Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/55345
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

Summary

وهنا يصف لنا سير عمل كاملة للتحليل النوعي والكمي مأمن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية الأولية وتقديم مستضد الخلايا. ويستند الأسلوب التصوير التدفق الخلوي، التي تسمح باكتساب وتقييم عدة آلاف خلية الصور خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن.

Abstract

المشبك المناعي هو مجال الاتصال بين خلايا T وخلايا مستضد-عرض (Apc). استقطاب خلايا تي مستقبلات سطحية والبروتينات نحو المشبك المناعي لضمان ربط مستقرة وتبادل الإشارات. وقد استخدمت مجهرية [كنفوكل]، TIRF، أو دقة فائقة الكلاسيكية لدراسة المشبك محصنة. منذ هذه الأساليب تتطلب الحصول على دليل الصور والقياس الكمي تستغرق وقتاً طويلاً، تصوير الأحداث النادرة الصعبة. هنا، يمكننا وصف سير عمل التي تمكن من تحليل الخصائص المورفولوجية لعشرات آلاف خلايا. هي الناجم عن الاشتباكات العصبية المناعية بين خلايا تي البشرية الأولية في الأعمال التحضيرية لعموم-الكريات البيض وخلايا راجي محملة ب سيب معوي المكوّرات العنقودية الذهبية كناقلات الجنود المدرعة. يتم الحصول على الصور بالتصوير التدفق الخلوي، وتسمى أيضا الفحص المجهري في التدفق، الذي يجمع بين ميزات cytometer تدفق ومجهر الأسفار. تقدم استراتيجية النابضة كاملة لتحديد الخلية T/APC الأزواج وتحليل الاشتباكات العصبية المناعية. كما يقوم سير العمل هذا يسمح تحليل المناعة synapses في الأعمال التحضيرية لعموم أونبوريفيد-الكريات البيض ومن ثم يتطلب سوى كمية صغيرة من الدم (أي، 1 مل)، فإنه يمكن تطبيقها على عينات من المرضى. الأهم من ذلك، عدة عينات يمكن أعدت، وقياسها، وتحليلها بالتوازي.

Introduction

خلايا T المنظمين الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ويتم تنشيطها عن طريق الببتيدات مستضدي التي ترد في سياق مجمعات histocompatibility الرئيسية (MHC). يتطلب التنشيط تي خلية كاملة إشارتين، إشارة الكفاءة عن طريق مستقبلات تي خلية محددة مستضد (تكر)/CD3 المعقدة وإشارة كوستيمولاتوري عن طريق مستقبلات التبعي. كلا إشارات يتم إنشاؤها من خلال التفاعل المباشر للخلايا T مع عرض مستضد الخلايا (Apc). ناقلات الجنود المدرعة ناضجة توفر إشارة اختصاص لتنشيط تي خلية عن طريق المجمعات MHC-الببتيد، ويعربون عن يغاندس كوستيمولاتوري (مثل، CD80 أو CD86) لضمان تطور تي خلية التنشيط1. واحدة من الوظائف الهامة كوستيمولاتيون هو إعادة ترتيب أكتين سيتوسكيليتون2،،من34. واو-أكتين القشرية ثابتة نسبيا في استراحة خلايا تي. التحفيز تي خلية عن طريق ناقلات الجنود المدرعة تحمل مستضد يؤدي إلى إعادة ترتيب عميقة cytoskeleton أكتين. ديناميات أكتين (أي الدوائر البلمرة/ديبوليميريزيشن، أكتين سريعة) تمكين الخلايا T لإنشاء القوات التي تستخدم لنقل البروتينات أو العضيات، على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، المهم cytoskeleton أكتين لتطوير منطقة خاصة لاتصال بين خلايا تي وناقلات الجنود المدرعة، تسمى المشبك محصنة. نظراً لأهمية cytoskeleton أكتين المشبك المناعية، فقد أصبح أساسيا لتطوير أساليب لقياس التغيرات في سيتوسكيليتون أكتين تي الخلايا5،6،،من78 , 9.

