبير عن هذه الجينات. في حالة التمايز مكون للغضروف، أعرب المشتقات لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة اختيار الجينات المولدة للغضروف (SOX9 وCOL2) 50 أضعاف أعلى من المشتقات WJ- وFP-اللجان الدائمة. مماثلة لتمايز مكون الشحم سوء CL-اللجان الدائمة، كان لديهم أدنى الإمكانات المولدة للغضروف، كما هو واضح من ادنى التعبير عن الجينات المولدة للغضروف. كما أظهرت لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة أعلى إمكانات المكونة للعظم التمايز، كما يدل على ذلك مستويات النص أعلى 2 أضعاف من الجينات المكونة للعظم مختارة (COL1، OPN، وOCN). ومع ذلك، كان التعبير عن RUNX2 السلف علامة أعلى في المشتقات المكونة للعظم من WJ-اللجان الدائمة، مشيرا إلى أن هذه الخلايا كانت بطيئة في الاستجابة لشروط التمايز. مرة أخرى، أظهرت CL-اللجان الدائمة الفقراءالتمايز في النسب عظمي المنشأ. وتشير هذه النتائج إلى أن لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة واللجان الدائمة WJ-عرض أكبر إمكانية التمايز من الكلورين وFP-اللجان الدائمة. كان CL-اللجان الدائمة أدنى القدرة على التمايز إلى المشتقات trilineage.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لعزل الخلايا من الحبل السري الإنسان الحبل، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين. فحص العينة التي تم جمعها والمضي قدما في تشريح. الخطوة 1. تشريح وفصل عينة النخاع / المشيمة إلى ثلاث مناطق منفصلة يدويا: الحبل السري (UC)، الحبل السري المشيمة تقاطع (CPJ)، والمشيمة الجنين (FP). فصل مناطق متميزة اثنين من UC في بطانة الحبل (CL) وارتون جيلي (WJ) باستخدام مقص وملقط. الخطوة 2. قطع كل من أنسجة تشريح بشكل منفصل في 1- رس قطع 2 ملم باستخدام مقص وهضم جزئيا القطع. الخطوة 3. الثقافة قطعة نسيج. الخطوة 4. عزل الخلايا من لل explants التي كتبها التربسين العلاج. ثقافة فرعية وتميز الخلايا المعزولة. الخطوة 5. خلايا معزولة، وتميزت يمكن تضخيمها واستخدامها في مختلف التطبيقات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تشريح والثقافة من إإكسبلنتس من السري الإنسان الحبل، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين. أظهرت هي ثلاث مناطق مختلفة التشريحية للعينة النخاع / المشيمة: UC (انقسام في CL وWJ)، لجنة حماية الصحفيين، وFP، وكذلك الشرايين والأوردة المرتبطة بها. CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين،وفصلت FP عن طريق تشريح اليدوي لعزل الخلايا من لل explants. كل إقليم من أقاليم تشريح انقطع بشكل منفصل إلى أجزاء صغيرة والمثقف في 75 سم 2 لوحات باستخدام 9 مل من CM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: مورفولوجيا الخلايا المعزولة من السري الإنسان الحبل، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين. (A) ثمرة خلية من لل explants من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP، كما تصور من قبل LM. أظهرت (B) ثقافة ثانوية من الخلايا المعزولة من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وإإكسبلنتس FP التشكل fibroblastoid. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون (التكبير: 4X). (C) السكان مضاعفة وقت رانه عزل الخلايا من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP. استخدمت BM-اللجان الدائمة كمعيار. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​القياسات ثلاث نسخ (** ص ≤ 0.01 و * ص ≤ 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: كفاءة خلايا من الحبل السري الإنسان الحبل، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين تشكيل مستعمرة. وتصور (A) نمو الخلايا (P0) معزولة عن CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP، مطلي في مناطق ذات كثافة نسيلي 1.63 خلية / سم 2، من خلال LM. (B) Photomicrographs الخلايا ملطخة الكريستال البنفسجي يعرض القدرات تشكيل مستعمرة. (C) مستعمرة واحدة من الخلايا الملون الطرافةح الكريستال البنفسجي. تمثل الحانات مقياس 100 ميكرون (التكبير: 4X). (D) التمثيل البياني لعدد من المستعمرات تشكلت من الخلايا المشتقة من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP. استخدمت BM-اللجان الدائمة كمعيار. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​القياسات ثلاث نسخ (** ص ≤ 0.01 و * ص ≤ 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: تحليل علامات MSC التي أعرب عنها الخلايا المعزولة من السري الإنسان الحبل، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين. (A) التعبير عن علامات سطح الوسيطة (CD29، CD44، CD73، CD90، و CD105) من قبل خلايا من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP، وردع تستخرجه التدفق الخلوي. (B و C) التمثيل البياني للنسب المئوية للخلايا إيجابية ونسب متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) لعلامات سطح الوسيطة المحدد. تم حساب نسب MFI بقسمة قيمة MFI من علامة (الناتجة عن البرمجيات على أساس كثافة مضان من سكان الخلية المغلقة) من قيمة التمويل الأصغر من نمط إسوي. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط ​​القياسات ثلاث نسخ. (D) التعبير عن الجينات تعدد القدرات (OCT4، NANOG، KLF4، وSOX2) من قبل خلايا من CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وFP، على النحو الذي يحدده QRT-PCR. (** ص ≤ 0.01 و * ص ≤ 0.05). تم تطبيع التعبير الجيني لGAPDH وβ-الأكتين، وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​القياسات ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (6)
الشكل 6: Multilineage تمايز اللجان الدائمة المعزولة من الحبل السري البشري، مفرق الحبل المشيمة، والمشيمة الجنين. وحضنت (A) خلايا في متوسطة التمايز مكون الشحم لمدة 3 أسابيع وملطخة النفط الأحمر O، تشير إلى وجود قطرات الدهون. وحضنت (B) الكريات الخلايا في متوسطة التمايز مكون للغضروف لمدة 3 أسابيع. كانت ملطخة cryosections النسيجي الثقافات بيليه مع طولويدين الأزرق، وعرض وجود الجليكوسامينوجليكان. وحضنت (C) الخلايا في متوسطة التمايز عظمي المنشأ لمدة 3 أسابيع وملطخة الآليزارين الأحمر، وعرض إنتاج رواسب الكالسيوم مما يشير إلى تمعدن العظام. وقد تم الحصول على جميع الصور التي LM. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون (التكبير: 4X). BM-اللجان الدائمة نحنإعادة استخدامها كمعيار. (DF) التعبير عن جينات منتقاة (CEBPβ، FABP4، وPPARγ، SOX9، ACAN، وCOL2، وCOL1، RUNX2، OPN، وOCN تمثل التفريق بين اللجان الدائمة في مكون الشحم، مكون للغضروف، والأنساب المكونة للعظم، على التوالي)، وتحديد من خلال تحليل QRT-PCR (** ص ≤ 0.01 و * ص ≤ 0.05). تم تطبيع التعبير الجيني لGAPDH وβ-الأكتين، وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​القياسات ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جينة تسلسل التمهيدي طول المنتج
OCT4 إلى الأمام، CCCCTGGTGCCGTGAA 97
عكس GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ td>
NANOG AAAGAATCTTCACCTATGCC Forward- 110
GAAGGAAGAGGAGAGACAGT العكسية
KLF4 Forward- CGAACCCACACAGGTGAGAA 94
العكسية TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC
SOX2 TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA Forward- 75
العكسية CTGGGGCTCAAACTTCTCTC
SOX9 Forward- AGCGAACGCACATCAAGAC 85
العكسية CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
COL2 Forward- CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252
العكسية CACCAGGTTCACCAGGATTG
ACAN AGCCTGCGCTCCAATGACT Forward- 103
COL1 AAGGTCATGCTGGTCTTGCT Forward- 114
العكسية GACCCTGTTCACCTTTTCCA
RUNX2 Forward- TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111
العكسية AGTGACCTGCGGAGATTAAC
OPN Forward- CATACAAGGCCATCCCCGTT 112
العكسية TGGGTTTCAGCACTCTGGTC
OCN TAAACAGTGCTGGAGGCTGG Forward- 191
العكسية CTTGGACACAAAGGCTGCAC
CEBPβ Forward- TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94
العكسية AGCTTTCTGGTGTGACTCGG
FABP4 TTAGATGGGGGTGTCCTGGT Forward- 158
العكسية GGTCAACGTCCCTTGGCTTA
PPARγ Forward- GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74
العكسية ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG
GAPDH ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG Forward- 101
العكسية GCCATCACGCCACAGTTTC
الأكتين AATCTGGCACCACACCTTCTAC Forward- 170
العكسية ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC

الجدول 1: قائمة متواليات التمهيدي الإنسان المستخدمة في هذه الدراسة.

Discussion

التطورات الحديثة في مجال أبحاث الخلايا الجذعية تحسن ليس فقط في فهم عمليات التنمية الأساسية ولكن أيضا توفير فرص واعدة لاستخدام الخلايا الجذعية في التكنولوجيا الحيوية والأدوية والعلاج بالخلايا، والطب التجديدي، وتطبيقات هندسة الأنسجة 18 و 19 و 20. في حين المجالس الاقتصادية والاجتماعية المحفزة معزولة من الأجنة المبكرة الواعدة، فإنها تواجه تحديات تقنية والمعضلات الأخلاقية 21، 22، 23. الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) مشتقة من خلايا بالغة توفر بديل، لكنها تواجه أيضا مشاكل تقنية والسلامة مماثلة 23. وعلاوة على ذلك، iPSCs قد لا تكون مستقرة وراثيا، أو قد يكون خضع لتغيرات وراثية، مما يحد من استخدامها العلاجي. كما تم الإبلاغ عن الخلايا الجذعية في مجموعة متنوعة من تيس ما بعد الولادةيقاضي والأعضاء. المصادر الأكثر شيوعا من هذه مخولا لصيانة طائرات ونخاع العظام، والدهنية، والأنسجة العضلية. ومع ذلك، مخولا لصيانة طائرات من مصادر بعدها محدودة إمكانات النمو والتمايز 24 و 25. كما أنها تعاني بسبب الشيخوخة والتعرض للضغوط البيئية وليست فعال للتطبيقات العلاجية 26، 27، 28 دائما هكذا. وقد أدى هذا لنا والآخرين للبحث عن مصادر جديدة للخلايا الجذعية التي هي أكثر سذاجة من مخولا لصيانة طائرات.

قمنا بدراسة مصادر فترة ما حول الولادة للخلايا الجذعية البدائية كبديل للمخولا لصيانة طائرات. في هذا التقرير، ونحن نقدم طريقة موثوق بها وقوية، وبسيطة لعزل اللجان الدائمة الإنسان من عينات الحبل / المشيمة. بالمقارنة مع المصادر والأساليب الأخرى المستخدمة لعزل مخولا لصيانة طائرات، وهذه الطريقة توفر وسيلة فعالة وغير الغازية لعزل كميات كبيرة من المهزومةاللجان الدائمة ذات جودة ساعة. أنه يبرز كذلك نمو وتمايز أعلى إمكانات اللجان الدائمة في الفترة المحيطة بالولادة مقارنة اللجان الدائمة من مصادر الكبار مثل BM.

وUC ربط الجنين إلى المشيمة هو عضو كبير مع المناطق التشريحية المتميزة، بما في ذلك اثنين من الشرايين، الوريد، CL، وWJ (الأنسجة المحيطة الأوعية الدموية). وأفادت العديد من الدراسات عزلة اللجان الدائمة من الحبل كله، وWJ، أو المشيمة، مع نمو متغير والتمايز الامكانيات 25 و 29. ومع ذلك، حتى الآن، وقد حققت أي دراسة على نحو فعال ومقارنة الخلايا من المناطق التشريحية مختلفة من عينة النخاع / المشيمة. ونحن نقدم هنا طريقة منهجية وبسيطة لتشريح UC، لجنة حماية الصحفيين، ومتصلة FP لعزل اللجان الدائمة. وتبين لنا أيضا على بروتوكول شامل وبسيط لتوصيف وتقييم نوعية الخلايا المعزولة من خلال تحديد مقدرات انتشارهاities، فضلا عن تجديد الذات والتمايز إمكاناتها. هذا الأسلوب هو استنساخه وينتج كمية كبيرة من اللجان الدائمة ذات جودة متفوقة.

لقد وجدنا أن عملية الهضم الجزئي للقطعة نسيج 1-2 ملم في حجم يستخدم الحل التربسين التجاري خلايا أسفرت بتكاثر من لل explants، في حين كان الهضم الكامل من الأنسجة في الخلايا وحيدة المحصول الضعيف من الخلايا المعزولة. ومع ذلك، ذكرت إحدى الدراسات أن إإكسبلنتس الأنسجة أكبر من UC تقريبا كانت 10 ملم في حجم الأمثل لزنزانة انفرادية 30. وفي المقابل، أشارت دراسة أخرى إلى أن طريقة يزدرع الأنسجة أسفر عن دورة الثقافة أطول وانخفاض العائد من خلايا مقارنة مع انزيم طريقة الهضم 31. في تقارير سابقة، علاج الحبل الأنسجة مع كولاجيناز II وهيالورونيداز، بشكل منفصل أو بعد التربسين، وقد أجريت لعزل خلايا الحبل السري 32 و 33 34. ليس فقط هناك قدر كبير من التباين في أساليب هضم أنسجة الحبل قبل زراعة، ولكن يبدو أيضا الخلايا المعزولة لتكون متجانسة. استخدام الإنزيمات قاسية لفترات زمنية أطول قد يقل غشاء الخلية، مما يؤثر على التزام الخلية والانتشار. وأظهرت نتائج هذه الطريقة أن يهضم جزئيا إإكسبلنتس أنسجة ما حول الولادة قدمت ثمرة من الخلايا دون تسبب تلف الخلايا واسعة النطاق، حافظت قدرتها على البقاء، وأسفرت عن كميات أكبر من السكان متجانسة من اللجان الدائمة.

في حين أن بروتوكول لتشريح وعزل الخلايا من لل explants غير واضحة، بعض الخطوات قد يثبت أن يكون تحديا. أولا، ضمان الالتزام يزدرع عن طريق السماح تمسكهم سطح القارورة الثقافة. وهذا يمكن أن يسهل باستخدام كمية صغيرة من المتوسط، لا تغطي سوى قطعة نسيج لح 2 الأولى للثقافة، ثم إضافة بعناية المتوسطة المتبقية. Second، والحد من عدد من إإكسبلنتس إلى أقل من 15 في قارورة T75. مساحة صغيرة جدا بين القطع أو قطع كثيرة جدا في قارورة والمثبطة لنمو الخلايا. ينبغي أن تنقل الثالثة، وقطع الأنسجة التي لا تلتصق على سطح القارورة ثقافة بعد 3 أيام من الحضانة إلى قارورة جديدة لتمسك وزراعة. الرابعة، وقطع الأنسجة لتكون مثقف يجب أن تكون خالية من الحطام الخلية، والتي يمنع المرفق. خامسا: إن زراعة من القطع الكبيرة تتطلب المزيد من المتوسطة ولا تحسين كفاءة الخلايا ثمرة. وأخيرا، ومراقبة الثقافات يزدرع عن كثب، خاصة بعد ظهور ثمرة الخلية، والخلايا قد تصبح بسرعة متموجة ويفرق تبعا لمصدر الأنسجة. وتشمل عدد قليل من القيود المفروضة على تقنية نقص الخبرة في تشريح عينات لفصل CL، WJ، لجنة حماية الصحفيين، وتنظيم الأسرة؛ وصغر حجم العينة، مما أدى إلى العائد WJ منخفضة؛ ويطلب تأخير تجهيز العينات التي سيتم تجهيزها خلال 2-4 ساعة من جمع لآفومعرف خسارة في الانتعاش الخلية.

المعيار الذهبي لتوصيف اللجان الدائمة هو القدرة على التمسك البلاستيك، وتشكيل النمط الظاهري أرومي ليفي، والتمايز إلى أنساب متعددة. وهذه هي أيضا المعايير المستخدمة عادة لتحديد اللجان الدائمة كما وصفها ISCT 35. في هذه الدراسة، كانت خلايا معزولة من جميع المصادر الأربعة ملتصقة إلى البلاستيك، وكان التعبير الإيجابي عن علامات MSC (CD29، CD44، CD73، CD90، و CD105)، ولكن التعبير السلبي للCD45 علامة المكونة للدم. وبالإضافة إلى ذلك، أعربوا عن مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) من الدرجة الأولى ولكن كانت سلبية لفئة HLA II. بالمقارنة مع BM-اللجان الدائمة، كانت WJ- والخلايا المشتقة لجنة حماية الصحفيين، أعلى. هذه النتائج تتفق مع التقارير السابقة UC-المستمدة اللجان الدائمة 33، 36، 37، 38. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت نتائجنا أن الكلورين، WJ-، CPJ-، أعرب FP-اللجان الدائمة pluriالجينات رجولية مثل OCT4، NANOG، وSOX2. ومع ذلك، كان التعبير عنها أقل من المجالس الاقتصادية والاجتماعية، كما ذكرت سابقا 39. وتأتي هذه النتائج أيضا في اتفاق مع دراسة سابقة أن ذكرت التعبير عن علامات تعدد القدرات في الخلايا المشتقة من فترة ما حول الولادة 40. ومن المثير للاهتمام، لوحظ أن التعبير عن علامة المحفزة كان أعلى في لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة مما كانت عليه في خلايا معزولة من مصادر أخرى. كما لوحظ أن UC-اللجان الدائمة عرضت أكبر إمكانية التجديد الذاتي من BM-اللجان الدائمة 41. ومن المثير للاهتمام، على الرغم من التشابه في الصفات المظهرية، كانت الخلايا المعزولة من المصادر الأربعة القيم CFE المتغيرة. ومع ذلك، باستثناء FP-MSC، كان لديهم كل القيم القوات التقليدية في أوروبا أفضل من BM-اللجان الدائمة. وكان لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة أعلى قيمة القوات التقليدية في أوروبا ومعدل انتشار بالمقارنة مع جميع اللجان الدائمة الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، عرض WJ- ولجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة إمكانات التمايز أعلى من BM-اللجان الدائمة. أظهرت CL-اللجان الدائمة أقل التمايزكان الإمكانية إلى كل الأنساب ثلاثة (أي مكون الشحم، مكون للغضروف، والمكونة للعظم)، في حين أن لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة أعلى إمكانات trilineage التمايز وFP-اللجان الدائمة عرض أقل إمكانية التمايز مكون الشحم.

وفي الختام، أظهرت نتائجنا أن نوعية وكمية من اللجان الدائمة معزولة اختلفت بين المصادر الأربعة في العينة الحبل / المشيمة. وكان لجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة أكثر قدرة انتشار وزيادة إمكانية التجديد الذاتي. وكانت قوية في المفاضلة الخاصة بهم في أنواع الخلايا trilineage أيضا. بسبب ضيق الوقت مضاعفة منخفضة، ويمكن للجنة حماية الصحفيين، اللجان الدائمة تكون بسرعة توسعت 1000 أضعاف وتستخدم لمكافحة المخدرات والإنتاجية العالية أو فحص مادة بيولوجية. هذه الخلايا يمكن أن يكون مصدر واعد لعلاج الخلايا وتطبيقات الطب التجديدي.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل OU-WB ISCRM، جامعة أوكلاند وميشيغان معهد الرأس والعمود الفقري. تلقى N بيرافولو وC مكي جائزة بحوث الدراسات العليا نائب مدير الجامعة من جامعة أوكلاند. ونحن نقدر S. باكشي لمراجعة المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM with 4,500 mg/mL glucose Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), New Rochelle. 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), Pt 2 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, Pt A 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton's jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Chapter 1 (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 122، فترة ما حول الولادة، والحبل السري، الحبل المشيمة تقاطع، المشيمة، الوسيطة خلايا انسجة، علامات MSC، وخلايا متعددة القدرات، وعلامات المحفزة
عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri,… More

Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter