Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.
Abstract
Le cordon ombilical humain (UC) et le placenta sont des sources non-invasives, primitives et abondantes de cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui ont de plus en plus retenu l'attention parce qu'ils ne posent pas de problèmes éthiques ou morales. Les méthodes actuelles pour isoler de l'UC MSCs produisent de faibles quantités de cellules avec des potentiels de prolifération variables. Depuis UC est un organe anatomique complexe, les différences dans les propriétés MSC peuvent être dues à des différences dans les régions anatomiques de leur isolement. Dans cette étude, nous avons d'abord disséqué le cordon / échantillons de placenta en trois régions anatomiques discrètes: UC, jonction cordon-placenta (CPJ), et le placenta du fœtus (FP). D'autre part, deux zones distinctes, garniture de cordon (CL) et de la gelée de Wharton (WJ), ont été séparées. La technique de culture explant a été ensuite utilisée pour isoler les cellules des quatre sources. Le temps nécessaire à la culture primaire des cellules des explants varie en fonction de la source du tissu. L'excroissance des cellules a eu lieu à l'intérieur de 3 - 4 days des explants CPJ, alors que la croissance a été observée après 7 - 10 jours et 11 - 14 jours à CL / WJ et FP explants, respectivement. Les cellules isolées sont adhérentes au plastique et affichés morphologie fibroblastoïdes et des marqueurs de surface tels que CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et, de manière similaire à la moelle osseuse (BM) dérivée de cellules souches mésenchymateuses. Cependant, l'efficacité de formation de colonies des cellules a varié, avec CPJ-MSCs et WJ-MSCs montrant une efficacité plus élevée que BM-MSC. MSCs de quatre sources différenciées en adipocytaire, chondrogénique et lignées ostéogéniques, indiquant qu'ils étaient multipotentes. CPJ-différencié plus efficace MSCs par rapport aux autres sources de MSC. Ces résultats suggèrent que le CPJ est la région anatomique la plus puissante et donne un plus grand nombre de cellules, avec une plus grande prolifération et les capacités d' auto-renouvellement in vitro. En conclusion, l'analyse comparative des quatre MSCs de sources a indiqué que le CPJ est une source plus prometteuse pour la thérapie de cellules souches mésenchymateuses cellulaire, régénérativemédecine e, et l'ingénierie tissulaire.
Introduction
Les cellules souches sont présentes dans divers organes et tissus du corps. Ils possèdent un potentiel de régénération et jouent un rôle majeur dans la réparation des tissus endommagés dans le corps pendant toute la durée de la vie humaine 1, 2. Cela a suscité beaucoup d'intérêt dans les cellules souches adultes (CSA), en particulier puisque, contrairement aux cellules souches embryonnaires (CSE), l'utilisation de ASCs ne pose pas de dilemmes moraux et éthiques. Plusieurs études ont rapporté l'isolement de ASCs, telles que les cellules mésenchymateuses (CSM); des cellules souches hématopoïétiques (CSH); et progéniteurs différentes, y compris diverses sources adultes allant de la moelle osseuse (BM) de tissu adipeux (A) et de la pulpe dentaire 3, 4, 5. Cependant, le nombre de présents dans la plupart ASCs des niches adultes est limité, et leur isolement implique généralement une procédure invasive et douloureuse avec un donneur possiblemorbidité du site. De plus, l' âge des donneurs et le stress environnemental pourraient également jouer un rôle important dans la détermination de la qualité et l' activité biologique des cellules isolées 6, 7, 8. ASCs afficher également la prolifération limitée et le potentiel de différenciation au cours de la culture in vitro.
Pour remédier à ces inconvénients de ASCs actuelle, de nouvelles sources ont été menées pour isoler des cellules souches. Ces efforts ont conduit à l'isolement des cellules souches à partir de sources périnatales, y compris le sang de cordon, le tissu du cordon, le placenta et le liquide amniotique 9. Ces sources ont attiré l' attention en raison de leur disponibilité facile et abondant 10, 11, 12, 13. En outre, les tissus périnatale peuvent être obtenus des cellules non effractive et souches dérivées d'entre eux sontplus primitif que ASCs isolés à partir de sources adultes 14, 15. Ils sont isolés des tissus obtenus à la naissance et sont considérés comme ayant subi des modifications minimales dans le génome en raison de contraintes de vieillissement et de l' environnement 16.
Cependant, les caractéristiques indiquées des cellules souches provenant de sources périnatales et leur potentiel d'auto-renouvellement, ainsi que de faire la différence varient considérablement 11, 17. Cela pourrait être en partie dû au fait que le cordon ombilical humain (UC) est un organe complexe. Nous présumons que les régions discrètes de tissu périnatal créer des niches spécifiques responsables des variations et de la nature plus primitive de ces cellules souches par rapport à ASCs provenant de sources non durant la période périnatale. Cette étude décrit la dissection des échantillons cordon / placenta en trois régions anatomiques distinctes: UC, jonction de cordon placenta (CPJ), und placenta fœtal (FP). L'UC a également été disséqué en deux zones: doublure de cordon (CL) et de la gelée (WJ) de Wharton. L'analyse des cellules isolées de CL, WJ, CPJ et FP ont démontré que tous présentaient une morphologie fibroblastoïde et ont exprimé des marqueurs de MSC, mais ils diffèrent dans leur auto-renouvellement et le potentiel de différenciation. cellules dérivées du CPJ ont présenté un taux de prolifération et le potentiel d'auto-renouvellement plus élevé par rapport aux cellules et UC- FP dérivées, ce qui les rend une source plus prometteuse pour la thérapie cellulaire, la médecine régénérative, et l'ingénierie tissulaire.
Protocol
Les échantillons (n = 3) ont été obtenus à partir du consentant, donneurs sains par l'hôpital Beaumont biobanque, Royal Oak, MI et l'hôpital Providence, Southfield, MI sous HIC- (HIC # 2012-101) et IRB- (CISR # 820662- 3), respectivement, a approuvé les protocoles et traités approuvés par le BAC (# 2858) de l'Université d'Oakland, Rochester, MI.
1. Traitement humain du cordon ombilical, la jonction du cordon-placenta et du foetus Placenta et cellules Isoler
- Aseptiquement recueillir des échantillons d'UC environ 10 cm de longueur, y compris 5 - 6 cm connectés au CPJ et 3 - 4 cm de FP. Placer immédiatement chaque échantillon dans un récipient de collecte contenant un milieu (DMEM avec 4500 mg / ml de glucose et une solution antibiotique (0,1% de la gentamicine, 0,2% de streptomycine, et 0,12% de pénicilline)) et stocker à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit transporté au laboratoire par placer sur la glace dans une boîte de mousse de polystyrène. Traiter l'échantillon à 4 ° C en 2 - 4 h de collection.
- Placer l'échantillon dans une boîte de Pétri de 150 mm conservés surglace dans une enceinte de sécurité biologique. En utilisant une aiguille et une seringue, le rincer plusieurs fois avec du PBS glacé pour éliminer les caillots sanguins. Assurez-vous que l'échantillon est maintenu humide avec du PBS au cours du traitement et ne laissez pas sécher. Pour maintenir la stérilité, gérer l'échantillon aseptiques en utilisant des outils PBS et chirurgicaux tout au long autoclavé traitement des échantillons.
- Examinez soigneusement l'échantillon afin d'identifier les différentes régions anatomiques: UC, le CPJ et FP. Tout d'abord disséquer l'UC. Maintenez la fin fœtale de l'UC avec une pince et faire soigneusement la première coupe juste au dessus du CPJ en utilisant une paire de ciseaux. Faire la seconde coupe au-dessous du CPJ pour séparer le CPJ (1,5 à 2,0 cm) à partir du FP. Placez l'UC, CPJ séparé, et FP dans des boîtes de Petri séparées pour un traitement ultérieur.
- Couper l'UC longitudinalement avec l'aide de ciseaux et des pinces, exposant complètement les vaisseaux sanguins et entourant WJ sans déranger l'épithélium.
- Grattez le WJ loin des vaisseaux sanguins et de l'épithélium interne de la subamnionà l'aide d'un scalpel, puis retirez les vaisseaux sanguins. Assurez-vous de recueillir tout WJ périvasculaire restant sous et autour des vaisseaux sanguins, et placez le WJ recueilli dans une boîte de Petri séparée.
- Recueillir le tissu restant, garniture de cordon (CL), dans une boîte de Petri séparée.
- Après séparation des tissus représentant CL, WJ, CPJ, et FP, remplacer le PBS avec 3 - 5 ml de solution de trypsine commerciale et couper séparément chacun des tissus en morceaux de 1 à 2 mm avec des ciseaux.
- Incuber les morceaux de tissus dans une solution de trypsine commerciale à 37 ° C pendant 30 min dans un incubateur à 5% de CO 2 pour la digestion partielle des échantillons. Observer la digestion partielle par la visualisation de la libération de cellules en utilisant un microscope à contraste de phase.
- Pour les échantillons partiellement digérés, ajouter un volume égal de milieu de culture (CM; DMEM avec du glucose 4500 mg / mL et 2 mM de L-glutamine, complété avec 10% de sérum humain / FBS et une solution antibiotique (0,1% de la gentamicine, 0,2% de streptomycine et 0,12% penicillin)) pour neutraliser la solution de trypsine commerciale. Transférer le contenu dans des tubes de centrifugation de 50 ml et laisser les morceaux de tissu partiellement digérés se contenter de 3 min.
- Aspirer soigneusement le surnageant, y compris des cellules individuelles (ils ne se développent pas de façon efficace) et la plaque 15 - 20 morceaux de tissu partiellement digérées sur un flacon de culture 2 tissus de 75 cm et ajouter 9 ml de CM. Incuber à 37 ° C et ne pas déranger les flacons de culture pendant 2 - 3 jours pour permettre l'adhérence des morceaux de tissu.
NOTE: La partie restante des échantillons de tissus partiellement digérée peut être cryoconservés pour l'isolement futur des cellules. - Après 3 jours d'incubation, changer le CM et rechercher l'apparition de l'excroissance des cellules de la explants sur une base quotidienne; la croissance cellulaire devrait être évident à partir des explants adhérentes après 3 - 4 jours, 7 - 10 jours, et 11 - 14 jours d'incubation pour CPJ, CL / WJ, et FP, respectivement. A partir de ce moment, changer le CM après tous les 3 jours ounécessaire.
NOTE: La croissance cellulaire atteint 70% de confluence 7 - 10 jours après l'excroissance cellulaire initiale de l'explantation. Notez que les morceaux de tissu non adhérentes ne donnent lieu à aucune excroissance cellulaire jusqu'à ce qu'ils adhèrent à la matière plastique. Il faut prendre soin de sorte que le flacon ne soit pas perturbé afin d'éviter le détachement des morceaux de tissu adhérentes. S'il y a des pièces flottantes après les 3 premiers jours de culture, ils pourraient être secourus en les transférant à un nouveau flacon pour la fixation.
REMARQUE: Lorsque la croissance des cellules des explants de tissus atteint 70% de confluence, ils devraient être repiquées. Comme indiqué ci-dessus, à partir de cellules souches mésenchymateuses CL / WJ, FP, CPJ, on atteint la confluence en 10 - 14 jours, 14 - 20 jours, et 17 - 24 jours, respectivement. - Pour repiquer les cellules de trop grands pour les explants, dissocier des cellules à l'aide de 1 - 2 ml de solution de trypsine commerciale / 75 cm 2 flacon de culture et incuber à 37 ° C pendant 3 min. Neutraliser avec 1 - 2 ml de CM et centrifuge 1500 g pendant 3 min. FaireAssurez-vous de faire tourner la fiole tout en ajoutant trypsine même pour répandre partout.
- REMARQUE: Les cellules sédimentées sont considérés comme passage 0 (P0) et sont mises en suspension dans CM, comptées et repiquées à une densité d'ensemencement de 1 x 10 4 / cm 2 pour l' amplification, la caractérisation et la cryoconservation. Les cellules en excès peuvent être cryoconservés à P0.
2. Caractériser les cellules isolées
- Colony efficacité de formation (CFE) Dosage
- Enrober les boîtes de Petri de 100 mm (surface de 60 cm 2) avec 0,1% de gélatine pendant 30 minutes et les placer dans l'incubateur à CO 2 à 37 ° C.
REMARQUE: Bien que pas nécessaire, revêtement de gélatine améliore l'adhérence des cellules. - Éliminer l'excès de gélatine et d' ensemencer la plaque revêtue avec des cellules P0 à une concentration de 1.63 cellules / cm 2. Ajouter 3 ml de CM et incuber dans un incubateur de CO2 à 37 ° C.
- Surveiller les plaques ensemencées pour la croissance clonalepar microscopie optique (LM) et changer le milieu tous les 3 jours.
- Après 10 - 14 jours de croissance cellulaire, se laver les boîtes de Pétri à deux reprises avec du PBS et fixer les cellules dans 4% de paraformaldéhyde pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE: paraformaldéhyde est toxique. S'il vous plaît pratiquer la prudence en portant des gants et des lunettes pendant l'utilisation. - Colorer les cellules fixées avec 0,1% de cristal violet pendant 1 h à température ambiante et rincer la plaque avec de l'eau du robinet jusqu'à ce que la coloration bleue non lié a disparu.
- Comptez le nombre de colonies composées d'au moins 50 cellules en utilisant LM.
- Enrober les boîtes de Petri de 100 mm (surface de 60 cm 2) avec 0,1% de gélatine pendant 30 minutes et les placer dans l'incubateur à CO 2 à 37 ° C.
- L' expression de marqueurs de surface cellulaire
- Cultiver les cellules isolées à 70% de confluence, se dissocie de la solution de trypsine commerciale, et de lavage et de culot par centrifugation à 1500 g pendant 3 min. Les cellules en suspension dans du tampon FACS (PBS 1x avec 2% de FBS et 0,1% d'azoture de sodium).
NOTE: L'azoture de sodium est toxique. S'il vous plaît pratiquer la prudence en portant des gants et des lunettes pendant l'utilisation.
- Cultiver les cellules isolées à 70% de confluence, se dissocie de la solution de trypsine commerciale, et de lavage et de culot par centrifugation à 1500 g pendant 3 min. Les cellules en suspension dans du tampon FACS (PBS 1x avec 2% de FBS et 0,1% d'azoture de sodium).
- Centrifuger les cellules colorées à 670 xg pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 ul de tampon FACS.
- Analyser les cellules colorées à l'aide de FACS des anticorps selon le protocole du fabricant.
3. Différenciation potentiel
- la différenciation adipocytaire
- Cultiver les cellules isolées à 70% de confluence, se dissocie de la solution de trypsine commerciale, et de lavage et de culot par centrifugation à 1500 g pendant 3 min.
- Dans un incubateur de CO2 à 37 ° C, la culture des cellules à une concentration de 100.000 cellules / puits d'une plaque à 6 puits contenant 2 ml de CM.
- Après 24 h, remplacer le CM avec adipogmilieu de différenciation enic (0,5 uM isobutyl-méthylxanthine, 1 uM de dexaméthasone, 10 pM d'insuline, et 200 uM d'indométhacine) et incuber. Changer le milieu de différenciation tous les 3 jours ou aussi souvent que nécessaire.
- Après 3 semaines d'incubation, fixer les cellules avec 2 ml de paraformaldehyde à 4% par puits pendant 30 minutes à température ambiante et on tache avec Oil Red O pour détecter la production de gouttelettes lipidiques dans le but d'analyser la différenciation adipocytaire.
REMARQUE: paraformaldéhyde est toxique. S'il vous plaît pratiquer la prudence en portant des gants et des lunettes pendant l'utilisation. - Traiter les cellules fixées avec 60% d'isopropanol (2 ml / puits d'une plaque à 6 puits) pendant 5 min.
- Remplacer l'isopropanol avec 2 ml de colorant Oil Red O (filtre 3 parties de coloration Oil Red O et 2 parties d'eau distillée), incuber pendant 15 à 30 min à la température ambiante et on lave 3 - 4 fois avec de l'eau du robinet pour éliminer tout colorant non lié .
- Visualiser les gouttelettes lipidiques colorées rouge, indicatives de la lignée cellulaire adipogène, uchanter LM.
- différenciation chondrogénique
- Culture des cellules isolé à 70% de confluence, se dissocient avec la solution de trypsine commerciale, et de lavage avec du PBS.
- Pour sédimenter les cellules d'induction chondrogénique, centrifugeuse 250.000 cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml avec 2 ml de CM à 11 000 g pendant 8 min. Incuber les granulés pendant une nuit à 37 ° C.
- Au bout de 24 h, remplacer doucement le CM avec du milieu de différenciation chondrogénique (20 ng TGFβ1, 10 ng de l'insuline, la dexaméthasone 100 nM et 100 uM d'acide ascorbique) sans perturber le culot et poursuivre l'incubation. Changer le milieu de différenciation tous les 3 jours ou aussi souvent que nécessaire.
- Après 3 semaines d'incubation, fixer les cellules avec 2 ml de paraformaldehyde à 4% par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Cryosection et tache avec 1% de bleu de toluidine pour examiner la présence ou de la production de la matrice extracellulaire afin de déterminer la différenciation chondrogénique.
NOTE: Paraformaldehyde est toxique. S'il vous plaît pratiquer la prudence en portant des gants et des lunettes pendant l'utilisation. - Pour cryosectioning, doucement laver les culots de cellules deux fois avec du PBS et récoltées fixer avec 1 ml de paraformaldehyde à 4% pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE: paraformaldéhyde est toxique. S'il vous plaît pratiquer la prudence en portant des gants et des lunettes pendant l'utilisation. - Laver les pastilles à deux reprises avec du PBS pour éliminer le paraformaldehyde et le transférer dans une solution de saccharose / OCT (1: 2, 20% de saccharose: OCT). Incuber à température ambiante pendant 24 h pour permettre à la solution pour infiltrer complètement dans les culots de cellules; cela permettra lisse tronçonnage.
- Transférer les pastilles dans les moules OCT. Congeler les moules à -20 ° C pendant 4-6 h et cryosection environ 10 - 12 parties de microns d'épaisseur des pastilles cellulaires en utilisant un cryostat pour une coloration au bleu de toluidine.
- Laver les cryosections doucement avec du PBS; ajouter quelques gouttes de colorant bleu 1% de toluidine, les tronçons de pastille sur la lame complètement; et incUbate pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les lames avec plusieurs fois PBS à décolorer. Enlever la tache en excès par trempage de la lame dans une solution d'alcool à base de HCl (95% d'alcool + 0,5 ml de HCl) plusieurs fois jusqu'à ce que la couleur bleue non lié a disparu. Monter les coupes colorées à l'aide de 100 pi de solution de montage pour la conservation à long terme des diapositives.
NOTE: La coloration bleue des sections indique la présence de glycosaminoglycanes et glycoprotéines et sera observable en utilisant LM.
- différenciation ostéogénique
- Encore une fois, la culture des cellules isolées à 70% de confluence, se dissocie de la solution de trypsine commerciale, et de lavage et de culot par centrifugation à 1500 g pendant 3 min.
- Repiquer les cellules à une concentration de 100.000 cellules / puits de plaques à 6 puits contenant 2 ml de CM dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.
- Après 24 h, remplacer le CM avec du milieu de différenciation ostéogénique (0,1 μ; M de dexaméthasone, 10 uM de β-glycérophosphate, et 50 uM de phosphate d'ascorbate) et poursuivre l'incubation. Changer le milieu de différenciation tous les 3 jours ou aussi souvent que nécessaire.
- Après 3 semaines d'incubation, fixer les cellules avec 2 ml de paraformaldehyde à 4% par puits pendant 30 minutes à température ambiante et on tache avec du rouge d'alizarine pour détecter la présence d'un dépôt de calcium dans le but de déterminer la différenciation ostéogénique.
REMARQUE: paraformaldéhyde est toxique. S'il vous plaît pratiquer la prudence en portant des gants et des lunettes pendant l'utilisation. - laver avec précaution les cellules fixées deux fois avec de l'eau distillée et on traite avec 2% alizarine tache rouge (2 ml / puits dans une plaque à 6 puits) pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
- Retirez la tache en excès en lavant doucement avec de l'eau du robinet pour que les dépôts de calcium ne déloge pas.
- Visualisez les dépôts de calcium colorés en rouge à l'aide de LM.
4. quantitative transcriptase inverse Polymerase Chadans la réaction (qRT-PCR) Analyse
- Cultiver les cellules isolées à 70% de confluence, se dissocient avec la solution de trypsine commerciale, de lavage, et le culot par centrifugation à 1500 g pendant 3 min pour isoler l'ARN cellulaire total.
- Laver les cellules avec du PBS pour éliminer les traces de FBS, puis procéder à l'isolement d'ARN en utilisant un kit de purification d'ARN commercial, suivant les instructions du fabricant.
- Purifier le ARN total isolé par traitement avec de la DNase à 37 ° C pendant 30 min en utilisant un thermocycleur. Synthétiser ADNc en utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant.
- Préparer les réactions de PCR en triple à 10 ul dans une plaque à 96 puits, chaque réaction contenant 5 ul de PCR Supermix SYBR vert; 3 ul d'eau distillée deux fois; 0,5 pi de chaque amorce, directe et inverse; et 1 ul de l'ADNc dilué (1:10).
- Effectuer une PCR dans les paramètres suivants: 10 min à 98 ° C, suivie de 44 cycles de 30 s à chaque 98 &# 176; C, 20 s à 60 ° C et 30 s à 72 ° C.
- Normaliser l'amplification des gènes cibles à des gènes GAPDH de référence, et β-actine; les séquences d' amorces sont énumérées dans le tableau 1.
5. Analyse statistique
- Effectuer toutes les analyses à l'aide de logiciels statistiques. Présenter les données comme la moyenne ± SEM. Les résultats obtenus avec une valeur p (** p ≤ 0,01 et * p ≤ 0,05) ont été considérées comme statistiquement significatives.
Representative Results
Dissection et isolement des cellules de cordon ombilical humain, jonction cordon-placenta et du foetus Placenta
tissu périnatal se compose de trois régions anatomiques discrètes. Le premier est l'UC, contenant deux artères et une veine, ainsi que deux zones distinctes: CL (le revêtement extérieur du câble) et WJ (le matériau analogue à une gelée qui entoure les vaisseaux sanguins à l'intérieur de la moelle). Le second est CPJ (la connexion entre le cordon et le placenta), et le troisième est FP, qui est immédiatement après le CPJ (le cordon insère dans le placenta, qui est attaché à la paroi utérine de la mère). Le schéma du protocole d'isolement de cellules provenant d'un tissu périnatale est représenté sur la figure 1. Les quatre sources-CL, WJ, CPJ, et FP-sont clairement identifiables et ont été séparés pour isoler des cellules à partir des explants, comme représenté sur la figure 2. Til apparition de l'excroissance des cellules de cultures explants a été régulièrement contrôlée et enregistrée par LM. Les cellules adhérentes fibroblastoïdes ont été observées après 3-4 jours de culture des explants du CPJ. Les cellules ayant une morphologie similaire apparaissent 7-8, 9-10 et 11-14 jours après la mise en culture du WJ, CL et FP explants, respectivement. L'excroissance des cellules des explants représentant les différentes sources (CL, WJ, CPJ, FP) et est représenté sur la figure 3A. Ces cellules ont été considérées comme P0. Lorsque les cellules P0 ont été repiqués, ils semblaient croître clonale, affichant une morphologie fibroblastoïde similaire à celle de BM-MSCS. Cependant, ils présentent une variation dans le temps de doublement de population, allant de 32 h à 94 h pour les cellules de CPJ et FP, comme représenté sur la figure 3B et C. Les cellules de WJ et CL ont eu des temps de doublement similaires médiale CPJ et FP. Une analyse plus poussée des cellules P0 ont indiqué qu'ils ont aussi varié dans la CFE, allant de 16 à 92 colonies.Les cellules du CPJ avait la plus forte (92), tandis que les cellules FP avaient le plus bas (16) CFE. Les cellules provenant de CL et WJ avaient des valeurs de CFE 59 et 80 colonies, respectivement (figure 4A) -C. Les cellules de CL ont des valeurs similaires à la CFE BM-MSCS. Ces résultats suggèrent que les cellules dérivées du CPJ ont-plus de capacités prolifératives et auto-renouvellement.
Immunoprofile des cellules isolées
Les cellules isolées de la CL, WJ, CPJ, et FP ont été étudiés pour l'expression de marqueurs spécifiques des cellules. P3-5 cellules affichées expression positive pour les marqueurs de MSCs tels que CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et (Figure 5A et B). Ces cellules sont également connus pour exprimer majeure d'histocompatibilité de classe I marqueur, marqueur HLA-ABC, et ne classe II exprime pas, HLA-DR 3. Les pourcentages de cellules positives pour eEse marqueurs sélectionnés à partir de quatre sources étaient semblables à celles exprimées par la norme BM-MSCS. Cependant, les rapports indiquent que les IFM et les cellules WJ- CPJ dérivées sont presque semblables et sont encore plus élevés que les cellules et Cl- FP dérivées (Figure 5C). Fait intéressant, malgré différentes valeurs CFE, toutes les cellules provenant de différentes sources ont exprimé des niveaux similaires de marqueurs de MSC. Sur la base des résultats des marqueurs de surface cellulaire, les cellules isolées à partir de quatre sources sont considérées comme MSCs. Une analyse plus poussée de ces cellules a révélé qu'elles expriment également des gènes de pluripotence, OCT4, NANOG, KLF4 et SOX2, comme représenté sur la figure 5D. Le CPJ-MSCs avait la plus haute expression de marqueurs de pluripotence, suivi par WJ-, et Cl- FP-MSCS.
Potentiel de différenciation des cellules souches mésenchymateuses isolées
L'étalon-or pour caractériser MSCS est leur capacité à DIFFErencier en plusieurs lignées. Nos résultats ont montré que de MSCs isolées toutes les sources périnatales facilement différenciées en types de cellules adipogéniques, chondrogéniques et ostéogéniques. Les dérivés adipogènes produites des gouttelettes lipidiques qui ont été colorés positivement avec Oil Red O, comme montré sur la figure 6A. Toluidine coloration au bleu du dérivé chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses a démontré la présence de protéoglycanes et les glycoprotéines qui ont aidé à la production de matrice extracellulaire (figure 6B). Les dérivés ostéogénique de cellules souches mésenchymateuses positivement colorées avec du rouge alizarine indiquent la présence des dépôts de calcium intervenant dans la minéralisation osseuse, comme le montre la figure 6C.
Comme prévu, l'analyse transcriptionnelle des cellules souches mésenchymateuses isolées à partir de toutes les sources a montré la différenciation trois lignées (Figure 6D -F). Cependant, le pottiel de différenciation varie en fonction de la source de MSCS. adipogènes dérivés de WJ-MSCs ont deux fois plus grand taux d'expression des gènes sélectionnés adipogènes (CEBPβ, FABP4 et PPARy) par rapport au CPJ-MSCs. Et Cl- FP-MSCs avaient l'expression la plus faible de ces gènes. Dans le cas de différenciation chondrogénique, les dérivés CPJ-MSCs exprimés choisis gènes chondrogéniques (de Sox9 et COL2) 50 fois plus élevée que les dérivés WJ et FP-MSC. Semblable à la mauvaise différenciation adipocytaire des CL-MSCS, ils avaient un potentiel inférieur chondrogénique, comme en témoigne l'expression la plus faible de gènes chondrogéniques. CPJ-MSCs a également montré le plus fort potentiel de différenciation ostéogénique, comme indiqué par les niveaux de transcription de deux fois plus élevée des gènes sélectionnés ostéogéniques (COL1, OPN et OCN). Toutefois, l'expression du marqueur progénitrices RUNX2 était le plus élevé dans les dérivés de ostéogéniques WJ-MSCs, ce qui indique que ces cellules ont été lentes à répondre aux conditions de différenciation. Encore une fois, CL-MSCs a révélé un faiblela différenciation dans la lignée ostéogénique. Ces résultats suggèrent que le CPJ-WJ-et MSCs affichent un plus grand potentiel MSCs de différenciation que Cl- et FP-MSCS. La CL-MSCs avait le plus faible potentiel de se différencier en des dérivés de trois lignées.
Figure 1: Schéma de l'isolement des cellules de cordon ombilical humain, jonction cordon-placenta et du foetus Placenta. Inspecter l'échantillon prélevé et procéder à la dissection. Etape 1. manuellement disséquer et séparer le cordon / échantillon de placenta en trois régions distinctes: cordon ombilical (UC), jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP). Séparer les deux zones distinctes de l'UC dans la doublure de cordon (CL) et de la gelée (la WJ) de Wharton en utilisant des ciseaux et des pinces. Étape 2. Couper chacun des tissus disséqués séparément dans 1 to morceaux de 2 mm avec des ciseaux et digérer partiellement les pièces. Étape 3. La culture des morceaux de tissu. Étape 4. Isoler les cellules des explants par traitement à la trypsine. Subculture et caractériser les cellules isolées. Étape 5. Les cellules isolées et caractérisées peuvent être amplifiés et utilisés pour diverses applications. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Dissection et de la culture des explants de cordon ombilicale humaine, la jonction du cordon-placenta et du foetus Placenta. Sont représentées les trois différentes régions anatomiques de l'échantillon cordon / placenta: UC (split dans le CL et WJ), CPJ, et FP, ainsi que les artères et les veines associées. CL, WJ, CPJ,et FP ont été séparés par dissection manuelle pour isoler les cellules des explants. Chacune des régions découpées séparément a été coupé en petits fragments et cultivées dans 2 plaques de 75 cm en utilisant 9 ml de CM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Morphologie des cellules isolées de cordon ombilicale humaine, la jonction du cordon-placenta et du foetus Placenta. (A) la croissance des cellules des explants de CL, WJ, CPJ, et FP, comme visualisé par LM. (B) sous - culture de cellules isolées à partir de CL, WJ, CPJ, et des explants de PF a montré une morphologie fibroblastoïde. La barre d'échelle représente 100 um (grossissement: 4X). (C) de doublement de population de temps til a isolé des cellules de CL, WJ, CPJ, et FP. BM-MSCs ont été utilisés en tant que norme. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des mesures en triple (** p ≤ 0,01 et * p ≤ 0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Colony formant efficacité des cellules de cordon ombilical humain, Junction Cord-placenta et fœtal du placenta. (A) La croissance des cellules (P0) isolées à partir de CL, WJ, CPJ, et FP, étalées à une densité clonale de 1,63 cellules / cm2, ont été visualisées par LM. (B) Des photomicrographies de cellules colorées avec du cristal violet figurent la capacité à former des colonies. (C) à l' unité de colonies de cellules colorées with cristal violet. Les barres d'échelle représentent 100 um (grossissement: 4X). (D) Représentation graphique du nombre de colonies formées à partir des cellules dérivées de CL, WJ, CPJ, et FP. BM-MSCs ont été utilisés en tant que norme. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des mesures en triple (** p ≤ 0,01 et * p ≤ 0,05). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Analyse des marqueurs MSC exprimés par les cellules isolées de cordon ombilicale humaine, la jonction du cordon-placenta et du foetus Placenta. (A) L' expression de marqueurs de surface mésenchymateuses (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et) par les cellules de CL, WJ, CPJ, et FP, comme dissuaderminée par cytométrie de flux. (B et C) Représentation graphique des pourcentages de cellules positives et les ratios médians intensité de fluorescence (MFI) pour les marqueurs de surface mésenchymateuses sélectionnés. les ratios des IFM ont été calculés en divisant la valeur MFI du marqueur (généré par le logiciel sur la base de l'intensité de fluorescence des populations de cellules bloquées) par la valeur MFI de l'isotype. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des mesures en triple. (D) Expression des gènes de pluripotence (OCT4, NANOG, Klf4, et SOX2) par les cellules de CL, WJ, CPJ, et FP, telle que déterminée par qRT-PCR. (** p ≤ 0,01 et * p ≤ 0,05). L'expression des gènes a été normalisé à la GAPDH et de β-actine, et les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des mesures en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: multilignée Différenciation des cellules souches mésenchymateuses isolées de cordon ombilical humain, jonction cordon-placenta et du foetus Placenta. (A) Les cellules ont été incubées dans un milieu de différenciation adipocytaire pendant 3 semaines et colorées avec Oil Red O, indiquant la présence de gouttelettes lipidiques. (B) Les culots cellulaires ont été incubées dans un milieu de différenciation chondrogénique pendant 3 semaines. cryosections des cultures histologiques pellets ont été colorées avec du bleu de toluidine, montrant la présence de glycosaminoglycanes. (C) Les cellules ont été incubées dans un milieu de différenciation ostéogénique pendant 3 semaines et colorées avec du rouge d'alizarine, l' affichage de la production de dépôts de calcium suggérant la minéralisation osseuse. Toutes les images ont été obtenues par LM. La barre d'échelle représente 100 um (grossissement: 4X). BM-nous MSCsre utilisé comme standard. (DF) Expression des gènes sélectionnés (CEBPβ, FABP4 et PPARy; SOX9, PAC, et COL2, et COL1, RUNX2, OPN et OCN représentant la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en adipogénique, chondrogénique et lignées ostéogéniques, respectivement), tel que déterminé par analyse par qRT-PCR (** p ≤ 0,01 et * p ≤ 0,05). L'expression des gènes a été normalisé à la GAPDH et de β-actine, et les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des mesures en triple. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Gène | séquences d' amorces | Longueur du produit |
| OCT4 | Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA | 97 |
| Inverse GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG | </ Td> | |
| NANOG | AAAGAATCTTCACCTATGCC vers l'avenir | 110 |
| reverse- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT | ||
| KLF4 | CGAACCCACACAGGTGAGAA vers l'avenir | 94 |
| reverse- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC | ||
| SOX2 | TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA vers l'avenir | 75 |
| reverse- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC | ||
| SOX9 | AGCGAACGCACATCAAGAC vers l'avenir | 85 |
| reverse- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG | ||
| CAP2 | CTCGTGGCAGAGATGGAGAA vers l'avenir | 252 |
| reverse- CACCAGGTTCACCAGGATTG | ||
| UNE CANETTE | AGCCTGCGCTCCAATGACT vers l'avenir | 103 |
| COL1 | AAGGTCATGCTGGTCTTGCT vers l'avenir | 114 |
| reverse- GACCCTGTTCACCTTTTCCA | ||
| RUNX2 | TGCTTCATTCGCCTCACAAA vers l'avenir | 111 |
| reverse- AGTGACCTGCGGAGATTAAC | ||
| OPN | CATACAAGGCCATCCCCGTT vers l'avenir | 112 |
| reverse- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC | ||
| OCN | TAAACAGTGCTGGAGGCTGG vers l'avenir | 191 |
| reverse- CTTGGACACAAAGGCTGCAC | ||
| CEBPβ | TATAGGCTGGGCTTCCCCTT vers l'avenir | 94 |
| reverse- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG | ||
| FABP4 | TTAGATGGGGGTGTCCTGGT vers l'avenir | 158 |
| reverse- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA | ||
| PPAR | GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC vers l'avenir | 74 |
| reverse- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG | ||
| GAPDH | ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG vers l'avenir | 101 |
| reverse- GCCATCACGCCACAGTTTC | ||
| ACTIN | AATCTGGCACCACACCTTCTAC vers l'avenir | 170 |
| reverse- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC |
Tableau 1: Liste des séquences d' amorces humaines utilisées dans cette étude.
Discussion
Les progrès récents dans la recherche sur les cellules souches non seulement amélioré la compréhension des processus de développement de base , mais également des perspectives prometteuses pour l'utilisation de cellules souches en médecine biotechnologique, pharmaceutique, thérapie cellulaire, de régénération, et les applications d'ingénierie tissulaire 18, 19, 20. Alors que pluripotentes isolées à partir de CES embryons précoces sont les plus prometteurs, ils sont confrontés à des défis techniques et dilemmes éthiques 21, 22, 23. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) dérivées de cellules adultes offrent une alternative, mais ils sont confrontés à des problèmes similaires trop techniques et de sécurité 23. En outre, CSPi peut ne pas être génétiquement stables ou peuvent avoir subi des modifications génétiques, limitant ainsi leur utilisation thérapeutique. Les cellules souches ont également été signalés dans une variété de tis post-natalepoursuit en justice et les organes. Les sources les plus courantes de ces ASCs sont la moelle osseuse, adipeuse, et le tissu musculaire. Cependant, à partir de sources ASCs après la naissance ont un potentiel de croissance et de différenciation limitée 24, 25. Ils souffrent également en raison du vieillissement et de l' exposition à des contraintes environnementales et donc ne sont pas toujours efficaces pour les applications thérapeutiques 26, 27, 28. Cela nous a conduit et d'autres à la recherche de nouvelles sources de cellules souches qui sont plus naïfs que ASCs.
Nous avons étudié les sources périnatales pour les cellules souches primitives comme une alternative à ASCs. Dans ce rapport, nous proposons une méthode fiable, robuste et simple d'isoler à partir d'échantillons humains MSCs cordon / placenta. En comparaison à d'autres sources et les méthodes utilisées pour l'isolement des CSA, ce procédé fournit un procédé efficace et non invasive permettant d'isoler de grandes quantités de higH-qualité MSCs. Il accentue encore le potentiel de croissance et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses plus périnatale par rapport à des sources de cellules souches mésenchymateuses adultes tels que BM.
L'UC fixation du fœtus au placenta est un grand organe de régions anatomiques distinctes, dont deux artères, une veine, CL, et WJ (tissu entourant les vaisseaux sanguins). Plusieurs études ont rapporté l'isolement des cellules souches mésenchymateuses du cordon tout, le WJ, ou le placenta, avec une croissance variable et la différenciation les potentiels 25, 29. Néanmoins, à ce jour, aucune étude n'a étudié et comparé efficacement les cellules de différentes régions anatomiques de l'échantillon cordon / placenta. Nous fournissons ici une méthode simple et systématique pour la dissection de l'UC, le CPJ et connecté FP pour l'isolement des cellules souches mésenchymateuses. Nous montrons également un protocole complet et simple pour caractériser et évaluer la qualité des cellules isolées en déterminant leur prolifération capabilITIES, ainsi que leur potentiel d'auto-renouvellement et de différenciation. Cette méthode est reproductible et donne une grande quantité de cellules souches mésenchymateuses de qualité supérieure.
Nous avons constaté que la digestion partielle des morceaux de tissu 1-2 mm de taille à l'aide d'une solution de trypsine commerciale cellules des reproductible explants cédé, alors que la digestion complète du tissu en cellules individuelles avaient de faibles rendements de cellules isolées. Cependant, une étude a rapporté que des explants de tissu plus grandes de taille UC environ 10 mm étaient optimales pour l' isolement de cellules 30. A l' inverse, une autre étude a suggéré que la méthode des explants de tissu entraîné dans un cycle de culture plus longue et un rendement plus faible de cellules par rapport à la méthode de digestion de l' enzyme 31. Dans les rapports précédents, le traitement des tissus avec cordon collagénase II et hyaluronidase, séparément ou à la suite de la trypsine, ont été effectuées pour isoler les cellules de la moelle 32, 33
Alors que le protocole pour la dissection et l'isolement des cellules des explants est simple, quelques-unes des étapes peut se révéler difficile. Tout d'abord, d'assurer le respect explants en permettant leur fixation à la surface du flacon de culture. Cela peut être facilité en utilisant une petite quantité de milieu, ne couvrant que les morceaux de tissu pour les 2 premières heures de la culture, puis en ajoutant soigneusement le milieu restant. Second, limiter le nombre d'explants à moins de 15 par flacon T75. Trop peu d'espace entre les pièces ou trop de pièces par flacon sont inhibiteurs pour la croissance des cellules. Troisièmement, les morceaux de tissu qui ne collent pas à la surface du flacon de culture après 3 jours d'incubation doivent être transférés dans un nouveau flacon pour l'adhérence et la culture. Quatrièmement, les morceaux de tissu à cultiver doit être exempte de débris cellulaires, qui inhibe la fixation. En cinquième lieu, la mise en culture de grandes pièces nécessite plus moyen et ne pas améliorer l'efficacité de la croissance des cellules. Enfin, surveiller les cultures de près explants, en particulier après l'apparition de l'excroissance des cellules, comme les cellules peuvent rapidement devenir confluentes et de se différencier en fonction de la source de tissu. Quelques limites de la technique comprennent un manque d'expertise en disséquant les échantillons pour séparer le CL, WJ, CPJ et FP; une petite taille de l'échantillon, ce qui entraîne un faible rendement de WJ; et traitement de l'retardés échantillons doivent être traitées dans les 2-4 heures suivant le prélèvement à Avoid une perte dans la récupération des cellules.
La norme d'or pour la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses est la capacité d'adhérer au plastique, forment le phénotype fibroblastique et se différencier en plusieurs lignées. Ce sont également des critères couramment utilisés pour définir MSCs comme décrit par le ISCT 35. Dans cette étude, les cellules isolées à partir de quatre sources étaient adhérentes au plastique et il y avait une expression positive pour les marqueurs de MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et négative), mais l'expression de la CD45 marqueur hématopoïétique. En outre, ils ont exprimé la classe antigène leucocytaire humain (HLA) I, mais ont été négatifs pour HLA de classe II. Par rapport à la BM-MSCS, et les cellules WJ- CPJ dérivées étaient plus élevés. Ces résultats sont cohérents avec les rapports précédents de l' UC dérivés 33 MSCs, 36, 37, 38. De plus, nos résultats ont montré que Cl-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs exprimé pluri-les gènes de virilité tels que OCT4, NANOG, et SOX2; cependant, leur expression était inférieur à celui des CES, tel que rapporté précédemment 39. Ces résultats ont également été en accord avec une étude antérieure qui a rapporté l'expression de marqueurs de pluripotence dans les cellules périnatales dérivées 40. Fait intéressant, il a été observé que l'expression du marqueur pluripotent était plus élevée dans CPJ-MSCs que dans les cellules isolées à partir d'autres sources. Il a également été remarqué que l'UC-MSCs présentait un plus grand potentiel d' auto-renouvellement de BM-41 MSCs. Fait intéressant, malgré des caractéristiques similaires phénotypiques, les cellules isolées à partir des quatre sources avaient des valeurs variables de CFE. Cependant, à l'exception des FP-MSC, ils avaient tous de meilleures valeurs CFE que BM-MSCS. CPJ-MSCs avait la valeur la plus élevée CFE et le taux de prolifération par rapport à tous les autres MSCS. De plus, et le CPJ-WJ- affichent des potentiels de cellules souches mésenchymateuses différenciation plus élevés que BM-MSCS. CL-MSCs a montré la moindre différenciationpotentiel dans les trois lignées (c. -à- adipocytaire, chondrogénique et ostéogénique), alors que le CPJ-MSCs avait le plus grand potentiel de différenciation et FP-trois lignées MSCs affiche le moins de potentiel de différenciation adipocytaire.
En conclusion, nos résultats ont montré que la qualité et la quantité des cellules souches mésenchymateuses isolées diffèrent entre les quatre sources de l'échantillon cordon / placenta. CPJ-MSCs avait une plus grande capacité de prolifération et un plus grand potentiel d'auto-renouvellement. Ils étaient aussi puissants dans leur différenciation dans les types de cellules de trois lignées. En raison de leur faible temps de doublement, le CPJ pourrait être-MSCs connu une expansion rapide de 1000 fois et utilisés pour des médicaments à haut débit ou le dépistage biomatériau. Ces cellules pourraient être une source plus prometteuse pour la thérapie cellulaire et les applications de la médecine régénérative.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
L'étude a été soutenue par OU-WB ISCRM, Université d'Oakland et du Michigan Head et Spine Institute. N. Beeravolu et C. McKee a reçu le Prix de recherche Graduate Provost de l'Université d'Oakland. Nous vous remercions de S. Bakshi pour la révision du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM with 4,500 mg/mL glucose | Invitrogen | 11995065 | |
| FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
| Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
| Insulin | Prospec | CYT-270 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
| Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
| TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
| GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| DNase | Promega | M6101 | |
| iScript kit | Biorad | 1708891 | |
| Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
| Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
| Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
| Crystal violet | Sigma | C3886 | |
| Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
| APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
| APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
| FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
| FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
| APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
| FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
| APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
| Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
| Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
| Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
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