عن طريق المعونة cytoskeletal أكتين، المستقبلات السطحية والبروتينات مما يشير إلى فصل في مجموعات التنشيط سوبراموليكولار (سماكس) داخل المشبك محصنة. وأكد استقرار المشبك محصنة بربط مستقبلات لحزم واكتين أن زيادة مرونة cytoskeleton أكتين. تشكيل المشبك المناعي قد ثبت أن تكون حاسمة لتوليد الاستجابات المناعية التكيفية. الآثار الضارة لتشكيل المشبك مأمن المعيبة المجراة في تحققت أولاً في المرضى الذين يعانون من ويسكوت ألدريتش متلازمة (WAS)، مرض في بلمرة الأكتين فيها، وفي الوقت ذاته، نشعر بالقلق تشكيل المشبك مأمن10 . وكان يمكن أن المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة وأمراض المناعة الذاتية، الاكزيما والالتهابات الحادة المتكررة. وعلى الرغم من هذا الاستنتاج، حاليا لا يعرف عما إذا كان تشكيل المشبك المناعي يختلف في خلايا تي من الأشخاص الأصحاء والمرضى الذين يعانون من عيوب في المناعة أو أمراض المناعة الذاتية.

مجهرية الأسفار، بما في ذلك [كنفوكل]، TIRF ومجهرية فائقة القرار، استخدمت للكشف عن بنية المشبك محصنة ضد11،12،،من1314. عالية الدقة لهذه النظم وإمكانية أداء تصوير خلية يعيش يتيح جمع المعلومات الدقيقة، والزمانية عن cytoskeleton أكتين والبروتينات السطحية أو داخل الخلايا في المشبك محصنة. ومع ذلك، العديد من النتائج، تستند إلى تحليل سوى بضع عشرات من خلايا تي. وعلاوة على ذلك، يجب تنقية الخلايا T لهذه الأنواع من الأسفار مجهرية. ومع ذلك، للعديد من الأسئلة البحثية، استخدام الخلايا أونبوريفيد بدلاً من هذا القرار أعلى درجة ممكنة أهمية قصوى. وهذا ذات الصلة إذا كان يتم تحليل خلايا تي من المرضى، نظراً لكمية الدم المتبرع به محدودة وقد تكون هناك الحاجة معالجة العديد من العينات في نفس الوقت.

وأنشأنا الطرق المجهرية التي تسمح بتحليل cytoskeleton أكتين في المشبك محصنة في ال16،15،نظام الإنسان17. وتستند هذه الأساليب التصوير التدفق الخلوي، كما دعا في التدفق المجهري18. هجين بين مجهرية متعددة الأطياف التدفق الخلوي والأسفار، التصوير التدفق الخلوي بقوتها في تحليل معلمات المورفولوجية والتعريب البروتين في الخلية غير متجانسة من السكان، مثل عموم-الكريات البيضاء من الدم المحيطي. قدمنا منهجية التي تمكننا من قياس واكتين في تي-خلية/APC يصرف الخلايا البشرية من عينات الدم كله، دون الحاجة إلى خطوات تنقية تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا17. التقنية المقدمة هنا يشمل سير العمل كله، من الحصول على عينة الدم للتحديد الكمي لواو-أكتين في المشبك محصنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد عموم-الكريات البيضاء

  1. رسم 1 مل دم المحيطي من المانحين صحية (أو المريض) في حقنه هيبارينيزيد. تأكد من الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المسؤولة للتبرع بالدم.
  2. الدم مع 30 مل من ACK تحلل المخزن المؤقت (4ملم 150 NH Cl و كهكو 1 مم3مم 0.1 يدتا، pH 7.0) في أنبوب 50 مل مل 1 مزيج من الأجهزة الطرفية البشرية واحتضان لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. ملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 6 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 30 مل من ACK تحلل المخزن المؤقت.
  4. كرر الخطوات من 1.2 و 1.3 حتى المادة طافية الواضح. أخيرا، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من الثقافة المتوسطة (RPMI1640 + FCS 10%). احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

2-تحميل راجي الخلايا مع SEB

  1. إعداد أنبوبين الصقر 15 مل مع 1.5 × 106 راجي الخلايا في الأنبوب. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا (300 x ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وتجاهل المادة طافية.
  2. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة المتبقية (حوالي 50 – 100 ميليلتر)، أضف 1.9 ميليلتر (1.9 ميكروغرام) سيب، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لأدنى 15 إضافة 5 مل من الثقافة المتوسطة، وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا (300 x ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وريسوسبيند بيليه في الثقافة المتوسطة (ربمي 1640 + 10 ٪ السفح) في كثافة 1 × 106 خلايا/مل.

3-تنظيم دورات تعريفية للاشتباكات العصبية المناعية وتلطيخ البروتوكول

  1. "الماصة؛" 500 ميليلتر من إعداد الخلايا راجي تحميل سيب في أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية و 500 ميليلتر من إعداد الخلايا راجي تفرغ في أنبوب آخر من نظام مراقبة الأصول الميدانية. إضافة ميليلتر 650 من عموم-الكريات البيضاء إلى كل أنبوب وتدور أسفل الخلايا (300 غرام x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة). تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 150 ميليلتر من الثقافة المتوسطة (RPMI1640 + FCS 10%). احتضان عند 37 درجة مئوية (عادة على 45 دقيقة).
  2. بلطف من دوامة الخلايا (10 s 1,000 لفة في الدقيقة) وإضافة 1.5 مل بارافورمالدهيد (1.5 ٪) خلال الدوامة إصلاح الخلايا. إيقاف التثبيت عن طريق إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني + 1% جيش صرب البوسنة. بيليه الخلايا (300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واستثارة بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني + 1% جيش صرب البوسنة بعد حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  3. بيليه (300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + 1% جيش صرب البوسنة صابونين 0.1% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بيرميبيليزي الخلايا (لوحة 96، حسنا، على شكل U).
  4. تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 1% 0.1% صابونين بالطرد المركزي (300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وريسوسبيند بيليه الخلية في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 1% 0.1% صابونين التي تحتوي على الأجسام المضادة المسمى فلوروفوري أو مركبات (CD3-بي-تكسريد (01:30)، Phalloidin-AF647 (1:150)، و DAPI (1:3، 000)).
  5. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة في الظلام ل 30 دقيقة أغسل الخلايا 3 مرات بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني + 1% جيش صرب البوسنة صابونين 0.1%. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. Re-ريسوسبيند الخلايا في 60 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للتصوير التدفق الخلوي.

4-صورة اقتناء استخدام Cytometer تدفق

ملاحظة: وتستند الصورة اقتناء البيانات وإجراء التحليل التالي التصوير التدفق الخلوي باستخدام برامج مثل إيماجيستريم (IS100)، الإلهام والأفكار. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام البرامج الأخرى سيتوميتيرس وتحليل تدفق.

  1. فتح تحليل البرمجيات على جهاز الكمبيوتر متصلاً بتدفق سيتوميتير وانقر على "تهيئة فلويديكس" من القائمة أداة التصوير. تطبيق الخرز على المنفذ الصحيح عند مطالبتك بالقيام بذلك.
  2. تحميل القالب الافتراضي من القائمة ملف، وانقر فوق تشغيل/الإعداد. اختر الخرز من القائمة المنسدلة عرض.
  3. ضبط إضاءة ساطعة الحقل بالنقر فوق "تعيين كثافة" إذا كانت القيمة المشار إليها أدناه 200.
  4. تشغيل المعايرة وإجراء الاختبار في علامة التبويب مساعدة بالنقر فوق "بدء تشغيل كافة".
  5. انقر فوق مسح/لوك/تحميل وتطبيق النماذج في المنفذ الأيسر عند مطالبتك بالقيام بذلك. بعد تحميل الخلايا في سيتوميتير التدفق، افتح "المصنف الخلية" وقم بضبط القيم كما يلي: ذروة شدتها الحد الأعلى في 1,022 لكل قناة وذروة شدتها أقل من الحد الأدنى في 50 للقناة 2 (DAPI) وقناة 5 (CD3-Pe-تكسر)، منطقة الحد الأدنى في 50 ل قناة 1 (الجانب مبعثر)، والحد الأعلى في 1,500.
  6. تغيير قوة الليزر الإثارة إلى 405 نانومتر (15 ميغاواط)، 488 نانومتر (200 ميغاواط)، و 647 شمال البحر الأبيض المتوسط (90 ميغاواط) في علامة التبويب إعداد.
  7. تبديل القائمة المنسدلة عرض بين الخلايا والخرز لتقييم التعديلات السلطة خلية مصنف والليزر.
    ملاحظة: تأكد من أن كافة الخلايا والخلايا الأزواج هي العثور على "عرض الخلية" وأن كتل الخلايا والحطام، والصور مع مشبعة بكسل موجودة في "رأي الحطام" عن طريق تغيير المصنفات الخلية و/أو سلطات الليزر الإثارة.
  8. تعريف اسم العينة وحجم الصور للحصول على (15,000 – 25000 لعينات) و 500 لضوابط التعويض في علامة التبويب الإعداد انقر فوق تشغيل/الإعداد لبدء اكتساب.

5-بيانات التحليل

  1. نقل ملفات الصور raw (.rif) لتحليل بيانات الكمبيوتر وفتح برنامج التحليل.
  2. إنتاج مصفوفة تعويض اتباع التعليمات من القائمة المنسدلة التعويض. حفظ مصفوفة التعويض ك comp_Date.ctm.
  3. فتح ملف صورة raw عينة (.rif) وتطبيق comp_Date.ctm في الإطار الذي يظهر لإنتاج ملفات الصور تعويض (.cif) وملف تحليل البيانات الافتراضي (.daf).
  4. قم بفتح ملف الصورة تعويض. تحويل الصور إلى صيغة اللون وضبط جداول البحث للحصول على أفضل ألوان مرئية في شريط "خصائص معرض الصور". الحصول على صورة RGB المدمجة باستخدام علامة التبويب مركب من شريط "خصائص معرض الصور".
  5. فتح إدارة قناع من القائمة المنسدلة التحليل. إنشاء أقنعة لتعريف المشبك المناعية، وخلايا T كما يلي:
    1. حدد قناع تي خلية: "(التعبئة (Threshold_Ch05، 60)." حدد قناع وادي: "Valley(Ch02,3)." حدد قناع المشبك تي خلية: "قناع تي خلية وادي (M02، Ch02، 3)."
  6. فتح إدارة ميزة من القائمة المنسدلة التحليل. حساب الميزات التالية:
    1. بالنسبة لمجموع التعبير CD3 في خلايا تي، حدد "Intensity_T-cells_Ch5." بالنسبة للمبلغ الإجمالي من أكتين و في الخلايا T، حدد "Intensity_T-cells_Ch6." بالنسبة للتعبير CD3 في المشبك محصنة، حدد "synapse_Ch5 Intensity_T-خلية". مقدار واكتين في المشبك محصنة، حدد "synapse_Ch6 Intensity_T-خلية".
    2. لحساب مساحة تي خلية، حدد "Area_T-الخلايا." لحساب مساحة المشبك المناعية تي خلية، حدد "Area_T-خلية المشبك."
  7. تحديد واكتين وإثراء CD3 في المشبك محصنة باستخدام المعادلة في إدارة ميزة:
    Equation
  8. تطبيق الاستراتيجية التالية النابضة باستخدام الرسوم البيانية ومؤامرات دوت من ناحية التحليل (لمزيد من التفاصيل، انظر المراجع 17 و 19):
    1. تجاهل الخلايا خارج نطاق التركيز بالتآمر "RMS_M2_Ch2 التدرج" في الرسم بياني؛ تعيين العتبة في 15.
    2. مؤامرة محكمة أمن الدولة مقابل كثافة CD3 في مؤامرة نقطة. تعيين منفذ على الأحداث الإيجابية CD3.
    3. مؤامرة "نسبة الارتفاع إلى العرض" M02 (DAPI وصمة عار) مقابل منطقة M02 (Dapi وصمة عار). بوابة على نوع تي خلية وخلية الأزواج تبعاً لذلك. تصحيح للأزواج خلية صحيح باستخدام منطقة القناع المشبك، كما هو موضح سابقا17،19.
    4. تحديد مقدار أكتين و في نوع خلايا T وخلايا تي تي-خلية/الجيش الشعبي الكونغولي من الأزواج ونسبة F-أكتين في المشبك محصنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هدفا رئيسيا للأسلوب الموصوفة هنا هو التقدير الكمي لإثراء البروتين (مثل، واكتين) في المشبك محصنة بين بديلة خلايا تي في عموم أونبوريفيد-الكريات البيضاء المأخوذة من عينات الدم البشري منخفضة الحجم (1 مل) وناقلات الجنود المدرعة (راجي الخلايا). لقطة للشاشة في الشكل 1 يعطي لمحة عامة عن استراتيجية النابضة حيوية لهذا الأسلوب. يظهر معرض الصور على اليسار ومجال التحليل على اليمين (الشكل 1). يظهر معرض الصور بوابة "في التركيز". الصور يصور هي أساسا المحببة واثنين من الأزواج تي-خلية/آسيا والمحيط الهادئ. واو-أكتين و CD3 هي أثري في عدد الخلايا الزوجين 30272. استراتيجية النابضة تحديد مقدار الأزواج الخلية مع مثل هذا الإثراء يرد في مجال التحليل وهي المبينة في البروتوكول (راجع الخطوة 5، 8) أو في أي مكان آخر،من1719. يعرض آخر الأرض دوت في مجال تحليل مقدار (نسبة البروتين) CD3 (المحور السيني) والمحور (ص) أكتين و في المشبك محصنة. إذا كان أكثر من 30 في المائة البروتين الموجود داخل القناع المشبك محصنة، اعتبرت تخصيب البروتين في مأمن المشبك20. دوت المؤامرات التي تحتوي على الإثراء واستخدمت البيانات للحصول على نتيجة نهائية نموذجية (الشكل 2A). الصور التي على اليسار يظهر الصور عينة من يصرف تي-خلية/آسيا والمحيط الهادئ، مع كميات قليلة من CD3 وواو-أكتين في المشبك المناعية، بينما على اليمين، يصور يصرف تي-خلية/الجيش الشعبي الكونغولي مع تخصيب قوية CD3 وواو-أكتين. مقدار CD3 على المشبك المناعي (نسبة البروتين) المرسومة على المحور س، ومقدار واكتين في المشبك مأمن المرسومة على المحور ص. النسبة المئوية في البوابة يمثل مقدار تي الخلايا التي تحتوي على إثراء CD3 وواو-أكتين في المشبك محصنة ضد حضور سوبيرانتيجين. في غياب سوبيرانتيجين، أظهر 15% الخلايا T إثراء في المشبك محصنة من CD3 وواو-أكتين. كمية الخلايا زادت بنسبة 29% حضور superantigen. ويرد تحديد كمي واحد لتخصيب CD3 (الشكل 2) أو تخصيب واكتين (الشكل 2) في وجود وعدم وجود سوبيرانتيجين. تظهر هذه النتائج أنه، في غياب سوبيرانتيجين، 3.5 ± 18.3 في المائة، وفي حضور سوبيرانتيجين، كانت المتراكمة ± 34.3 4.0% من إجمالي المبلغ واكتين في الخلايا في المشبك محصنة. من المثير للاهتمام، كان هناك بالفعل تراكم CD3 في الغياب سوبيرانتيجين (16.6 ± 2.1 في المائة من إجمالي المبلغ CD3)، الذي ارتفع بإضافة سوبيرانتيجين (24.6 ± 3.0% من إجمالي المبلغ CD3). يسمح هذا الأسلوب بالتحديد الكمي لمقدار البروتين تراكمت في المشبك محصنة بين خلايا تي وناقلات الجنود المدرعة.

Figure 1
رقم 1: استراتيجية لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المناعي في الكريات البيض عموم الأعمال التحضيرية النابضة. هذا الرقم يظهر لقطة لشاشة من البرمجيات ويحتوي على سير عمل تحليل كامل للتقييم لإثراء CD3 والاكتين و في المشبك المناعي خلايا تي مترافق بناقلات الجنود المدرعة حضور سيب. يتم عرض الصور في معرض الصور على اليسار (Ch2 = DAPI؛ Ch5 = CD3-بيتشر؛ CH6 = AF647 فالويدين؛ ودمج = الصورة المجمعة التي تحتوي على Ch2 و Ch5 و Ch6). ويوفر البرنامج شريط أدوات عرض صورة لضبط جداول البحث وعرض القناع، ووضع اللون/تدرج الرمادي. يظهر الجزء الأيسر من الصورة في مجال تحليل وشريط أدوات التحليل. مجال تحليل يحتوي على رسوم بيانية ودوت المؤامرات كما يلي: 1) الرسم البياني للبحث عن الخلايا في التركيز وفقا للميزة RMS التدرج لتلطيخ DAPI. 2) النابضة في خلايا تي وفقا للتعبير عن CD3 (Intensity_MC_Ch05، المحور السيني) والشخصية مبعثر الجانب (Intensity_MC_Ch01، المحور ص). 3) جاتينج على الأزواج تي-خلية/APC المحتملة وفقا لنسبة العرض إلى الارتفاع DAPI وصمة عار (ratio_M02 جانبا، والمحور ص) والشخصية مبعثر الجانب (Intensity_MC_Ch01، المحور س). 4) النابضة على الأزواج تي-خلية/APC صحيحاً وفقا لمنطقة القناع المشبك (المحور السيني) ومنطقة وصمة عار CD3 المحور (ص). 5) النابضة في نهايات مأمن ناضجة تعرف بتخصيب (> 30% من البروتين في الواجهة) من CD3 (المحور السيني) والمحور (ص) أكتين و في المشبك محصنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التصوير بيانات التدفق الخلوي في إثراء CD3 وواو-أكتين في المشبك محصنة. مؤامرات (A) النقطة في المركز إظهار النسبة مئوية CD3 (المحور السيني) والمحور (ص) أكتين و في المشبك محصنة. T-خلية/APC يرتبط مع المشبك مأمن ناضجة في الغياب (الجزء العلوي) أو يصور وجود سيب (الجزء السفلي). الصور على إظهار الأيسر تي-خلية/APC الأزواج بدرجة منخفضة من إثراء CD3 وواو-أكتين، بينما عرض الصور على الحق الزوجين تي-خلية/APC بدرجة عالية من الإثراء CD3 وواو-أكتين (المشبك مأمن ناضجة). شريط المقياس = 10 ميكرون (أسفل اليسار). والنتيجة هي الممثل لثلاث تجارب مستقلة. (ب-ج) يعني CD3 (ب) أو تخصيب واكتين (ج) في المشبك محصنة في وجود أو عدم وجود سيب يظهر كنسبة البروتين (n = 3؛ سراج الدين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمكين سير العمل المقدمة هنا التحديد الكمي للمناعة نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية (السابقين فيفو) وناقلات الجنود المدرعة. جدير بالذكر أن تفكيك كرات الدم الحمراء عموم الكريات البيضاء استخدمت كمصادر تي خلية، مما يجعل خطوات تنقية تي خلية يمكن الاستغناء عنها. خط خلية سرطان الغدد الليمفاوية الخلية ب راجي بمثابة بديل ناقلات الجنود المدرعة. هذا يحمل مزايا كبيرة، نظراً لأنها تتيح المقارنات بين المتبرعين بالدم الجانب تي خلية من المشبك محصنة. علاوة على ذلك، وحدات تحكم المجال Dc ذاتي تتوفر يكاد مباشرة من الدم البشري. إنتاج الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (مودكس) تستغرق عدة أيام، مما يجعل التطبيق للدراسات السريرية الصعبة. ومع ذلك، يمكن تطبيقها التصوير التدفق الخلوي وتحليل الاستراتيجية المعروضة هنا على ناقلات الجنود المدرعة (مثل، ترانسديفيرينتياتيد العَدلات)20. وعلاوة على ذلك، فإنه اتضح أنه يمكن تقييم المشبك محصنة بين خلايا CD4 T والسابقين فيفو DCs9 أو خلايا ب21 للفئران باستخدام التصوير التدفق الخلوي. وهكذا، يمكن توسيع نطاق هذا الأسلوب لتقييم الدالة APC بالإضافة إلى جانب تي خلية المشبك محصنة.

الخطوات الأكثر أهمية لهذه المنهجية هي الاختلاط بعموم-الكريات البيضاء وناقلات الجنود المدرعة في كمية صغيرة وأداء الاستراتيجية الصحيحة النابضة باستبعاد أحداث إيجابية كاذبة في الوقت نفسه التقليل إلى أدنى حد من الخسائر في نهايات مأمن صحيح. بينما يصف لنا قياس تراكم CD3 وواو-أكتين، هذا الأسلوب لا يقتصر على هذه البروتينات ويمكن توسيعها للمستقبلات السطحية الأخرى، مثل الوكيل المحلي-117،19. وعلاوة على ذلك، ستتيح إضافة المسمى فلوروفوري الأجسام المضادة لتحديد تي خلية فرعية (مثل، CD4، CD8، CD45RA، أو تشيموكيني مستقبلات) لاستكشاف طبيعة الخلايا T عرض النمط الظاهري المناعي المشبك معينة. الأهم من ذلك، انخفاض كمية الدم اللازمة لمثل هذا تحليل (الحد الأقصى: 1 مل). بينما الجيل الأول من التصوير تدفق سيتوميتيرس، كما استخدمت هنا (IS100)، معدل اكتساب صورة من الخلايا حوالي 100/s، الجيل الثالث من تصوير تدفق سيتوميتيرس (البورصةMKII) يسمح الصورة الحصول على معدلات أعلى بكثير (تصل إلى الخلايا 2,000/s استخدام هدفا 40 x). وهكذا، سير العمل الفعلي، من الرسم الدم لتحليل البيانات، ويتطلب فترة زمنية قصيرة إلى حد كبير (أي، يوم واحد). خاصة، بينما يستند تحليل الصورة المعروضة على التصوير التدفق الخلوي، يمكن تطبيق خلية إعداد وتنظيم دورات تعريفية لنقاط الاشتباك العصبي المناعي (أي الجزء الأول من سير العمل) إلى آخر تقنيات التصوير22.

وعلى النقيض من التدفق الخلوي، تدفق التصوير دوت الخلوي-الحصول على قطع تحتوي على معلومات حول التعريب البروتين بالإضافة إلى البيانات التعبير البروتين. قوة واحدة من التصوير التدفق الخلوي أنه يمكن تقييم الخلايا (أو خلية الأزواج) من أي بوابة مختارة بالعين؛ ويمكن تعديل حدود بوابة تبعاً لذلك، ببساطة بالنقر فوق النقاط وتفقد الصورة المقابلة. في تجاربنا، وجدنا أن تخصيب البروتين 30% قيمة موثوقة للنظر الزوجين خلية كل منها كوجود بروتين اهتمام أثري. حالما يتم تعيين غيتس أخيرا، ميزات استراتيجية النابضة ويتم حفظها في ملف منفصل (.ast) ويمكن تطبيقها على كل عينة التالية لضمان إجراء تقييم غير متحيز.

نقاط الضعف في التصوير التدفق الخلوي يتم القيد في القرار (0.5 ميكرومتر استخدام هدفا 40 x) والحقيقة أن الطائرة التركيز واحد فقط يمكن تحليلها. ولذلك، هذا الأسلوب غير مناسب لتحليل هيكل غرامة المشبك المناعي وحدوث ميكروكلوستيرس14. لتحليل هذه الجوانب المتعلقة بالهندسة المعمارية المشبك محصنة، المناوب التقنيات، مثل [كنفوكل]، TIRF، أو مجهرية فائقة القرار، هناك حاجة. قوة التصوير التدفق الخلوي هو كمية الصور التي يمكن اكتسابها من كل عينة (حتى 25,000). جدير بالذكر أن كل صورة مجزأة، مما يعني أن خرج الخلفية، وعادة ما يكون هناك خلية واحدة فقط الانفرادي أو زوجين خلية كل صورة. هذه الخصائص للتصوير التدفق الخلوي أساسا للتحليل الآلي على مستوى خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، تسمح كمية عالية من الخلايا التي يتم تحليل كل عينة لتحديد موثوق بها من الأحداث النادرة (أي الفئات السكانية الفرعية أو الأزواج الخلية بتواتر أقل من 1%). الأهم من ذلك، يمكن تطبيق سير العمل المقدمة هنا لدراسة تشكيل المشبك محصنة في السابقين فيفو خلايا تي في عموم-الكريات البيضاء من المرضى الذين يعانون من الأمراض المرتبطة بالمناعة (مثل اضطرابات نقص المناعة الأولية، ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

العمل الذي كان يموله مجلس البحوث الألمانية (DFG) مع منح لا SFB-938-M و SA 393/3-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
>Multifuge 3 SR Heraeus
RPMI 1640 LifeTechnologies #11875085 500 mL
FCS Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube Falcon #352054 5 mL
Kulturflasche Thermo Scientific #178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8662
Bovine Serum Albumin Roth #8076.3
Saponin Sigma S7900
Paraformaldehyde Sigma Aldrich #16005
FACS Wash Saponin PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB Sarstedt 72.699.002 0.5 mL
Speed Bead Amnis #400041
Minishaker MS1 IKA Works  MS1
Mikrotiterplatte Greiner Bio One #650101 96U
Enterotoxin SEB Sigma Aldrich S4881
DAPI Sigma Aldrich D9542 1:3000
CD3-PeTxR Invitrogen MHCD0317 1:30
Phalloidin-AF647 Molecular Probes A22287 1:150
IS100 Amnis Imaging flow cytometer
IDEAS Amnis Software
INSPIRE Amnis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Tags

المشبك محصنة ضد الإصابة، العدد 143، وعلم المناعة، cytometer تدفق، إييماجينج التدفق الخلوي، خلايا تي، cytoskeleton أكتين، وجهاز المناعة البشري، والتكيف
تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wabnitz, G., Kirchgessner, H.,… More

Wabnitz, G., Kirchgessner, H., Samstag, Y. Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e55345, doi:10.3791/55345 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter